Name: Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van Arthrobacter Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Leer een geoptimaliseerde verrijkingsmethode voor het isoleren van Arthrobacter-bacteriofagen uit bodemmonsters. Dit protocol biedt snelle, reproduceerbare resultaten voor fage-isolatie en -amplificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering voor de ontwikkeling van dit protocol is verstrekt door de Southeastern Pennsylvania Consortium voor het hoger onderwijs en de Cabrini College Science Department. Aanvullende financiering en ondersteuning kwam van Arcadia University en Immaculata University. Wij danken vooral Dr. Karen Snetselaar in het St. Joseph Universiteit voor vriendelijk het nemen van de elektronenmicroscopische beelden van onze geïsoleerde fagen. Aanvullende steun werd verleend door het Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Fagen Jagers Voortschrijdende Genomics en Evolutionaire Science programma (SEA-fagen).

1. Bereiding van Arthobacter Cellen voor Phage Isolatie <ul><li> Cultuur Arthrobacter sp. KY3901 kolonies uitgestreken op Luria Bertaini (LB) agar plaat geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Kies een kolonie en een steriele lus toe te voegen aan 250 ml LB-bouillon in een baffled cultuur kolf en geïncubeerd in een incubator schudden bij 225 rpm bij 30 ° C. </li><li> Laat ongeveer 24 uur van de groei van de laat-exponentiële / vroeg-stationaire cellen voor faaginfectie experimenten te verkrijgen. Toezicht houden op de toestand van de bacteriële groei nauw aan cellen voorkomen dat het midden tot de late stationaire groei staat. OPMERKING: Celgroei moet bestaan ​​uit een optische dichtheid OD 600 van 0,5-.0.7 de faag isolatie- en zuiveringswerkwijzen / stappen hieronder beschreven. </li></ul> 2. Het verzamelen van Fagen van bodemmonsters <ol><li> Verzamel 200-400 g grond van gewenste locatie. Let op: Omdat de bacteriën in de Arthrobacter geslacht zijn gemeenschappelijke bodembacteriën zij en de fagen die hen infecteren kan worden gevonden in en zijn alomtegenwoordig in de meeste grondsoorten. </li><li> Voeg minstens 400 ml faag buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)] om de bodem en meng in een voldoende grote kolf zodat ten minste 200 ml PB is in het supernatant en kan worden geëxtraheerd. </li><li> Meng door zachtjes te roeren of zwenken totdat de bodem is opgehangen en laat de bodem neerslag bezinken, meestal 30 min. </li><li> Voorbij de &quot;bodem extract&quot; door filtreerpapier door de zwaartekracht filtratie om bodemsedimenten vuil te verwijderen. </li><li> Voeg LB poeder en meng tot een oplossing van 2% (4 g LB poeder in 200 ml grond extract) te maken. </li><li> Laat de oplossing door een filter van 0,22 pm door vacuümfiltratie om een ​​steriele filtraat te verkrijgen. Indien mogelijk, verder op om onmiddellijk stap 2.7. Indien nodig, opslag gefilterd monsters bij 4 ° C gedurende maximaal een week voor procedure echter het aantal levensvatbare faagdeeltjesworden verminderd. </li><li> Portie meerdere porties van 50 ml de filter gesteriliseerde LB / bodem extract mengsel in de individuele 250 ml gesteriliseerd schudden verbijsterd kweekflessen behulp van aseptische technieken. Voeg steriele 2,0 M CaCl2-oplossing om de uiteindelijke gewenste concentraties (0-50 mM) aangezien verschillende Arthrobacter fagen groeien optimaal onder verschillende CaCl2 voorwaarden. OPMERKING: We zien dat de meerderheid van de Arthrobacter fagen die door ons zijn binnen het bereik van 1 mM-2,5 mM CaCl2. Echter, een aantal van de geïsoleerde fagen groeide door ons exclusief op 0 mM CaCl2 .of bij zeer hoge CaCl2 concentraties. Ga onmiddellijk naar stap 