Name: Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Leer de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode-techniek voor het meten van extracellulaire ionfluxen in levende cellen en weefsels. Deze niet-invasieve methode biedt nauwkeurige inzichten in iondynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation-subsidie MCB-0951199, en gedeeltelijk door de NIH-subsidie EY01910, California Institute of Regenerative Medicine-subsidies RB1-01417 en door de Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)-subsidie SFRH/BD/87256/2012.

1. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Voorbereiding <ol><li> Bereiding van ion-selectieve micro-elektrode <ol><li> Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker. Opmerking: Dit geeft tips 3-4 micrometer in diameter. Kleinere tips hebben een hogere weerstand die microelectrodes gevoeliger zijn voor elektronische ruis produceert en is ook geassocieerd met een langzamere reactie op een verandering in ionenconcentratie. Nuttige informatie kan worden gevonden in de krant gepubliceerd door Smith et al. 26. </li><li> Silaniseren de elektroden op het binnenoppervlak hydrofoob hulpmiddel voor retentie van de lipofiele ionofoor cocktail maken. Plaats de micro-elektroden in een metalen rek en warmte O / N in een oven bij&gt; 100 ° C te drogen. Het rek is een metalen plaat met 2 mm diameter gaten geboord deel van de doorgang. Plaats de elektroden in de gaten tip naar boven met een 250 ml glass beker over hen. </li><li> In de ochtend, zet de oven uit en terwijl het dragen van isolerende handschoenen, verwijder voorzichtig de metalen rek met de elektroden en de beker op zijn plaats. Sluit de ovendeur om de warmte vast te houden. </li><li> Draag latex of nitril, laboratoriumjas en oogbescherming. Met een plastic Pasteur pipet, plaats een druppel silanisering oplossing die ik aan de basis van elke elektrode (houd de beker op zijn plaats, gebruik de stromende lip voor toegang pipet). De silanisatie oplossing wordt verdampt door de hete plaat en silanizes de binnenkant van de elektroden. Gebruik een chemische afzuigkap zuurkast voor deze fase. Plaats het rek / beker / elektroden terug in de hete oven gedurende enkele uren om alle resterende silaneren oplossing te verdampen. Opmerking: Om veiligheidsredenen, niet de oven niet weer aan te zetten. Plaats een etiket op de oven aangeeft dat mag niet worden ingeschakeld als het schadelijke en brandbare damp kunnen bevatten. </li><li> Na afkoeling, slaan de micro-elektroden in een micro-elektrode opslag jar insiDe een glas exsiccator met 400 g droogmiddel. Micro-elektroden kan dus worden opgeslagen voor vele weken. Noot: Een alternatieve silanisatie werkwijze is beschreven in Smith et al 26. </li><li> Back vullen van de micro-elektrode met 50 tot 100 gl (een lengte van ongeveer 1 cm) van een oplossing bevattende 100 mM van het ion te meten (zie tabel 1 en figuur 1B). Gebruik een wegwerp plastic Pasteur pipet warmte trok in een bunsenbrander tot een boete filament. Spoel de pipet in dH 2 O daarna om verstopping te voorkomen. Opmerking: Als alternatief pas de ionenconcentratie van de opvulling oplossing om de concentratie van ionen passen in de uitwendige oplossing 27. </li><li> Let op de micro-elektrode onder een dissectiemicroscoop om de afwezigheid van luchtbellen te verzekeren. <ol><li> Indien luchtbellen aanwezig zijn kraan de micro-elektrode lichtjes met een nagel terwijl de elektrode verticaal (tip naar beneden) en / of druk op de bubbles uit de tip door het toepassen van tegendruk behulp van een injectiespuit gemodificeerd met een siliconen buis vervangen van de naald. </li></ol></li><li> Tip vullen van de micro-elektrode met 15-20 nl (een lengte van 30-50 pm), van ion-specifieke ionofoor cocktail (zie tabel 1). Plaats een kleine druppel ionofoor cocktail op de korte zijde van een microscoop dia. Let op de micro-elektrode tip onder een dissectie microscoop en bewegen in de richting van de microscoop dia totdat de micro-elektrode tip raakt de ionofoor cocktail voor slechts ongeveer een halve seconde. Teken de ionofoor cocktail in de micro-elektrode door capillaire druk. Opmerking: Vermijd een lange kolom van ionofoor cocktail als dit verhoogt de elektrische weerstand van de sonde waarop zij gevoelig zijn voor elektronische storing (ruis) kunnen maken en vertraagt ​​ook de responstijd. </li><li> Monteer de micro-elektrode in een rechte micro-elektrode houder met een gouden 1 mm male connector en AgCl (Ag +) draad (Figuur 1B). &lt;/ Li&gt; <li> Bevestig de micro-elektrode houder aan het hoofd podium gemonteerd op een drie-dimensionale computergestuurde elektronische micropositioner (figuur 1A). </li><li> Plaats de micro-elektrode tip in meetoplossing geschikt voor het monster te meten (fysiologisch zout, kweekmedium, etc.) zodat de micro-elektrode stabiliseren van een uur of twee, of zelfs gedurende de nacht. </li></ol></li><li> Bereiding van de referentie-elektrode <ol><li> Referentie-elektroden (figuur 1C) dezelfde capillairen als hierboven. Snijd de capillair met een diamant potlood in 5 cm lengte en vuur-gepolijst aan elk uiteinde voor 1-2 sec in een Bunsen vlam. </li><li> Vul deze elektroden met ~ 200 ul van een 3 M oplossing van NaCl, CH 3 CO 2 K (kaliumacetaat) of KCl met 2% agarose. Kies de oplossing afhankelijk van de ionen te meten (de referentie-elektrode niet de ionen gemeten bevat; zie Tabel 