Name: Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer hepatocyt-ablatie in zebrafish voor galweg-gedreven leverregeneratie met metronidazol. Deze methode maakt real-time analyse van leverherstel mogelijk via fluorescente beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Drs. Hukriede en Tsang voor de discussies. M.K. werd ondersteund door een NIH-trainingssubsidie (T32EB001026). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de American Liver Foundation, de March of Dimes Foundation (5-FY12-39) en de NIH (DK101426) aan D.S.

Zebravis zijn gerezen en gefokt volgens de standaard procedure; experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van de embryo&#39;s / larven <ol><li> Om getimede paringen, opgezet volwassen mannelijke en vrouwelijke Tg (fabp10a: CFP-NTR) voeren s931 hemizygoot of homozygote vissen O / N en plaats een scheidingslijn tussen hen. Verwijder deze divider de volgende morgen toen de paring wordt gewenst. Verzamel embryo&#39;s door overbelasting van het water met een fijne plastic zeef. </li><li> Draai het filter ondersteboven en spoel het gaas oppervlak met een fijne stroom van ei water afgegeven uit een knijpfles. Breng 100 embryo&#39;s in een 100 mm petrischaal met 25 ml water ei. Houd niet meer dan 100 embryo&#39;s per petrischaal en hen te verhogen bij 28 ° C. </li><li> Om pigmentatie remmen, voeg fenylthioureum (PTU) in de petrischaaltjes vóór 10 uur na de bevruchting (HPF) en verhogen embryos / larven tot 80 hpf. De eindconcentratie van 0,2 mM PTU. LET OP: PTU is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen. </li><li> Verdoven de larven door toevoeging van 3-aminobenzoëzuur ethylester (tricaïne) bij een eindconcentratie van 0,016%, in de petrischalen. Dan, met een epifluorescentiemicroscoop, sorteren CFP-positief larven. Gebruik larven met een vergelijkbare grootte lever- en lever met een kleinere of grotere lever. OPMERKING: elke CFP-positieve larven, ongeacht de intensiteit kan gebruikt worden omdat er geen verschil in de mate van ablatie hepatocyt tussen hemizygote en homozygote larven. LET OP: tricaïne is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen. </li><li> Verwijder het ei water met tricaïne en voeg ei water aangevuld met 0,2 mM PTU. Houd de embryo&#39;s / larven bij 28 ° C. </li></ol> 2. Mtz Behandeling <ol><li> Bereid verse 10 mM Mtz oplossing door het oplossen van 0,171 g Mtz poeder in 100 ml ei water, aangevuld met 0,2% DMSO en 0,2 mM PTU. Om volledig op te lossen de Mtz, meng de oplossing bij RT met snel roeren gedurende 20-30 minuten. Om u te helpen oplosbaar Mtz en Mtz permeatie verbeteren in de larven, voeg DMSO bij de voorbereiding Mtz. LET OP: langdurige blootstelling of een verhoogde concentratie van Mtz is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen. </li><li> Scheid de larven in controle- en experimentele groepen door overdracht gewenst aantal larven in twee afzonderlijke 100 mm petrischaaltje of multi-well plaat. Voor de experimentele groep, houden de larven in 10 mM Mtz oplossing; voor de controle groep, bewaar ze in ei water met 0,2% DMSO. </li><li> Bedek de platen of platen met de Mtz oplossing met aluminiumfolie om de foto-inactivatie van Mtz voorkomen en incubeer bij 28 ° C. De duur van Mtz behandeling is afhankelijk van het larvale stadium en transgene lijn. </li><li> Om soortgelijke ernstige hepatocyte ablatie in het observeren <em&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) lijn, behandelen de larven met de Mtz oplossing van ofwel 3,5 dagen na de bevruchting (DPF) (voor een periode van 36 uur) of van 5 DPF (voor een periode van 24 uur). </li></ol> 3. Analyse van Biliary-driven leverregeneratie <ol><li> Aan het einde van het ablatie periode verwijderen Mtz oplossing van de platen. Was de Mtz-behandelde larven door het toevoegen van 25 ml van het ei water. Swirl de plaat 2-3 keer om de larven te wassen voor het teruggooien het ei water. Herhaal dit drie keer en dan dompel de larven nogmaals in ei water. Om hart oedeem en larven dood te vermijden in de Mtz behandelde larven, voeg een lagere concentratie tricaïne, bij een eindconcentratie van 0,008%, de larven immobiliseren. </li><li> Voor lever analyse onderzoekt de lever grootte van de Mtz-behandelde larven onder een epifluorescentiemicroscoop met het GVB filter. Beoordelen hepatocyte ablatie niveaus op basis van de relatieve grootte van de lever: grote (non-ablatie; 0-10% larven), medium (deels weggenomen; 10-20%) en kleine (volledig weggenomen; 80-90%). </li><li> Verwijder de larven met niet-ablatie of gedeeltelijk weggenomen levers. Alleen houden larven met een kleine lever, wat duidt op ernstige hepatocyt ablatie. Voor lever analyse op de regeneratie 0 uur tijdstip (R0h), oogsten de larven na Mtz uitspoeling en CFP sorteren. Anders houdt de gesorteerde larven in ei water aangevuld met 0,2 mM PTU totdat klaar voor de oogst. </li><li> Overdracht geoogst larven in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vervangen ei water met de fixatie oplossing van 3% formaldehyde in PEM buffer. Incubeer de buis op een rotator O / N bij 4 ° C. </li><li> Vervang de fixatie-oplossing met 1 ml van PBSDT en draai de buis met de larven op de rotator gedurende 5 min. </li><li> Breng de vaste larven in een 100 mm petrischaaltje met PBSDT en behulp van een tang, handmatig dooier en borstvinnen te verwijderen onder een dissectie microscoop. Transfer up tp 20 ontleed larven in een 1,5 ml buis. </li> &lt;li&gt; Vervang PBSDT oplossing 1 ml blokkeringsoplossing en rock de buis op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Vervang blokkeeroplossing met 100 ul van blokkeeroplossing die primaire antilichamen. Langzaam rock de buis op een rotator O / N bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het primaire antilichaam oplossing en was met PBSDT 5 maal gedurende 10 minuten per keer. Voeg vervolgens 100 ul van blokkeeroplossing die secundaire antilichamen en schommel het op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Was 5 keer met PBSDT gedurende 10 minuten per keer bij RT door rocken op een rotator. </li><li> Richt de larven zijdelings op een microscoopglaasje en voeg een druppel fixeermiddelen. Bedek ze voorzichtig met een glazen deksel en sluit het deksel glas met een nagel polijstmachine. Nu het klaar is voor confocale microscopie. </li></ol>

<ol><li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroen+Hepatol%22%5BJournal%5D)">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li>
<li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+and+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+Alternative+epithelial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+B%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li>
<li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hepatocyte+%27buds%27+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+hepatology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li>
<li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+%28EpCAM%29+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem%2FProgenitor+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li>
<li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li>
<li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li>
<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
<li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li>
<li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator%2C+uhrf1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+A+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li>
<li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li>
<li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence%2C+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li>
<li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Regeneration+by+Stem%2FProgenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li>
<li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li>
<li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+cirrhosis%3A+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Serieus, maar niet mild, hepatocyte ablatie lokt-gal gedreven leverregeneratie. Daarom na Mtz behandeling en washout, is het belangrijk om de grootte van de lever Mtz behandelde larven, die kan worden bepaald door intrinsieke fluorescentie van de CFP fabp10a onderzoeken: CFP-NTR transgen. Aangezien een klein percentage van de Mtz behandelde larven niet-geablateerde (0-5%) of gedeeltelijk geablateerd (10-20%) levers weergegeven, is het noodzakelijk om uit slechts analyseren de larven met een zeer kleine lever, d...

De lever is een sterk regeneratieve orgaan. Tijdens leverregeneratie, regenereren levercellen, de parenchymcellen van de lever, zijn afgeleid van reeds bestaande hepatocyten (hepatocyte-gedreven lever regeneratie) of BEC (gal gedreven lever regeneratie) 1,2. Leverbeschadiging teweegbrengt gewoonlijk de verspreiding van latente hepatocyten; Wanneer echter de proliferatie van levercellen wordt aangetast, BEC kan bijdragen tot hepatocyten 2-4. Deze twee modi van de lever regeneratie zijn klinisch significant. Na chirurgische verwijdering van een gedeelte van de menselijke lever (bijvoorbeeld wegens levertumoren en levende leverdonor), hepatocyten in de lever resterende prolifereren de lever massaverlies herstellen. Daarentegen, bij patiënten met ernstige leverziekten, proliferatie van levercellen sterk aangetast, waardoor BEC of progenitorcellen (LPCs) lijken bij te dragen tot hepatocyten regenereren 5,6. De knaagdieren 2/3 gedeeltelijke hepatectomie model, waarinhepatocyten verspreiden naar de lever massa verloren te herstellen, heeft aanzienlijk bijgedragen tot de huidige kennis van-hepatocyte gedreven leverregeneratie 7,8. Er is echter geen geldige knaagdier model waarin hepatocyten regenereren voornamelijk afkomstig van BEC. Hoewel verscheidene knaagdier lever toxine modellen heeft geleid tot de identificatie van biliaire aangedreven leverregeneratie 2-4, recent lineage tracing studies in muizen wijzen op een minimale bijdrage van BEC te regenereren hepatocyten in deze modellen 9,10. Enkele knaagdier leverbeschadiging modellen, waaronder gedeeltelijke hepatectomie 11-13 en acetaminophen geïnduceerde leverschade 14,15, zijn toegepast op zebravis en leidde tot de identificatie van nieuwe genen en routes die betrokken zijn in leverregeneratie. Echter, hepatocyt-gedreven, maar niet BEC-gedreven, lever regeneratie plaatsvindt in deze zebravis leverschade modellen. Daarom is een nieuw leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot regenerating hepatocyten is nodig voor een beter begrip van BEC-gedreven lever regeneratie. De algemene doelstellingen van de hepatocyt ablatie model hier beschreven zijn (1) een leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot hepatocyten regenereren, en (2) ophelderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen BEC-driven leverregeneratie genereren. Onze hypothese was dat de ernst van de blessure bepaalt de wijze van leverregeneratie; dus we voorspeld dat gal gedreven leverregeneratie zou starten op ernstige hepatocyte letsel. Om deze hypothese te testen, hebben we een zebravis leverschade model door het genereren van een transgene lijn, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, die sterk tot uitdrukking bacteriële nitroreductase (NTR) versmolten met cyaan fluorescente eiwit (GVB) in het kader van de hepatocyt-specifieke fabp10a promoter. Aangezien NTR zet de niet-giftige prodrug, metronidazol (Mtz), een cytotoxisch geneesmiddel, dat ablates alleen de bedoelde NTR-expressie brengen 16-18, in dit geval, de hepatocyten. Door het manipuleren van de duur van Mtz behandeling, kan de omvang van hepatocyten ablatie worden gecontroleerd. Met behulp van dit model hebben wij onlangs gemeld dat men krijgt bij zware hepatocyt verlies, BEC uitvoerig leiden tot hepatocyten regenereren 19, die verder werd bevestigd door twee onafhankelijke studies 20,21. Daarom is in vergelijking met voornoemde knaagdieren en zebravis leverbeschadiging modellen ons hepatocyten ablatie model is voordeliger voor het bestuderen BEC-driven leverregeneratie. Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van leverregeneratie experimenten met de zebravis hepatocyte ablatie model. Dit model is geschikt voor het bepalen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan-gal gedreven lever regeneratie en chemische schermen om kleine moleculen die kunnen onderdrukken of versterken leverregeneratie identificeren.