3.1. </li></ol> 3. Fagen Isolatie <ol><li> Voeg 1 tot 2,5 ml late exponentiële / vroege stationaire fase bacteriekweek aan elk van de kolven. Voor een OD 600 0,5-0,7, gebruik 1 ml van de cellen. Voor een OD 600 lager dan een OD van 0,7 gebruiken 2.5 mlcellen. OPMERKING: Cellen in exponentiële groeifase leveren doorgaans meer fagen en hogere titers dan cellen in stationaire groeifase. </li><li> Schudflessen bij 250 rpm bij 30 ° C gedurende ongeveer 24 uur in een schudincubator. </li><li> Na een 24 uur incubatietijd verwijderen verrijking flesjes uit de schudincubator en verdun de verrijking monsters tienvoudige in faag buffer. </li><li> Stel cultuur buizen met 0,5 ml van laat-exponentiële / vroege stationaire fase bacteriekweek en voeg verschillende hoeveelheden verrijking kweek (5 ui tot 500 ui van een 10 -1 verdunning in PB) aan de kweek buizen. OPMERKING: Het is raadzaam om een ​​breed scala van concentraties te testen, aangezien elk grondmonster genereert verschillende faagtiters na verrijking. </li><li> Voeg CaCl2 cultuur buizen tot een uiteindelijke concentratie van de aanwezige concentratie in het oorspronkelijke verrijking kolf maken. Gebruik een reeks verschillende CaCl2 concentraties selecteren voor vele fagen wi variërende CaCl2 afhankelijkheden. LET OP: De meeste fagen wordt geïsoleerd binnen de CaCl2 scala van 1-2,5 mM maar er zijn fagen geïsoleerd meest optimaal overal 0-50 mM CaCl2 concentraties. Hierdoor is het het beste om een reeks van CaCl2 concentraties controleren om het aantal unieke geïsoleerde fagen Arthrobacter maximaliseren. </li><li> Meng 4,5 ml LB top agar in de cultuur buis en giet het mengsel op een LB agar plaat. Roer voorzichtig te verspreiden over de plaat gelijkmatig en zorgen voor top agar stollen voor ongeveer 15 min. OPMERKING: topagar kunnen worden bereid in grote series (250 ml) en extra topagar kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur en opnieuw gebruikt voor daaropvolgende experimenten minstens twee weken. Hoewel er verschillende formules gebruikt om de top agar, maken we top afstrijken met 7 g / L van agar gemengd met LB. Plaats top agar in een 60 ° C waterbad voor het vloeibare toestand behouden in de loop van een experiment. </li><li> Omkeren tHij plaat en incubeer bij de gewenste temperatuur (temperatuur 30 ° C) O / N tot 48 uur. Variëren deze voorwaarden te optimaliseren voor de huidige fagen. De meeste fagen geïsoleerd vandaan platen geïncubeerd bij 30 ° C bij 1-2,5 mM CaCl2-concentratie na 24 uur incubatie periode. </li></ol> 4. Fagen Zuivering <ol><li> Na 24 uur incubatie cheque voor de vorming van tandplak op platen. Verder incubatie tot 72 uur indien geen plaques zijn evident of om te bepalen of aanvullende plaques verschijnen. Indien nodig, opslag platen met vermeende plaques voor tot een week bij 4 ° C alvorens verder te gaan. LET OP: Het is niet ongewoon om een ​​verscheidenheid van verschillende plaque morfologie vinden op een bord. Het vinden plaques na 3 dagen incubatie mogelijk maar zeldzaam. </li><li> Zuiveren gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerd plaques met behulp van de streak plaque methode. Raak een plaquette met een steriele houten stok. Streak de plaque door het uitvoeren van een houten stok door een vlam, allowinG de stok kort afkoelen en vervolgens wrijven de stok op de agar plaat in de zachte beweging zoals weergegeven in figuur 1. Herhaal deze met een schone stick voor elke doorgang. </li><li> U kunt ook gebruik maken van de traditionele plaque titer test om individuele faagplaques isoleren. De plaque assay titer vereist het gebruik van reagentia zoals LB agar en LB top agar en materialen zoals petrischalen voor faag plaque isolatie. We