1). Mengenhet agarose en de oplossing en verhit tot bijna koken in een magnetron. Roer tot de agarose op te lossen (de oplossing gaat helder). </li><li> Bevestig de referentie-elektrode om een ​​plastic Pasteur pipet en trekken de hete oplossing in het capillair. </li><li> Laat de elektrode in koude 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K of KCl-oplossing en programmeer op deze 3 M oplossing in afgesloten buizen voor gebruik. Gooi alle referentie-elektroden met luchtbellen. </li><li> Monteer de referentie-elektrode in een rechte micro-elektrode houder (pre-gevuld met 3 M-oplossing) met een AgCl (Ag +) pellet binnen en een gouden 2 mm mannelijke connector (figuur 1C) en bevestig de elektrode en houder op een handmatige micro-klepstandsteller gemonteerd op een magnetische standaard. </li></ol></li></ol> 2. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Calibration <ol><li> Het voorbereiden van het kalibreren van oplossingen die het ion van belang als in de referentie-oplossing; zie tabel 1 </strong&gt;. Omsluiten de concentratie die in de oplossing het monster in (bijvoorbeeld kweekmedia, fysiologische zoutoplossing). Dat wil zeggen, moet men ijkoplossing een lagere concentratie van ionen bevatten dan in de meetoplossing en één hoger. <ol><li> Gebruik bijvoorbeeld een zoutoplossing die 1 mM van K + bevat. Om deze concentratie beugel los KCl poeder in gedeïoniseerd water tot een concentratie van 10, 1 en 0,1 mM in seriële verdunningen. Gebruik deze kalibratie-oplossingen. Als alternatief gebruik van ten minste twee van deze oplossingen. </li></ol></li><li> Dompel de ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode in elke ijkoplossing en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software (zie tabel 1). </li><li> Omdat de software slaat de data (versterker output) als een txt-bestand, kopieert u de gegevens in een spreadsheet-bestand. Zet de micro-elektrode-uitgang (mV) tegen de logaritme vande molaire ionenconcentratie (Figuur 2A). </li><li> Breng een lineaire regressie en bereken de Nernst helling, te onderscheppen en R2 waarde. Accepteer de micro-elektrode als de Nernst helling is 58 ± 11 mV / decade voor monovalente ionen en 29 ± 11 mV / decade voor divalente ionen (voor kationen, de Nernst helling positief is, voor anionen is negatief). Bovendien moet goed microelectrodes een sterke lineaire correlatie (Figuur 2B R 2&gt; 0,9) heeft. Opmerking: De mV-uitgang van de versterker die hier gebruikt geeft mV lezing met een tienvoudige gewin. Waarden moeten worden gedeeld door een factor tien. </li><li> Met de lineaire regressie om de ruwe mV uitgang van de micro-elektrode converteren naar de eigenlijke ion concentratie (Figuur 2B). </li></ol> 3. Validatie van de Ion-selectieve micro-elektrode Technique <ol><li> De voorbereiding van een kunstmatige bron <ol><li> Kunstmatige source haarvaten zijn hetzelfde als haarvatenhierboven. Hitte trek de capillaire met behulp van een micro-elektrode trekker als in stap 1.1.1. </li><li> Backfill deze capillairen met 200 gl van een 1 M oplossing van NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O of pH 4 buffer. Kies de kunstmatige bron oplossing afhankelijk van de ionen te meten (zie tabel 1). Opmerking: Als alternatief, trek elektroden met grotere tip diameter (~ 20 urn) en tip-vullen met dezelfde oplossingen, maar met 0,5-1% agarose (agarose wordt voorkomen dat bulkstroom van de oplossing). </li><li> Monteer de kunstmatige bron capillair op een micromanipulator en onder te dompelen in de oplossing wordt gebruikt om de flux van de ionen in de monsters te meten. Laat de kunstmatige bron in de oplossing gedurende 30 min tot 1 h tot een stabiele gradiënt mogelijk. </li></ol></li><li> Validatie van de ion-selectieve micro-elektrode <ol><li> Dompel de ion-selectieve micro-elektrode ongeveer een centimeter vanaf de kunstmatige capillair bron in de oplossing gebruikt measuopnieuw de flux van ionen op de monsters en sluit het circuit met de referentie-elektrode als voorheen. Laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software gedurende 1 tot 2 minuten. Deze waarde correspondeert met de bufferwaarde (in de literatuur ook wel aangeduid als referentie, achtergrond of nulwaarde). </li><li> Verplaats de ion-selectieve micro-elektrode tot ongeveer 5 urn van de kunstmatige stralingsbron en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning met de software gedurende 1 tot 2 minuten. </li><li> Herhaal de bovenstaande procedure door het plaatsen van de ion selectieve micro-elektrode bij 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 en 1280 urn afstand van de kunstmatige stralingsbron capillair. </li><li> Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand. </li></ol></li><li> Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde. Neete: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert. Indien de kunstmatige stralingsbron bevat meer ionen van het soort gemeten dan de oplossing moet de concentratie hoger dichtbij de bron dan ver weg, het valideren van het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode te kunnen detecteren de richting van een ion flux (in casu efflux want een kunstmatige spoelbak met lager soortelijk ionenconcentratie dan meetmedium, moet instroom zijn). <ol><li> Bereken de ionenflux behulp Fick&#39;s wet van diffusie: J = c μ (dc / dx) waarbij c de ionenconcentratie in de oplossing (mol -3 cm), μ is de ionenmobiliteit (cm mol N -1 sec -1) en dc is de concentratie verschil over afstand dx (cm) (figuur 2C). Ion flux-gegevens worden gewoonlijk in pmol cm -2 s-1 Of -2 nmol cm -1 sec. Noot:.. Een alternatieve werkwijze ionenflux berekenen is beschreven door Smith et al 26 kunnen worden gebruikt. Belangrijke verschillen omvatten het gebruik van de diffusiecoëfficiënt in plaats van de ionenmobiliteit en aftrekken van de achtergrond ionenflux (ook spanningsdrift of correctiefactor) berekend uit metingen van ionenflux in zoutoplossing zonder monster. </li><li> Plot het gemiddelde van de ion fluxen van elke stap tegen de afstand tot de bron (Figuur 2D). Afgestapt van de bron, acht een exponentiële afname van de fluxwaarde valideren het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode verschillende magnitude van ionfluxen voelen. </li><li> Doe de kunstmatige bron validatie eenmaal voor elk specifiek ion bedoeld om de juiste richting en grootte metingen bevestigen met een grote signaal-n te registrerenoise ratio. Opmerking: Ion flux meting van de buffer, zonder samples geeft het achtergrondniveau of ruis. Typisch, buffer meting toont geen duidelijke fluctuatie van de ion concentratie leidt tot zeer kleine flux die variabele richtingen weergeeft. </li></ol></li></ol> 4. Voorbereiding van de meetkamer Opmerking: Voordat experimenten, beschouwen het monster moet worden gemeten en hoe het monster moet worden gemonteerd en geïmmobiliseerd voor micro-elektrode metingen. <ol><li> Voor Xenopus laevis oöcyten metingen snijd een 1 cm plein van een 800 um nylon mesh (Nitex mesh) en plak het in een plastic petrischaal (figuur 1E). </li></ol> 5. Ion Flux Measurement <ol><li> Meet de ionenconcentratie in de buffer gebruikt voor de metingen aan het monster op dezelfde wijze als de ijkoplossing. X. laevis eicellen nodig Mark&#39;s Modified Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 en 5 MgCl HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl en HEPES in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie (mM) te bereiken. Stel de pH van de buffer 7,5 behulp NaOH. </li><li> Het monster in de meetkamer en breng de ion-selectieve micro-elektrode nabij het ​​monster (ongeveer 10 urn afstand) met het micropositioner in de sluitstand van de micro-elektrode (figuur 3A) te definiëren. </li><li> Start de lage frequentie (0,3 Hz) tocht (100 um) van de micro-elektrode tussen de gesloten positie en een positie verwijderd van het monster (afstand) met de speciale software. Zorg ervoor dat de beweging van de micro-elektrode loodrecht op het oppervlak van het monster. Opmerking: De excursie van de micro-elektrode kan worden ingesteld op de software. Grote excursie verhoogt de helling te lezen waardoor een eenvoudiger detectie van kleine stromen tijdens de meting, terwijl verlengt de sampling interval en vermindert de temporele resolutie. Zien <strong&gt; Figuur 3A een voorbeeld. </li><li> Start de opname met behulp van de software. De micro-elektrode pauzeert op elke positie en de elektrische potentiaal in mV wordt opgenomen op de computer. Verkrijgen metingen gedurende minstens 2 min, waardoor het signaal stabilisatie. Voor korte time-lapse experimenten, opnemen mogelijke variaties op de positie van belang zijn voor de hele tijd natuurlijk. </li><li> Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand. </li><li> Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde. Opmerking: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert. </li><li> Bereken de ionenflux behulp Fick&#39;s wet van diffusie als hiervoor (stap 3.3.1). </li><li> Herhaal de buffer meting voor het meten van een nieuw monster en herhaal de procedure van flux meting en berekening voor elke nieuwemonster. </li></ol> 6. Statistische analyse en presentatie van gegevens <ol><li> Test de onafhankelijke werking van de positie en / of van de tijd op ionfluxen onder controleconditie behulp van een ANCOVA model met gemengde effecten 28. Opmerking: Analyse van covariantie (ANCOVA) is een algemeen lineair model dat mengt regelmatige ANOVA en regressie doordat zowel categorische en continue te nemen als onafhankelijke variabelen. Bovendien, in aanwezigheid van gecorreleerde fouten veroorzaakt door herhaalde metingen per individu en eventuele geneste effecten, gemengde effecten modellen worden gebruikt om nauwkeurige schattingen van zowel vaste als random effecten te modelleren. </li><li> Bereken paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Student t-test tussen de groep niveaus met Bonferroni correctie voor meerdere testen 28. </li><li> Genereer boxplots om ion flux metingen samen te vatten op basis van positie en tijd. Omvat p waarden van de Student t paarsgewijze beschrevenhierboven (Figuur 3D) en vermeld significantie niveau van p-waarden als volgt: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0.001 29 </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De meest kritische stappen voor een succesvolle bepaling van extracellulair ion fluxen in vivo: het verminderen van het lawaai, de correcte fabricage van de ion-selectieve microelectrodes en referentie-elektrode, en de positionering van het monster en beide elektroden. Om de ruis te minimaliseren, dient het registratiesysteem in een geaarde (geaard) Faraday kooi voorkeur met metaal bedekte (trillingsisolatie) tafel die ook geaard. Bovendien moet de microscoop chassis worden geaard. ...