<table><tbody><tr><td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Maak 0.4% (15 mM) tricaine stock : Breng 0.4 g tricaine tot 100 mL met eiwater. Pas aan tot pH 7.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Calcium sulfate dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Montage medium (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm petrischaal&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>heldere nagellak</td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>glasplaatje</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>glasdekje</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A en 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (muis anti-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 verdunning</td></tr><tr><td>geit anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50 verdunning</td></tr><tr><td>rat anti-RFP</td><td>Allele Biotechnology</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 verdunning</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-geit IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Geit Anti-muis IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Cy3 ezel anti-rat IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>dissectiemicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>epifluorescentiemicroscoop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>eiwater</td><td></td><td></td><td>0.3 g/L zeezouten ‘Instant Ocean’ en 0.5 mM CaSO4 in gedistilleerd water. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&middot;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&nbsp; Breng tot 1 L met gedistilleerd water.&nbsp; Pas pH 7 aan.&nbsp; Autoclaveer gedurende 20 min bij 121&deg;C.</td></tr><tr><td>1X PBSDT</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton X-100 en 0.2% DMSO in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>PEM buffer</td><td></td><td></td><td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&nbsp; Breng tot 1 L met gedistilleerd water.&nbsp; Pas pH 7 aan.</td></tr><tr><td>Blocking oplossing</td><td></td><td></td><td>Meng 1 ml verhitte geitenserum met 9 ml van 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

hepatocyt-specifieke ablation in zebravis-biliary gedreven leverregeneratie studie

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

De lever heeft een grote capaciteit om te regenereren. Hepatocyten, de parenchymale cellen van de lever kan regenereren op twee manieren: hepatocyte- of gal aangedreven leverregeneratie. In-hepatocyte gedreven leverregeneratie, regenereren hepatocyten afkomstig van reeds bestaande hepatocyten, terwijl in-gal gedreven regeneratie, regeneratie van hepatocyten zijn afgeleid van gal epitheelcellen (BEC). Voor-hepatocyte gedreven leverregeneratie, zijn er uitstekende knaagdieren modellen die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de huidige kennis van de lever regeneratie. Er bestaat echter geen dergelijke knaagdier model voor gal gedreven leverregeneratie. We hebben onlangs gemeld op een zebravis leverschade model waarin BEC uitgebreid tot hepatocyten na ernstige hepatocyte verlies. In dit model worden hepatocyten specifiek geablateerd door farmacogenetische middel. Hier presenteren we in detail de methoden om hepatocyten ablatie en de BEC-gedreven lever regeneratieproces analyseren.Dit hepatocyt-specifieke ablatie model kan verder worden gebruikt om de onderliggende moleculaire en cellulaire mechanismen van biliaire aangedreven leverregeneratie ontdekken. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden toegepast om chemische schermen van kleine moleculen die uitbreiding of onderdrukken leverregeneratie identificeren.

Mtz behandeling van 36 uur (A36h, A staat voor ablatie) 3,5-5 DPF drastisch verminderd size lever (Figuur 1B). Na Mtz wash-out, beschouwd als het begin van de lever regeneratie (R), sterke fabp10a: CFP-NTR en fabp10a: DsRed uitdrukking zich binnen 30 uur (Figuur 1B). De intrahepatische biliaire netwerk, zoals beoordeeld door expressie van Alcam die aanwezig zijn in het membraan van BEC 22 is aanvankelijk ingestort maar werd hersteld op 54 uur na washout (R54...

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door de galgangen gestuurde leverregeneratie bij zebravis te helpen beoordelen, hebben we een leverbeschadigingsmodel opgesteld waarin de nitroreductase-expresserende hepatocyten genetisch worden afgebroken na behandeling met metronidazol. In dit protocol beschrijven we hoe we op bekwame wijze hepatocytenafbraak en door galgangen gestuurde leverregeneratie kunnen manipuleren, bewaken en analyseren.