zijn zeer succesvol verlopen met behulp van de streak plaque methode, maar het is technisch eenvoudiger om individuele plaques met behulp van de plaque titer test te isoleren. </li><li> Zodra de LB agar plaat minstens driemaal strepen, markeer het gebied met de laagste concentratie van putatieve faagdeeltjes en voorzichtig 0,5 ml Arthrobacter en 4.5 ml van gesmolten LB top agar (die dezelfde concentratie van calciumchloride als het werkstukoppervlak ) en laat het gelijkmatig over de plaat gespreid. </li><li> Omkeren en incubeer plaat O / N. Herhaal de streak plaquetechniek minstens drie iteraties te zorgen voor een soort zuivere faag wordt geïsoleerd. WINKEL platen bij 4 ° C gedurende maximaal een week nodig tussen stroken zonder significant verlies van levensvatbaarheid faag. </li><li> Zodra de gewenste plaques zijn geteeld en op de laatste streak plaat geïsoleerd, raakt een goed geïsoleerd plaquette met een micropipet tip en opnieuw op te schorten in 100 ul PB. Serieel verdunnen deze 10 0 oplossing uit naar de 10 -8 verdunning door het passeren van 20 ul van het monster in 180 ul van verse PB. </li><li> Voeg 10 ul van elke verdunning tot 0,5 ml gekweekt Arthrobacter in een kweekbuis 5 tot 10 minuten bij kamertemperatuur en de plaat door het mengen van de geïnfecteerde bacteriën met 4,5 ml van gesmolten LB top agar die dezelfde concentratie van CaCl 2 gebruikt om de faag te isoleren van de oorspronkelijke bodemmonster. Bewaar alle verdunningen gemaakt bij 4 ° C tot de volgende dag. </li><li> Bepaal de faag seriële verdunning nodig om een ​​web patroon met behulp van de traditionele plaque titer zo makenzeg eens. Het doel van de plaque assay titer is de faag titer nodig om een ​​web patroon plaat verkrijgen bepalen. Identificeer een web patroon plaat als grotendeels verstoken van bacteriën maar die resten van bacteriën die nog niet gelyseerd door fagen. Voeg 5 ml van de laat-exponentiële / vroeg-stationaire Arthro- cultuur tot een steriele 50 ml kolf. <ol><li> Voeg 100 ul van de verdunning (dat gaf Webpatroon de Arthrobacter cultuur) in cultuur kolf en laat de fagen om de bacteriën infecteren gedurende 5 tot 10 min bij kamertemperatuur. Meng met gesmolten LB top agar die dezelfde concentratie van CaCl 2 zoals gebruikt aanvankelijk identificeren faag en plaat 5 ml van dit mengsel op 10 vers LB-platen. Laten stollen en incubeer omgekeerde platen bij 30 ° C. </li></ol></li><li> De volgende dag, overstromen Webpatroon platen met 5 ml PB en opslaan O / N bij 4 ° C of 4 uur bij KT. </li><li> Filter de faaglysaat door een 0,22 pm spuitfilteren bewaar bij 4 ° C. Met deze laatste faagvoorraad aanvullende experimenten zoals elektronen microscopie foto van faagdeeltjes faag genomisch DNA isolatie van DNA restrictie-enzymanalyse en genomische sequencing met behulp van standaardprocedures. Voor de lange termijn opslag van de faag voorraad, voeg een gelijke hoeveelheid van de faaglysaat om steriele glycerol in kleine flesjes voor voorraad archivering bij -80 ° C. OPMERKING: Voor degenen die niet ervaren met deze faag technieken, een geweldige bron is de online toegankelijk www.phagesdb.org website. </li></ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Ondanks vele eerdere pogingen om fagen kunnen infecteren Arthrobacter gastheren isoleren, we hadden weinig succes met behulp van standaard verrijking procedures. De algemene werkwijze van bacteriële verrijking ontwikkeld en aangepast door van Twest en Kropinski 10 fagen verrijken van milieumonsters blijft de basis voor de meeste verrijking procedures. Bewijs uit eerdere studies blijkt dat methoden van directe plating detecteerbaar plaques op stammen van Arthrobacter hebben geproduceerd, zij ...