<html> Alle dierlijke cellen zijn omgeven door een lipide dubbellaag membraan dat het cytoplasma van de buitenomgeving gescheiden. De cel onderhoudt een elektrische membraanpotentiaal, negatieve binnen, door actief transport van ionen 1. De membraanpotentiaal is opgeslagen energiebron die de cel kan gebruiken om verschillende moleculaire apparaten werken in het membraan 2. Neuronen en andere exciteerbare cellen grote membraanpotentialen. Spoedig tot natriumkanalen stort de membraanpotentiaal (depolarisatie) en produceert de actiepotentiaal die loopt langs de lengte van het neuron 2 wordt getransporteerd. Naast deze snelle elektrische veranderingen, vele weefsels en organen te genereren en aanzienlijke langdurige elektrische potentialen te handhaven. Bijvoorbeeld, huid en hoornvlies epitheel genereren en trans-epitheliale potentialen en extracellulaire elektrische stroom te handhaven door gerichte pompen van ionen (voornamelijk natrium en chloride) 3. tent &quot;&gt; Hoewel metingen van endogeen extracellulair elektrische stroom met de trillende probe 4-6 en metingen van membraan of trans-epitheliale potentialen via de micro-elektrode systeem 7-10 laten meten van de elektrische parameters van celmembranen en epitheliale cellagen, ze geven geen vermelding van de ionensoort betrokken. Micro-elektroden met selectieve ionofoor kunt specifieke ion-concentratie in oplossing te meten. Ion gradiënten of flux gemeten kon worden met twee of meer elektroden op verschillende posities. Echter, zou de intrinsieke spanning drift van elke probe verschillend zijn, waardoor onnauwkeurige meting of detectie van een gradiënt die niet aanwezig was. Een enkele elektrode in &quot;self-referencing&quot; -modus waarbij het beweegt bij lage frequentie tussen twee punten lost dit probleem op. Nu is de ion flux kan worden gezien tegen de achtergrond van een relatief langzame en stabiele signaal drift (zie figuur 3B). </p&gt; De ion-gevoelige meetsysteem maakt gebruik van ion-selectieve self-verwijzingen microelectrodes om kleine extracellulaire stromen van ionen in de buurt van weefsels of enkele cellen op te sporen. Het systeem omvat een versterker die het signaal van de micro-elektrode en een micro-stappenmotor en bestuurder de beweging van de micro-elektrode besturingsprocessen. De ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode die de schakeling sluit zijn verbonden met de versterker via een headstage voorversterker (Figuur 1A). Computer software bepaalt de parameters van de micro-elektrode beweging (frequentie, afstand) en registreert ook de uitgang van de versterker. De stappenmotor regelt de micro-elektrode beweging via een driedimensionale micropositioner. Een laagfrequent trillen ion-selectieve micro-electrode werd eerst ontwikkeld in 1990 specifieke calciumflux 11 meten. Evenals calcium, commercieel toegankelijk ionofoor cocktails zijn nu beschikbaar voor MICR makenoelectrodes gevoelig voor natrium, chloride, kalium, waterstof, magnesium, nitraat, ammonium, fluoride, lithium of kwik. Kortom, het zichzelf verwijzende ion-selectieve micro-elektrode techniek converteert de activiteit van een specifiek ion in een oplossing in een elektrisch potentiaal, die kan worden gemeten door een voltmeter. De ionofoor cocktail is een mengbare vloeistof (biologisch, lipofiele) fase met ionenwisseling eigenschappen. De ionofoor selectief complexen (bindt) specifieke ionen reversibel en overbrengt tussen de waterige oplossing in de micro-elektrode (elektrolyt) en de waterige oplossing waarin het micro-elektrode is ondergedompeld (figuur 1D). Dit ion overdracht leidt tot een elektrochemisch evenwicht en een variatie van de elektrische potentiaal tussen de micro-elektrode en de referentie-elektrode wordt gemeten door de voltmeter. De spanning is evenredig met de logaritme van de specifieke ionen activiteit volgens de Nernst equation waardoor de berekening van de ionenconcentratie (figuur 2A en B). Momenteel verscheidene systemen kunnen meten ionenflux met een soortgelijk concept of principe. Bijvoorbeeld, de Scanning Ion-selectieve elektrode Technique (SIET) 12,13 of de micro-elektrode Ion Flux Schatting (MIFE) techniek ontwikkeld door Newman en Shabala 14-16 zijn commercieel verkrijgbaar en veel gebruikt door de onderzoeksgemeenschap om specifieke ion te bepalen fluxen die zich op het celmembraan en weefsel in een verscheidenheid van dieren, planten en enkele levende cel modellen. Ion-selectieve micro-elektroden werden gebruikt om waterstof, kalium en calcium flux tussen plantenwortels 17, chloride flux gemeten in ratten cerebrale arteriën 18 en pollen tubes 19, waterstofflux in skate retinale cellen 20, calciumflux in muizenbeenmerg 21 verschillende ion fluxen in schimmeldraden 22 en in rbij cornea 23 en tenslotte calciumflux in eencellige wondgenezing 12,24. Zie ook de volgende beoordeling voor gedetailleerde informatie over de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektroden 25. Het volgende artikel beschrijft in detail hoe te bereiden en het meten van endogene extracellulaire ion fluxen met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode techniek op enkele cel niveau uit te voeren.

