Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van Arthrobacter Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert

Het algemene doel van deze procedure is om arthrobacterbacteriefasen van bodemmonsters te isoleren met behulp van een verrijkingsprotocol. Dit wordt bereikt door eerst bodemmonsters te verzamelen en levensvatbare faagdeeltjes te isoleren van besmettende bodemmicro-organismen. De tweede stap is het infecteren van gasthef arthrobacterbacteriecellen met de geïsoleerde faagdeeltjes.

Vervolgens worden geïnfecteerde bacteriecellen geplaatst op boorplaten om fagen te identificeren zoals blijkt uit plaque-vorming. De laatste stap is het zuiveren van gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerde plaques met behulp van de streakplate-methode. Uiteindelijk is deze verrijkingstechniek geoptimaliseerd voor de relatief eenvoudige isolatie van arthrobacterfagen van arthrobacter-soorten KY 3 9 0 1.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande verrijkingsmethoden is de toevoeging van een fijn gefilterd bodemmonster aan een pure cultuur van gasthefbacteriën om de groei van concurrerende bacteriën te voorkomen. Hoewel deze methode effectief is gebleken voor de isolatie van arthrobacterfagen, zou het toepasbaar moeten zijn voor de isolatie van fagen van andere bacteriegastheer. We kregen het idee voor deze methode toen we hoorden dat andere onderzoekers moeite hadden met het vinden van arthrobacterfagen.

Met traditionele verrijkingstechnieken. Mijn studenten zullen de technieken demonstreren die worden gebruikt om met succes arthrobacterfagen te isoleren. Arthrobactercellen worden gekweekt uit kolonies die zijn uitgestreep op een LB-boorplaat, geïncubeerd bij 30 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen.

Gebruik een steriele lus om een kolonie te plukken en deze toe te voegen aan 50 milliliter lb-bouillon. In een bezwaarde cultuur, incubeer de flacon in een schuddende incubator bij 225 RPM bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 24 uur. Om exponentiële of vroege stationaire fase cellen te verkrijgen voor fageninfectie-experimenten.

Bewaak de toestand van bacteriegroei nauwlettend om te voorkomen dat cellen het midden tot late stationaire groei bereiken. De ideale OD 600 voor fagenisolatie is tussen 0,5 en 0,7. Aangezien bacteriën in het arthrobacter-genus gebruikelijke bodembacteriën zijn, kunnen zij en de fagen die ze infecteren in de meeste soorten grond worden gevonden.

Verzamel 200 tot 400 gram grond van de gewenste locatie. Voeg minimaal 400 milliliter fagenbuffer toe aan de grond in een groot genoeg bekertje zodat minimaal 200 milliliter fagenbuffer in de supernatant is en kan worden geëxtraheerd, gemengd door voorzichtig te roeren of te zwiepen tot de grond gesuspendeerd is en laat het grondsediment typisch gedurende 30 minuten bezinken. Vervolgens, verwijder grondsedimentresten door de grondextract door een filterpapier te laten passeren door vacuümfiltratie.

Voeg vier gram LB-poeder toe aan 200 milliliter van het gefilterde grondextract en meng tot een 2% oplossing. Laat de oplossing door een 0,22 micron filter passeren door vacuümfiltratie om een steriele filtrate te verkrijgen. Indien mogelijk, ga onmiddellijk door naar de volgende stap.

Niettemin, indien nodig, kunnen de gefilterde monsters gedurende maximaal een week worden bewaard bij vier graden Celsius voordat verder wordt gegaan. Echter, het aantal levensvatbare faagdeeltjes zal worden verminderd door als septische technieken meerdere 50 milliliter porties van het filtergesteriliseerde LB-grondextractmengsel in afzonderlijke 250 milliliter gescheiden te verdelen. Gesteriliseerde schud-, bezwaarde kweekflacons voeg steriele 2,0 molare calciumchloride-oplossing toe aan de gewenste eindconcentraties.

Aangezien verschillende arthrobacterfagen optimaal groeien onder verschillende calciumchloride-omstandigheden, begin deze procedure door een tot 2,5 milliliter late exponentiële of vroege stationaire fase bacteriecultuur toe te voegen aan elk van de flessen met filtergesteriliseerde LB-grondextractmengsel. Als de OD 600 van de cultuur 0,5 tot 0,7 is, gebruik één milliliter. Als de OD 600 hoger is dan 0,7, gebruik 2,5 milliliter.

Schud de flessen bij 250 RPM bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 24 uur in een schuddende incubator. Na de 24 uur durende incubatieperiode, verwijder de verrijkingsflessen uit de schuddende incubator. Verdun de verrijkingsmonsters tienvoudig in fagenbuffer.

Stel kweekbuisjes op met 0,5 milliliter late exponentiële of vroege stationaire fase bacteriecultuur. Voeg verschillende hoeveelheden toe van vijf microliter tot 500 microliter van de verdunde verrijkingscultuur aan de kweekbuisjes.

Voeg calciumchloride toe aan de kweekbuisjes om een ​​eindconcentratie in vijf milliliter gelijk te maken aan de concentratie in de oorspronkelijke verrijkingsfles. Gebruik een reeks verschillende calciumchlorideconcentraties om voor veel fagen te selecteren met verschillende calciumchloride-afhankelijkheden. Voeg 4,5 milliliter LB topauger toe aan elk kweekbuisje, en giet het mengsel op een LB augerplaat.

Zwiep voorzichtig om gelijkmatig over de plaat te verdelen en laat de topauger gedurende ongeveer 15 minuten stollen. Draai de platen om en incubeer ze bij 30 graden Celsius gedurende 24 tot 48 uur. Varieer de incubatietijden om te optimaliseren voor de fagen die aanwezig zijn na een 24-uurs incubatie. Controleer de platen op plaque-vorming.

De meeste geïsoleerde fagen komen van platen die zijn geïncubeerd bij 30 graden Celsius bij een calciumchlorideconcentratie van één tot 2,5 millimolair na een 24-uurs incubatieperiode. De zuivering van gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerde plaques is het meest uitdagende deel van deze procedure. Technisch vaardigheid is vereist om de plaques voorzichtig over de augerplaat te verspreiden om een ​​uniforme streakplaat te produceren. Steriliseer een houten stick door het door een vlam te halen en het te laten afkoelen.

Raak kortstondig een plaque met de steriele houten stick en wrijf de stick in de zachte beweging op de augerplaat zoals getoond. Herha