De alomtegenwoordigheid van Arthrobacter soorten in de bodem omgevingen en biedt een groot aantal en de diversiteit van fagen kunnen worden geïsoleerd van deze soort van gastheer bacteriën. Bacteriële leden van de familie Acintobacteriaceae zijn het meest bekend om hun katabole paden van vernederende recalcitrante verbindingen zoals atrazine en diverse andere pesticiden en herbiciden 1,2,3. Hoewel de meeste onderzoek is gedaan met behulp van het milieu stammen van Arthrobacter, wordt klinische isolaten van deze soort gevonden in bloed, urine, ogen, en vele andere menselijke bronnen die allemaal van fylogenetische heterogeniteit 4. Hoewel er een vrij uitgebreid lichaam van het onderzoek op Arthrobacter bacteriën, slechts een paar studies rapporteren over de fagen kunnen infecteren leden van deze diverse geslacht. Interessant is echter, werk eerder gedaan op Arthrobacter fagen hand gelegd aan een aantal belangrijke verschillende onderwerpen, zoals de typering van de bodem &lt;em&gt; Arthrobacter species 5, industrieel gebruik met het oog op het verminderen van schadelijke schuim in actief slib zuiveringsinstallaties 6, en werk benadrukken locatiespecifieke recombinatie en integrase genen 7. Verschillende verrijkingstechniek protocollen zijn gebruikt voor het genereren zuivere faag isolaten Arthrobacter species. Vroege procedures omvatten incubaties van de bodem met toegevoegde giftige stoffen zoals nicotine zouten voor een periode van meer dan één jaar 8 die aanleiding geven tot fagen staat alleen infecteren A. globiformis. Studies gedaan met behulp van de bodem gepercoleerd met labiele organische bleek detecteerbare fagen te produceren via plaque assay technieken, met weglating van lange incubatietijd 8. Interessant is echter, een techniek lijkt rechtstreeks plateren werd in het verleden gebruikt die tot verschillende fagen terwijl nog steeds een opmerkelijk lage slagingspercentage van de onderzoekers 5, citeren eerdere studies met lage succespercentages <sup&gt; 8. Kortom, de isolatietechnieken die in het verleden waren opmerkelijk voor die weinig werkzaamheid in de praktijk, ondanks het geslacht Arthrobacter die de meest voorkomende aerobe bodem isoleren natuur 4,9, Van Twest en Kropinski 10 verrijking onderhavige werkwijzen voor het isoleren van fagen van water en grond aangepast van eerdere technieken gebruikt om het milieu bacteriële isolaten maar deze verrijking technieken verrijken inefficiënt gebleken in het isoleren van Arthrobacter fagen. Het doel van de hier beschreven werkwijze verlangde &quot;proof of concept&quot; dat de vroege verrijking werkwijzen kunnen worden aangepast om consistent en effectief te isoleren Arthrobacter fagen overwinnen voorafgaande technische uitdagingen van fagen isoleren van deze bacteriële genus.