<table><tbody><tr><td>IonAmp&nbsp;</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>versterker gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij &ldquo;XBL function matters&rdquo; (http://www.xuyue.org/) of bij &ldquo;YoungerUSA&rdquo; (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>software gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij &ldquo;XBL function matters&rdquo; (http://www.xuyue.org/) of bij &ldquo;YoungerUSA&rdquo; (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Headstage pre-amplifier</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, ontworpen door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij &ldquo;XBL function matters&rdquo; (http://www.xuyue.org/) of bij &ldquo;YoungerUSA&rdquo; (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>MicroStep Driver</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>none</td><td>drie MicroStep-drivers zijn vereist voor X, Y en Z-positionering; gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij &ldquo;XBL function matters&rdquo; (http://www.xuyue.org/) of bij &ldquo;YoungerUSA&rdquo; (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Manual micropositioner&nbsp;&nbsp;</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>Model KITE-R</td><td>Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Magnetic stand&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model M10</td><td>Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Vibration isolation table&nbsp;&nbsp;</td><td>Newport Inc.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Model VW-3036-OPT-023040</td><td>Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&deg;, slotted faces</td><td>Newport Inc.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Model 360-90</td><td>Assemblage van de driedimensionale micropositionner vereist ook drie elektrische rotatiemotoren voor X, Y, Z-besturing, MPH-1 montagearm met MCA-2 hoekverstelbare paal en verschillende Newport-connectoren en schroeven om op de vibratietafel te bevestigen</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td><td>Newport Inc.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>none</td></tr><tr><td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>none</td></tr><tr><td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&nbsp;</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>TW150-4</td><td>none</td></tr><tr><td>Electrode puller&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>&nbsp;PC-10</td><td>none</td></tr><tr><td>Metal rack</td><td>Made in-house</td><td>none</td><td>Metalen elektrodehouder gemaakt in huis door het boren van 2 mm brede gaten op een halve centimeter afstand in een rechthoekige basis van staal van 10 cm bij 15 cm</td></tr><tr><td>Oven</td><td>QL</td><td>Model 10 Lab Oven</td><td>none</td></tr><tr><td>Silanization solution I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>Gevaarlijk, hanteer zoals aanbevolen door de leverancier&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass Petri dish; Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>316060</td><td>none</td></tr><tr><td>Electrode/micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>E215</td><td>none</td></tr><tr><td>Glass dessicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-595E</td><td>Bevat Drierite-dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Plaats petroleumgelei op de afdichting om deze luchtdicht te maken.</td></tr><tr><td>Plastic Pasteur pipette&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597722</td><td>none</td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>S97329</td><td>none</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8902</td><td>none</td></tr><tr><td>Straight microelectrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>QSW-A15P</td><td>met een gouden 1 mm mannelijke connector en Ag/AgCl-draad</td></tr><tr><td>Straight microelectrode holder&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>met een AgCl(Ag+)pellet binnenin en een gouden 2 mm mannelijke connector&nbsp;</td></tr><tr><td>6 cm Petri dish</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>none</td></tr><tr><td>Nitex mesh</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>none</td></tr><tr><td>Glue; Loctite epoxy</td><td>VWR</td><td>500043-451</td><td>Meng lijm en verharder in gelijke delen in een plastic weegbootje en meng grondig. Zet snel maar laat 24 uur op RT staan voor volledige uitharding</td></tr><tr><td>Deionized water&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>none</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>none</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>none</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>none</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>none</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>none</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>none</td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>none</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>none</td></tr></tbody></table>

