Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Het algemene doel van deze procedure is het induceren van hepatocyten ablatie bij zebravissen voor de analyse van galgang-gedreven leverregeneratie. Dit wordt bereikt door eerst transgene larven die nitroreductase in hun hepatocyten tot expressie brengen, bloot te stellen aan metrona of MTZ. In de tweede stap wordt de mate van hepatocytenablatie beoordeeld op basis van de relatieve grootte van de lever.

Na de behandeling met MTZ in de laatste stap, worden de door bully afgebladderde larven met een kleine lever verzameld en uiteindelijk wordt de grootte van de lever en de expressie van levermarkers in de regenererende lever gemeten door middel van epifluorescentie en confocale microscopie, respectievelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals activatiemodellen van ovale cellen bij knaagdieren is dat met deze techniek de regenererende hepatocyten voornamelijk zijn afgeleid van epitheliale cellen van de galwegen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van leverregeneratie, zoals hoe bijdragen galgang- of leverprogenitorcellen aan de leverregeneratie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat de levergrootte in lood en degenererende lab variabel is.

Om getimede paringen uit te voeren, zet volwassen mannelijke en vrouwelijke hemizygote of homozygote vissen 's nachts op met een scheiding tussen hen. Verwijder de scheiding de volgende ochtend wanneer paring gewenst is, gebruik een fijne plastic zeef om de embryo's te oogsten, draai de zeef ondersteboven en gebruik een spuitfles om het oppervlak van het gaas te spoelen met een fijne stroom eierwater. Breng vervolgens maximaal 100 embryo's over in een 100 millimeter petrischaaltje met 25 milliliter eierwater en plaats de schaal op 28 graden Celsius om pigmentatie te remmen.

Voeg PTU toe aan de cultuur tot 10 uur. Na de bevruchting op 80 uur. Na personalisatie, verdoof de larven met trika en gebruik een epifluorescentiemicroscoop om de CFP-positieve larven te verzamelen, en behoud alleen de dieren met even grote levertjes.

Vervang vervolgens het trika-eierwater door vers eiwater dat is aangevuld met PTU en plaats de CFP-positieve zebravislarven terug in de 28 graden Celsius incubator. Om de zebravislarven met MTZ te behandelen, verdeel eerst het juiste aantal larven in twee verschillende kweekvaten. Houd de experimentele larvengroep in een oplossing van vers bereide MTZ en de controlegroep in eiwater.

Aangevuld met DMSO. Bedek de experimentele groep met aluminiumfolie om foto-inactivatie van de MTZ te voorkomen en bebroed beide groepen zebravislarven aan het einde van de ablatiefase op 28 graden Celsius. Verwijder de MTZ-oplossing van de platen en was de met MTZ behandelde larven twee tot drie keer met 25 milliliter eiwater en draai rond, gooi het eiwater weg na elke wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, immobiliseer de larven met de helft van de concentratie trika die eerder werd gebruikt om hartoedeem en dood bij de met MTZ behandelde larven te voorkomen. Gebruik vervolgens de CFP-filter op een epifluorescentiemicroscoop om de niveaus van hepatocytenablatie te beoordelen op basis van de relatieve levergrootte van de met MTZ behandelde larven. Beschouw de zebravissen met grote levertjes die 0 tot 5% van de larven vertegenwoordigen als niet afgebladderd.

Degenen met middelgrote levertjes die 10 tot 20% van de larven vertegenwoordigen, worden gedeeltelijk afgebladderd, en degenen met zeer kleine levertjes die 80 tot 90% van de larven vertegenwoordigen, worden volledig afgebladderd. Na het classificeren van alle dieren, ontdek de larven met niet afgebladderde of gedeeltelijk afgebladderde levertjes, en behoud alleen de zebravissen met kleine levertjes aan die een ernstige hepatocytenablatie aangeven voor leveranalyse. Op het nuluur van de regeneratie, breng de larven over in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.

Onmiddellijk na de MTZ-uitspoeling en CFP-bronning, vervang het eiwater door 3% formaldehyde MPEM-buffer voor een overnachtse fixatie op een rotor van vier graden Celsius. De volgende ochtend, vervang de fixatieoplossing door een milliliter P-B-S-D-T en draai de larven gedurende vijf minuten extra. Vervolgens worden alle gefixeerde larven in een 100 millimeter petrischaaltje met vers P-B-S-D-T onder een dissectiemicroscoop gebracht en gebruik pincetten om handmatig de dooier en borstvinnen te verwijderen wanneer alle larven zijn geknipt.

Breng maximaal 20 dieren over in een buisje van 1,5 milliliter en vervang de P-B-S-D-T door een milliliter blokkeringsoplossing. Na twee uur op de rotator bij kamertemperatuur, vervang de blokkeringsoplossing door 100 microliter van de primaire antilichaamcocktail voor een overnachtse incubatie bij vier graden Celsius. Met schudden de volgende dag, verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de zebravis met P-B-S-D-T gedurende vijf wasbeurten van 10 minuten.

Na de laatste wasbeurt, voeg 100 microliter van het secundaire antilichaam toe voor een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur met schudden. Was vervolgens de larven vijf keer in P-B-S-D-T zoals zojuist is gedemonstreerd. Orienteer de larven lateraal op een microscoopglaasje en voeg een druppel montagemedium toe.

Bedek vervolgens elke zebravis voorzichtig met een dekglaasje en verzegel het dekglaasje met nagellak. MTZ-behandeling gedurende 36 uur van 3,5 tot vijf dagen na de bevruchting vermindert de levergrootte dramatisch. Na het uitwassen van MTZ verschijnt er binnen 30 uur een sterke CFP en rode expressie, inderdaad zoals beoordeeld door de expressie van LCAM in het membraan van de epitheliale cellen van de galwegen.

Het intrahepatische galwegennetwerk klapt aanvankelijk in, maar wordt vervolgens hersteld op 54 uur na het wassen, wat duidt op een snelle leverregeneratie en herstel. In deze afbeeldingen worden regenererende hepatocyten die transgeen zijn voor een nucleair rood fluorescerend eiwit dat uitsluitend in de epitheliale cellen van