<table><tbody><tr><td>LB Broth poeder</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Het is het beste om deze in bulk te bestellen.</td></tr><tr><td>Gegranuleerde Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Het is het beste om deze in bulk te bestellen.</td></tr><tr><td>0,22 um spuitfilters</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0,22 um Büchner filters</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Meer dan 50 ml vloeistof kan worden verkregen door voorzichtig de ontvangstbuis te verwisselen.</td></tr><tr><td>Eppendorf buisjes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipetten individueel</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buizen</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipetten individueel</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipetten individueel</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman kwalitatief filterpapier</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

een geoptimaliseerd verrijking techniek voor de isolatie van<em&gt; arthrobacter</em&gt; bacteriophage soorten uit soil sample isoleert

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

De isolatie van bacteriofagen uit milieumonsters wordt al tientallen jaren uitgevoerd volgens principes die zijn vastgesteld door pioniers op het gebied van microbiologie. De isolatie van fagen die Arthrobacter-gastheercellen infecteren, is beperkt geweest, misschien vanwege de lage succesgraad van veel eerdere isolatietechnieken, wat heeft geleid tot een ondervertegenwoordigde groep van Arthrobacter-fagen die beschikbaar zijn voor onderzoek. De hier beschreven verrijkingstechniek gebruikt, in tegenstelling tot vele andere, een gefilterd extract vrij van besmettelijke bacteriën als basis voor de groei van indicatorbacteriën, specifiek Arthrobactersp. KY3901. Door eerst de bodembacteriën te verwijderen, worden de doelfaggen niet gehinderd door concurrentie met inheemse bodembacteriën die aanwezig zijn in de oorspronkelijke bodemmonsters. Deze verrijkingsmethode heeft geresulteerd in tientallen unieke fagen uit verschillende bodemtypes en heeft zelfs verschillende soorten fagen geproduceerd uit hetzelfde verrijkte bodemmonster. Het gebruik van deze procedure kan worden uitgebreid naar de meeste voedselrijke aërobe media voor de isolatie van fagen in een grote diversiteit van interessante gastheerbacteriën.

Om de reproduceerbaarheid van de verbeterde verrijking techniek voor Arthrobacter fagen te tonen, werden 30 verschillende grondmonsters gebruikt op verschillende tijdstippen en locaties tijdens de lente en zomer van 2014. Van deze 30 grondmonsters unieke Arthrobacter fagen werden verkregen uit 22 van verzamelde grondmonsters met behulp van deze verrijking procedure. De standaard verrijkingsprocedure leverde unieke fagen van 3 van dezelfde bodemmonsters. De verrijking monsters kunnen een faag titer hoog...

We presenteren een verrijkingsprotocol voor de isolatie van bacteriofagen die bacteriën in het Arthrobacter geslacht infecteren. Dit verrijkingsprotocol produceert snelle en reproduceerbare resultaten voor de isolatie en amplificatie van Arthrobacter fagen uit bodemisolaties.

Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Het algemene doel van deze procedure is om arthrobacter-bacteriofagen uit bodemmonsters te isoleren met behulp van een verrijkingsprotocol. Dit wordt bereikt door eerst bodemmonsters te verzamelen en levensvatbare faagdeeltjes te isoleren van contaminerende bodemmicro-organismen. De tweede stap is het infecteren van gastheer-arthrobacter-bacteriële cellen met de geïsoleerde faagdeeltjes.Vervolgens worden de geïnfecteerde bacteriële cellen op agarplaten uitgeplaat om fagen te identificeren, wat zichtbaar wordt door de vorming van plaques. De laatste stap is het zuiveren van de gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerde plaques met behulp van de uitstrijkplaatmethode. Uiteindelijk is deze verrijkingstechniek geoptimaliseerd voor de relatief eenvoudige isolatie van arthrobacter-fagen uit arthrobacter-soort KY 3 9 0 1.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande verrijkingsmethoden is de toevoeging van een fijn gefiltreerd bodemmonster aan een zuivere cultuur van gastheerbacteriën om de groei van concurrerende bacteriën te voorkomen. Hoewel deze methode effectief is gebleken voor de isolatie van arthrobacter-fagen, zou deze ook toepasbaar moeten zijn voor de isolatie van fagen uit andere bacteriële gastheren. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we vernamen dat andere onderzoekers moeite hadden met het vinden van arthrobacter-fagen.Met traditionele verrijkingstechnieken. Mijn studenten zullen de technieken demonstreren die worden gebruikt om arthrobacter-fagen succesvol te isoleren. Arthrobacter-cellen worden gekweekt uit kolonies die zijn uitgestreken op een LB-agarplaat en gedurende twee tot drie dagen zijn geïncubeerd bij 30 °C.Gebruik een steriele lus om een kolonie op te pikken en voeg deze toe aan 50 milliliters lb-bouillon. Incubeer de kolf in een schudincubator bij 225 RPM en 30 graden Celsius gedurende ongeveer 24 uur in een gekolefleks met schotten. Dit dient om cellen in de exponentiële fase of vroege stationaire fase te verkrijgen voor faaginfectie-experimenten.Houd de staat van de bacteriële groei nauwgezet in de gaten om te voorkomen dat de cellen in de midden tot late stationaire groeifase terechtkomen. De ideale OD 600 voor fage-isolatie ligt tussen 0,5 en 0,7. Aangezien bacteriën uit het geslacht arthrobacter veelvoorkomende bodembacteriën zijn, kunnen zij en de fagen die hen infecteren in de meeste bodemtypes worden gevonden.Verzamel 200 tot 400 gram grond van de gewenste locatie. Voeg ten minste 400 milliliters faagbuffer toe aan de grond in bekerglazen die groot genoeg zijn zodat er ten minste 200 milliliters faagbuffer in het supernatant aanwezig is en kan worden geëxtraheerd door voorzichtig te roeren of te zwenken tot de grond is gesuspendeerd, en laat het bodemsediment doorgaans 30 minuten bezinken. Verwijder vervolgens het bodemsediment door het grondextract via vacuümfiltratie door filterpapier te leiden.Voeg vier gram LB-poeder toe aan 200 milliliters van het gefiltreerde bodemextract en meng dit om een 2%-oplossing te maken. Leid de oplossing via vacuümfiltratie door een 0,22 micron filter om een steriel filtraat te verkrijgen. Ga indien mogelijk onmiddellijk over naar de volgende stap.Indien nodig kunnen de gefiltererde monsters echter tot een week bij vier graden Celsius worden bewaard voordat men verder gaat. Het aantal levensvatbare fage-deeltjes zal echter afnemen. Verdeel met aseptische technieken aliquoten van 50 milliliter van het gefilterde en gesteriliseerde LB-bodemextractmengsel over individuele gesteriliseerde schudkolven van 250 milliliter met baffles. Voeg steriele 2,0 molar calciumchloride-oplossing toe tot de gewenste eindconcentraties zijn bereikt.Aangezien verschillende arthrobacter-fagen optimaal groeien onder verschillende calciumchloride-omstandigheden, begint u deze procedure door één tot 2,5 milliliters van een bacteriële cultuur in de late exponentiële of vroege stationaire fase toe te voegen aan elk van de kolven die het filtergesteriliseerde LB-bodemextractmengsel bevatten. Als de OD 600 van de cultuur 0,5 tot 0,7 is, gebruik dan één milliliter. Als de OD 600 hoger is dan 0,7, gebruik dan 2,5 milliliters.Schud de kolven gedurende ongeveer 24 uur bij 250 RPM en 30 °C in een schudincubator. Verwijder na de incubatieperiode van 24 uur de verrijkingskolven uit de schudincubator. Verdun de verrijkingsmonsters tienvoudig in fagebuffer.Bereid kweekbuisjes voor met 0,5 milliliters bacteriële cultuur in de late exponentiële of vroege stationaire fase. Voeg diverse hoeveelheden, variërend van 5 microliters tot 500 microliters, van de verdunde verrijkingscultuur toe aan de kweekbuisjes.Voeg calciumchloride toe aan de kweekbuisjes om een eindconcentratie in vijf milliliter te verkrijgen die gelijk is aan de concentratie in de oorspronkelijke verrijkingskolf. Gebruik een reeks verschillende calciumchlorideconcentraties om te selecteren voor meerdere fagen met variërende calciumchloride-afhankelijkheden. Voeg 4,5 milliliter LB top agar toe aan elk kweekbuisje en giet het mengsel op een LB agarplaat.Draai voorzichtig om de vloeistof gelijkmatig over de plaat te verdelen en laat de bovenste agar ongeveer 15 minuten stollen. Keer de platen om en incubeer deze bij 30 °C gedurende een periode van één nacht tot 48 uur. Varieer de incubatietijden