meting van de extracellulaire ion flux gebruik van de ion-selectieve zelf referencing micro-elektrode techniek

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cellen van dieren, planten en enkele cellen worden omsloten door een barrière genoemd celmembraan dat het cytoplasma van buitenaf scheidt. Cellagen zoals epithelia vormen een barrière die de binnenzijde scheidt van buitenaf of verschillende compartimenten van multicellulaire organismen. Een belangrijk kenmerk van deze barrières is het differentieel verdeling van de ionen door celmembranen en cellagen. Twee eigenschappen maken het mogelijk deze verdeling: 1) membranen en epithelia weer selectieve permeabiliteit voor specifieke ionen; 2) ionen worden vervoerd door middel van pompen door de celmembranen en cellagen. Deze eigenschappen spelen een cruciale rol in het behoud van het weefsel fysiologie en fungeren als het signaleren signalen na beschadiging, tijdens reparatie, of onder pathologische aandoening. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode maakt metingen van specifieke fluxen van ionen zoals calcium, kalium of natrium in enkele cel en weefsel niveau. De micro-elektrode bevat een ionofoor cocktail dieselectief permeabel is voor een specifiek ion. De interne vulling oplossing bevat een set concentratie van het ion van belang. De elektrische potentiaal van de micro-elektrode wordt bepaald door de externe concentratie van de ionen. Aangezien de ionenconcentratie varieert het potentieel van de micro-elektrode verandert als een functie van de log van de ion activiteit. Wanneer heen en weer bewogen buurt van een bron of sink van de ionen (bijvoorbeeld in een concentratiegradiënt vanwege ion flux) de micro-elektrode potentiaal schommelt de amplitude evenredig is met de ion flux / gradiënt. De versterker versterkt het micro-elektrode signaal en de uitgang wordt op de computer. De ionenflux kan dan berekend met de wet van Fick diffusie via de elektrodepotentiaal fluctuatie, de amplitude van micro-elektrode, en andere parameters zoals de specifieke ionenmobiliteit. In dit artikel beschrijven we in detail de methodologie om extracellulaire ion fluxen te meten met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode eend presenteren een aantal representatieve resultaten.

We hebben eerder aangetoond dat calcium influx verschijnt na enkele cel verwonding 24. Daarom hebben we gevraagd of andere ion fluxen optreden bij enkele cel verwonding. We gebruikten de X. laevis eicel, een gevestigde model voor enkele cel wondgenezing 30-34 en elektrofysiologische opname 24,35-39. Interessant kaliumionen zijn geconcentreerd binnen X. laevis oöcyten (ongeveer 110 mM), 40 dan in de extracellulaire oplossing gebruikt (in MMR 1x: 1 mM) suggeree...