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Het algemene doel van deze procedure is het induceren van hepatocyt-ablatie bij zebravis voor de analyse van galweg-gestuurde leverregeneratie. Dit wordt bereikt door eerst transgene larven die nitroreductase in hun hepatocyten tot expressie brengen, bloot te stellen aan metronidazol of MTZ. In de tweede stap wordt de mate van hepatocyt-ablatie beoordeeld op basis van de relatieve grootte van de lever.Na de MTZ-behandeling in de laatste stap worden de bully-larven met een geablateerd, klein levertje verzameld; uiteindelijk worden de grootte van de lever en de expressie van levermarkers in de regenererende lever respectievelijk gemeten met epifluorescentie- en confocale microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals rodentenmodellen voor de activatie van ovale cellen, is dat de regenererende hepatocyten bij deze techniek hoofdzakelijk afkomstig zijn van galwegepitheelcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van leverregeneratie, zoals de vraag hoe galweg- of leverprogenitorcellen bijdragen aan de leverregeneratie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de levergrootte in de geablateerde en regenererende larven variabel is.Om getimde paringen uit te voeren, plaatst u volwassen mannelijke en vrouwelijke hemizygote of homozygote vissen gedurende de nacht samen in een bak met een scheidingswand tussen hen. Verwijder de volgende ochtend de scheidingswand wanneer de paring gewenst is. Gebruik een fijne plastic zeef om de embryo's te oogsten, houd de zeef ondersteboven en gebruik een knijpfles om het maasoppervlak af te spoelen met een fijne straal eitjeswater. Breng vervolgens maximaal 100 embryo's over naar een Petri-schaal van 100 millimeter met 25 milliliter eitjeswater en plaats de schaal bij 28 °C om pigmentatie te remmen.Voeg PTU toe aan de cultuur tot 10 uur. Post-fertilisatie bij 80 uur. Na personalisatie worden de larven geanestheseerd met trica en wordt er een epifluorescentiemicroscoop gebruikt om de CFP-positieve larven te verzamelen, waarbij alleen de dieren met levers van vergelijkbare grootte worden behouden.Vervang vervolgens het eierwater van de drie dagen oude embryo's door vers eierwater aangevuld met PTU en plaats de CFP-positieve zebravislarven terug in de incubator op 28 graden Celsius. Om de zebravislarven met MTZ te behandelen, verdeelt u eerst het juiste aantal larven over twee verschillende kweekvaten. Houd de experimentele groep larven in een oplossing van vers bereid MTZ en de controlegroep in eierwater.Aangevuld met DMSO. Dek de experimentele groep af met aluminiumfolie om foto-inactivering van MTZ te voorkomen en incubeer beide groepen zebravislarven bij 28 °C aan het einde van de ablatieperiode. Verwijder de MTZ-oplossing uit de platen en was de met MTZ behandelde larven twee tot drie keer met 25 ml eitjeswater, waarbij het eitjeswater na elke wasbeurt voorzichtig wordt weggegooid door te zwenken.Immobiliseer de larven na de laatste wasbeurt met de helft van de eerder gebruikte concentratie trica om hartoedeem en sterfte bij de met MTZ behandelde larven te voorkomen. Gebruik vervolgens het CFP-filter op een epifluorescentiemicroscoop om de mate van hepatocyt-ablatie te beoordelen op basis van de relatieve levergrootte van de met MTZ behandelde larven. Beschouw de zebravisjes met grote levers, die 0 tot 5% van de larven vertegenwoordigen, als niet geablateerd.Larven met middelgrote levers, die 10 tot 20% van de larven vertegenwoordigen, moeten gedeeltelijk worden geablateerd en larven met zeer kleine levers, die 80 tot 90% van de larven vertegenwoordigen, moeten volledig worden geablateerd. Na het classificeren