om deze te optimaliseren voor de aanwezige fagen; controleer na een incubatie van 24 uur op plaquevorming op de platen.De meeste geïsoleerde fagen zijn afkomstig van platen die gedurende 24 uur zijn geïncubeerd bij 30 °C met een calciumchlorideconcentratie van 1 tot 2,5 mM; het zuiveren van de gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerde plaques met behulp van een houten stokje is het meest uitdagende deel van deze procedure. Technische expertise is vereist om de plaques voorzichtig over de agarplaat uit te strijken om een uniforme uitstrijkplaat te verkrijgen. Steriliseer een houten stokje door het door een vlam te halen en het vervolgens te laten afkoelen.Raak kort een plaque aan met het steriele houten stokje en wrijf het stokje met een zachte beweging, zoals getoond, over de augerplaat. Herhaal dit met een schoon stokje voor elke passage. Zodra de LB augerplaat ten minste drie keer is uitgestreken, markeer dan het gebied met de laagste concentratie van vermeende fage-deeltjes.Breng voorzichtig 0,5 milliliter arthrobacter en 4,5 milliliter gesmolten LB top agar aan op het gemarkeerde gebied en zorg dat dit gelijkmatig over de plaat verspreid wordt. Laat de top agar ten minste een uur uitharden; zodra de plaat is gestold, wordt deze omgekeerd en overnacht geïncubeerd. Herhaal de streak plaque-techniek voor ten minste drie iteraties om er zeker van te zijn dat een zuivere faagspecies is geïsoleerd.Platen kunnen, indien nodig tussen de uitstrijkjes, tot een week bij vier graden Celsius worden bewaard zonder significant verlies van fagenviabiliteit. Zodra de gewenste plaques op de laatste uitstrijkplaat zijn gegroeid en geïsoleerd, raakt men één goed geïsoleerde plaque aan met de punt van een micropipetpunt en resuspendeert men deze in 100 microliters fagenbuffer. Verdun deze oplossing seriële tot een verdunning van 10⁻⁸ door 20 microliters van het monster over te brengen in 180 microliters verse fagenbuffer. Voeg 10 microliters van elke verdunning toe aan 0,5 milliliters gegroeide arthrobacter in een cultuurbuis gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur.Plat vervolgens uit door de geïnfecteerde bacteriën te mengen met 4,5 milliliters gesmolten LB top agar die dezelfde concentratie calciumchloride bevat als gebruikt is om de faag uit het oorspronkelijke bodemmonster te isoleren. Incubeer de platen een nacht. Bewaar alle verdunningen bij vier graden Celsius tot de volgende dag.Bepaal de benodigde verdunningsgraad van de fage-cerealien om een webpatroon te creëren met behulp van de traditionele plaque-titerassay. Identificeer een plaat met een webpatroon als een plaat die grotendeels vrij is van bacteriën, maar nog wel resten bevat van bacteriën die nog niet door fagen zijn aangetast. Voeg vijf milliliter van een arthrobacter-cultuur in de late exponentiële of vroege stationaire fase toe aan een steriele kweekfles van 50 milliliter.Voeg 100 µL van de verdunning die een webpatroon gaf toe aan de arthrobacter-cultuur en laat de fagen de bacteriële cellen gedurende vijf tot 10 minuten infecteren. Voeg bij kamertemperatuur gesmolten LB-topagar toe aan de kolf, met dezelfde concentratie calciumchloride als gebruikt bij de initiële identificatie van de fagenplaat. Verdeel vijf milliliter van dit mengsel over elk van de 10 verse LB-platen.Laat de bovenste agarlaag stollen, keer de platen om en incubeer deze de volgende dag gedurende de nacht bij 30 °C; overstroom de platen met het webpatroon vervolgens met vijf milliliter fagenbuffer per plaat en bewaar deze gedurende de nacht bij 4 °C. Filtreer het fagenlysaat door een spuitfilter van 0,22 micron. Bewaar deze uiteindelijke fagenstock bij 4 °C voor langdurige bewaring.Voeg een gelijke hoeveelheid van het fage-lysaat toe aan steriele glycerol in kleine vials voor archivering van de voorraad bij -80 °C. In de verrijkingsprocedure die in deze video wordt gedemonstreerd, is de plaque-streekmethode gebruikt om zuivere fagepopulaties te isoleren na de initiële verrijking en uitplating op LB-agar. De getoonde resultaten zijn representatief voor de isolatie van plaques voor fage DI bij kamertemperatuur, 30 °C en 37 °C. De rode cirkels op twee van de platen omcirkelen duidelijk geïsoleerde plaques. Fage Dylan produceert soortgelijke plaques bij drie verschillende temperaturen.Als alternatief kan een traditionele standaard plaque-titeranalyse worden gebruikt om een puur faag-isolaat te verkrijgen. Deze analyse werd hier gebruikt om empirisch de faagtitergetallen en het aantal plaque-vormende eenheden te bepalen dat nodig is om een webpatroon op een plaat te vormen. Een reeks seriële verdunningen voor faag banana wordt getoond, met een voorbeeld van hoe een goed webpatroon eruit zou moeten zien.Dit zijn elektronenmicrografische beelden van 20 arthrobacter-faagen die zijn geïsoleerd met behulp van de verrijkingstechniek. Van de momenteel geïsoleerde 25 faagen zijn er 23 siphovirussen met vrij lange staarten. Twee van de geïsoleerde faagen zijn myovirussen met kopdiameters die ongeveer even lang zijn als hun staarten.Zodra de techniek onder de knie is, zou de verrijkingsplating het succesvol isoleren van arthrobacter-fagen uit diverse bodemmonsters mogelijk moeten maken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fagen worden gezuiverd met de streak-paint methode vanuit een bodemmonster uit het milieu.