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Het algemene doel van deze procedure is om extracellulaire ionenstromen in vivo te meten met behulp van de ionselectieve zelfreferentiële micro-elektrodetechniek. Dit wordt bereikt door eerst de ionselectieve en de referentie micro-elektroden te assembleren. De tweede stap bestaat uit het kalibreren en valideren van de ionselectieve zelfreferentiële micro-elektroden.Vervolgens worden de ionspecifieke fluxmetingen op het biologische monster uitgevoerd in de vorm van spanningsmetingen. Ten slotte wordt de spanningsmeting omgezet in ionenflux. Uiteindelijk maakt deze techniek een nauwkeurige, niet-invasieve meting mogelijk van specifieke extracellulaire ionenfluxen in levende cellen of weefsels.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over fysiologie of veroudering, evenals over regeneratie of pathologie. Zo maakt deze methode de identificatie van specifieke ionenstromen mogelijk, die biologische processen aansturen zoals weefselmorfogenese, groei of differentiatie. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Gim Ardi, postdoc in het laboratorium van Dr. Benjas. Plaats vóór de elektrodekalibratie een vooraf gevulde ionenselectieve elektrode in een micro-elektrodehouder die is uitgerust met een gouden mannelijke connector van één millimeter en een zilverdraad gecoat met zilverchloride.Bevestig vervolgens de houder van de micro-elektrode aan een elektronische micro-positioneer met drie assen die computergestuurd is. De ionselectieve elektrode zelf moet al de elektrolyt en de ion-fore-cocktailoplossing bevatten die relevant zijn voor de betreffende ionen. Zodra deze is gemonteerd, moet de elektrode worden ondergedompeld in een oplossing die één millimol kaliumchloride bevat.Monteer daarnaast de referentie-elektrode in een rechte micro-elektrodehouder die een drie molaire zoutoplossing in agar, een met zilverchloride gecoate zilverpellet en een goudkleurige mannelijke connector van twee millimeter voor de referentie-elektrode bevat. De keuze van de zoutoplossing is afhankelijk van de te meten ionensoort. Bevestig na het voorbereiden van de referentie-elektrode de elektrodehouder aan een handmatige micro-positioneer die vooraf is gemonteerd op een magnetische standaard.Zodra de elektrode is gemonteerd, moet deze worden ondergedompeld in een oplossing die één millimolar kaliumchloride bevat. Voordat u begint, dient u voor de opstelling van de ionselectieve elektrode een verdunningsreeks van elektrolytische kalibratiestandaarden te bereiden die de relevante ionen bevatten. Wanneer bijvoorbeeld kaliumkationen moeten worden gedetecteerd bij een fysiologische concentratie van ongeveer één millimolar, maakt u dan een reeks kaliumchloride-oplossingen over drie logaritmische eenheden bij 10, 1 en 0,1 millimolar.Dit maximaliseert het dynamische bereik van detectie dat voor de assay vereist is. Om de ionselectieve elektrode te kalibreren, begint u met het onderdompelen van zowel de ionselectieve als de referentie-elektroden in de minst geconcentreerde kalibratieoplossing, in dit geval 0,1 millimolair. Meet en noteer na een korte stabilisatieperiode van één tot drie minuten bij kamertemperatuur de steady-state spanning.Herhaal de spanningsmetingen voor de rest van de kalibratiestandaarden en zet de gemeten spanningen uit tegen het logaritme van de molaire ionconcentraties. Pas voor elke standaardoplossing lineaire regressie toe om de helling, het snijpunt en de R²-waarden van de kalibratiecurve te bepalen. Denk eraan om bij het berekenen van de helling de gemeten spanningen te delen door de totale versterking van de spanningsversterker.Om het meetprotocol te demonstriëren, zal de flux van kaliumionen uit een geperforeerde kikker-oöcyt worden gekarakteriseerd met behulp van een kaliumgevoelige micro-elektrode. Snijd voordat u begint met de opstelling van de ionselectieve elektrode een stuk van één centimeter uit een nylon gaas van 800 micron en plak dit op een plastic Petrischaal. Bereid daarnaast vooraf de gemodificeerde Ringer-oplossing van Mark voor met de volgende formulering: 100 millimolair natriumchloride, twee molaire kaliumchloride, twee millimolair calciumchloride, één millimolair magnesiumchloride en vijf millimolaire HEPES. Stel de pH van de buffer in op 7,5 met natriumhydroxide en voeg een hoeveelheid van de voltooide buffer toe aan de Petrischaal.Plaats de kikker-cyte, de ionselectieve elektrode en de referentie-elektrode voorzichtig in de Petrischaal. Perforeer vervolgens de cyte en bedien de micro-positioneer, zodanig dat de ionselectieve elektrode zich op ongeveer 10 microns afstand van het monster bevindt. Qua nomenclatuur zal de huidige afstand tussen het monster en de elektrode worden aangeduid als de nabije positie.Bedien vervolgens de micropositioneerder zodanig dat de ionselectieve elektrode periodiek beweegt van de nabije positie van 10 microns naar een verdere positie van 100 microns, en vervolgens terugkeert naar de nabije positie met een frequentie van 0,3 hertz, oftewel drie volledige cycli per 10 seconden. Verifieer tijdens de activering van de micropositioneerder of de beweging van de elektrode daadwerkelijk loodrecht staat op het gewonde tangentiaaloppervlak van de cel; activeer de software voor spanningsmeting en registratie. De micropositioneerder is geprogrammeerd om kort te pauzeren bij de nabije en verre posities terwijl de spanningsgegevens worden verzameld.Gegevens worden continu geregistreerd tijdens de wondgenezing van de oocyten, wat ongeveer 15 minuten duurt voor langere experimenten, zoals bij het observeren van een proces van meerdere dagen tijdens metingen van de regeneratie van de staart van opus-kikkervisjes waarbij metingen gedurende twee minuten op verschillende tijdspunten worden geregistreerd. Bijvoorbeeld na 1, 3, 6, 12 en 24 uur. Exporteer na voltooiing van het experiment de voltagegegevens als tekstbestand en kopieer de waarden naar een spreadsheet.Gebruik de eerder vastgestelde kalibratiecurve om de gemeten spanningswaarden om te zetten in de overeenkomstige ionconcentraties. Zet de geëxtrapoleerde ionconcentraties uit als functie van de afstand tot het biologische monster. Bereken tot slot de ionenstroom met behulp van de wet van Fick voor diffusie.Waarbij C de ionconcentratie in de oplossing is, MU de ionmobiliteit, en DC DX het concentratieverschil over afstand dx. Voorafgaand aan biologische experimenten kunnen de waarde van het NER-hellingintercept en de volledige kalibratiecurve voor de ionselectieve elektrode worden gevalideerd aan de hand van een kunstmatige iongradiënt, gegenereerd vanuit een een molaire ionbron geplaatst in een Petrischaal. Wanneer veranderingen in kaliumionconcentraties worden uitgezet op een afstand dicht bij of ver verwijderd van een wondplaats in annu.De gegevens suggereren dat er een massale kaliumflux plaatsvindt bij het begin van de cellulaire beschadiging; naarmate de wondgenezing vordert, neemt de kaliumflux geleidelijk af tot rustwaarden na 15 minuten, wanneer de wond volledig is genezen. Bovendien, wanneer de gemeten kaliumionconcentraties worden omgezet in ionflux, lijkt de plotselinge toename en de geleidelijke afname van de kaliumflux na beschadiging een statistisch significant effect te zijn in vergelijking met een intacte controle-oöcyt. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescente bio-elektrische labeling, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de kenmerken van intercellulaire en subcellulaire ionfluxen te beantwoorden.