van alle dieren worden de larven met niet-geablateerde of gedeeltelijk geablateerde levers geïdentificeerd, waarbij alleen de zebravisjes met minuscule levers die duiden op een ernstige hepatocyt-ablatie worden behouden voor leveranalyse. Op het nulpunt van de regeneratie worden de larven overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Direct na het uitwassen van MTZ en de CFP-sourcing, vervang het eiwater door MPEM-buffer met 3% formaldehyde voor een overnachtse fixatie op een rotor bij vier graden Celsius. De volgende ochtend wordt de fixatieoplossing vervangen door één milliliter P-B-S-D-T en worden de larven nog vijf minuten lang geroteerd. Plaats vervolgens alle gefixeerde larven onder een dissectiemicroscoop in een Petri-schaal van 100 millimeter met vers P-B-S-D-T en gebruik een pincet om handmatig de dooier en de borstvinnen te verwijderen wanneer alle larven zijn geknipt.Breng maximaal 20 dieren over in een buisje van 1,5 milliliter en vervang de P-B-S-D-T door één milliliter blokkeeroplossing. Na twee uur op de rotator bij kamertemperatuur wordt de blokkeeroplossing vervangen door 100 microliters van de primaire antilichaamcocktail voor een incubatie gedurende één nacht bij vier graden Celsius. Verwijder de volgende dag, terwijl de buisjes worden geschud, de primaire antilichaamoplossing en was de zebravissen met P-B-S-D-T gedurende vijf wasbeurten van 10 minuten.Voeg na de laatste wasbeurt 100 µL van het secundaire antilichaam toe voor een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur onder schudden. Was de larven vervolgens vijf keer in P-B-S-D-T, zoals zojuist gedemonstreerd. Plaats de larven in zijdelingse positie op een objectglas en voeg een druppel montagemedium toe.Dek vervolgens elke zebravis zorgvuldig af met een dekglas en verzegel het dekglas met nagellak. MTZ-behandeling gedurende 36 uur vanaf 3,5 tot vijf dagen na bevruchting vermindert de levergrootte drastisch. Na het uitwassen van MTZ verschijnt er binnen 30 uur opnieuw een sterke CFP- en rode expressie, wat inderdaad werd vastgesteld door de expressie van LCAM in het membraan van de galwegepitheelcellen.Het intrahepatische galwegennetwerk stort aanvankelijk in, maar wordt vervolgens 54 uur na het uitwassen hersteld, wat wijst op een snelle leverregeneratie en herstel. Op deze afbeeldingen worden regenererende hepatocyten getoond die transgeen zijn voor een nucleair rood fluorescent eiwit, dat uitsluitend tot expressie komt in de galwegepitheelcellen van de lever; de meeste van deze H2B-mCherry-positieve cellen in de regenererende lever brengen HNF4α tot expressie bij regeneratie-uur nul, vier en acht. De MTZ-behandelde CFP-positieve hepatocyten behouden hun H2B-mCherry-expressie, wat duidt op de conversie van galwegepitheelcellen naar hepatocyten na ernstig hepatocytenverlies.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden volledig geablateerde exemplaren te selecteren na de MTT-behandeling voor de daaropvolgende leverregeneratie op lysis-actie na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van leverregeneratie om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan leverregeneratie gedreven door leverprogenitorcellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe dit geografisch cyte-specifieke operationele model kan worden gebruikt voor studies naar bilio-gedreven leverdegeneratie.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Het artikel beschrijft gerichte leverablatie, een methode voor het induceren van hepatocytdood met metronidazol in transgene zebravislarven. Het monsterprotocol beschrijft het proces voor het genereren, manipuleren en beoordelen van gerichte leverablatie bij zebravissen.