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Source: Watson, D. C., et.al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the isolation and concentration of extracellular vesicles (EVs) derived from the outer membrane of genetically engineered bacteria. The process involves culturing the bacteria to release EVs, followed by sequential centrifugation and filtration steps to remove cells and debris. Finally, ultrafiltration is used to...

Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria

Source: Cross, T., et al., An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the preparation of a bacterial culture for bacteriophage production. It covers the steps of inoculating a soil bacterium into a baffled flask, promoting uniform growth through aeration and shaking, and monitoring cell density using optical density measurements. Once the culture reaches the optimal growth phase,...

Preparing a Soil Bacterial Culture for Bacteriophage Infection

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

Een nieuwe semi-automatische hybride DNA-extractiemethode voor gebruik met monsters uit de biologische pluimveehouderij werd ontwikkeld en vertoonde verbeteringen ten opzichte van een gebruikelijke mechanische en enzymatische extractiemethode in termen van de kwantitatieve en kwalitatieve schattingen van de totale bacteriegemeenschappen.

Een hybride DNA-extractie methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van Bacteriële Gemeenschappen van pluimveeproductie Monsters

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

De isolatie van zware metaalresistente microben uit geothermische bronnen is een hot topic voor de ontwikkeling van bioremediatie en milieumonitoring biosystemen. Deze studie biedt een methodologische benadering voor het isoleren en identificeren van zware metaaltolerante bacteriën uit warmwaterbronnen.

Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken

Hier presenteren we een eenvoudige techniek om antimicrobiële resistentie in het milieu (AMR) te beoordelen door het aandeel extracellulair DNA met een laag moleculair gewicht te verbeteren. Voorafgaande behandeling met 20%-30% PEG en 1,2 M NaCl maakt detectie van zowel genomische als horizontaal overgedragen AMR-genen mogelijk. Het protocol leent zich voor een kit-vrij proces met extra optimalisatie.

Verbeterde extractie van DNA met een laag moleculair gewicht uit afvalwater voor uitgebreide beoordeling van antimicrobiële resistentie 

Hier beschrijven we methoden voor bemonstering uit de eufotische zones van mariene en zoetwaterecosystemen om cyanofagen (en hun gastheren) te isoleren en post-bemonsteringsprocessen die afzonderlijke genotypen verrijken en de dynamiek van virus-gastheerinteractie karakteriseren.

Milieubemonstering van fotosynthetische microben en hun virussen: van veld tot laboratorium

Leer een geoptimaliseerde verrijkingsmethode voor het isoleren van Arthrobacter-bacteriofagen uit bodemmonsters. Dit protocol biedt snelle, reproduceerbare resultaten voor fage-isolatie en -amplificatie.

Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van

Meer video's verkennen