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

In this video, embryonic kidney cell cultures expressing light-dependent ion channel proteins fused with a fluorescent reporter demonstrate the effect of light on ion movement. Whole-cell patch clamp is used to monitor the movement of ions.

Optogenetic Electrophysiology Recording of Cells with Light-Dependent Ion Channels

This video demonstrates how to characterize the extracellular space in a brain slice by using ion-selective and iontophoresis microelectrodes to measure and compare electrical signals. This process helps determine the space's volume fraction and degree of twisting.

Characterizing Extracellular Space in a Brain Slice Using Ion-Selective and Iontophoresis Microelectrodes

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na+/H+ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

We demonstreren de fabricage, kalibratie en eigenschappen van twee soorten ionen-selectieve micro-elektroden (dubbel-gerand en concentrisch) voor het meten van ionenconcentraties in hersenweefsel. Deze worden vervolgens gebruikt in de muis hippocampale plak voorbereiding om te laten zien dat exciterende activiteit zowel extracellulaire kalium- als natriumconcentraties verandert.

Dubbelloops en concentrische micro-elektroden voor het meten van extracellulaire Ion Signalen in hersenweefsel

Dit protocol beschrijft het gebruik van de Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde Malpighian (renale) tubuli van Drosophila melanogaster gemeten. Bovendien, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof, zodat berekening van transepitheliale ionenflux, wordt beschreven.

Gebruik van de Ramsay Assay Fluid Afscheiding en Ion Flux tarieven in de Meet<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian buisje

Dit artikel beschrijft hoe de ion-selectiviteit van channelrhodopsine wordt bepaald met elektrofysiologische whole-cell patch-clamp opnames met behulp van HEK293 cellen. Hier wordt de experimentele procedure voor het onderzoeken van chloride-selectiviteit van een anion-selectieve channelrhodopsine gedemonstreerd. De procedure is echter overdraagbaar naar andere channelrhodopsinen met een verschillende selectiviteit.

Whole-cell Patch-clamp opnames voor elektrofysiologische bepaling van de ion selectiviteit in channelrhodopsins

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Dit protocol schetst methodologieën achter de Ramsay-assay, ionselectieve micro-elektroden, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) en in vitro contractie-assays, toegepast om het uitscheidingssysteem van volwassen muggen te bestuderen, bestaande uit de Malpighian tubuli en hindgut, om gezamenlijk ionen- en vloeistofsecretiesnelheden, contractiele activiteit en transepitheliaal ionentransport te meten.

Het bestuderen van de activiteit van neuropeptiden en andere regulatoren van het uitscheidingssysteem in de volwassen mug

Leer de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode-techniek voor het meten van extracellulaire ionfluxen in levende cellen en weefsels. Deze niet-invasieve methode biedt nauwkeurige inzichten in iondynamica.

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Meer video's verkennen