Gerichte leverablatie: inducerende hepatocytdood met metronidazol in transgene zebravislarven

Aanhoudende fibrose met afzetting van overmatige extracellulaire matrix-eiwitten leidt tot cirrose. Alcoholmisbruik is een van de belangrijkste oorzaken van ernstige leverziekten. We hebben een ethanol-geïnduceerde zebravis model van een fibrotische lever opgezet om de mechanismen en strategieën van het bevorderen van hepatocytenregeneratie bij alcohol-geïnduceerde schade te bestuderen.

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Vertalen van ribosoom affiniteits zuivering (trap) maakt snelle en efficiënte isolatie van celtypespecifieke vertalen mRNA. Hier demonstreren we een methode die hydrodynamische staart-ader injectie combineert in een muismodel van lever repopulatie en val om het uitdrukkings Profiel van het herbevolkende hepatocyten te onderzoeken.

Celtype-specifieke genexpressie profilering in de muis lever

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Hier presenteren we een betrouwbare methode om regeneratie van volwassen nieren te bestuderen door acute nierbeschadiging te induceren door gentamicine-injectie. We tonen aan dat de schade afhankelijk is van de gentamicine-dosering en de omgevingstemperatuur door middel van in situ hybridisatie om lhx1a+ zich ontwikkelende nieuwe nephronen te labelen.

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

Leer hepatocyt-ablatie in zebrafish voor galweg-gedreven leverregeneratie met metronidazol. Deze methode maakt real-time analyse van leverherstel mogelijk via fluorescente beeldvorming.

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Meer video's verkennen