Name: Dos en Donts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Leer efficiënte methoden voor het voorbereiden van spierbiopten voor histologische analyse met behulp van snelvriestechnieken. Deze aanpak minimaliseert bevriezingsartefacten en behoudt de weefselintegriteit voor nauwkeurige diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Alex Miller bedanken voor het revisiewerk aan het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de onderzoekssubsidies die aan M.G. werden toegekend door Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) en Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Oogst en Bevriezing van spierweefsel <ol><li> Euthanaseren de muizen met een overdosis van isofluraan (2-chloor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethaan). Voer deze stap in een zuurkast en gebruik een secundaire containment methode, zoals een exsiccator of een stolp met een wattenstaafje gedrenkt in isofluraan. </li><li> Bevestig de dood door stevig knijpen voetzool. Met een tweede werkwijze voor euthanasie zoals cervicale dislocatie. </li><li> Bevochtig de vacht met 70% alcohol aan het plakken van losse haarlokken op de spieren te verminderen. Schil de huid van de ledematen met een fijne tang, zoals # 5. </li><li> Haal voorzichtig de spier plaats (tibialis anterior (TA) in dit geval) van de botten eronder, uitgaande van de pees en verwijderen. </li><li> Accijnzen de spier, bedek het in oktober (Optimale Cutting Temperature verbinding), en leg het plat op een label wegwerp bevriezing schimmel. Zorg ervoor dat de spier is op zijn normale fysiologische oriëntatie (kop tot tail) zonder strekken. Alternatief invriezen spier aan kleine vierkantjes piepschuim en speld gebruik insect pinnen op de juiste lengte van de spieren te waarborgen. </li><li> Chill 2-methylbutaan (isopentaan) in een stalen beker met behulp van vloeibare stikstof. Dit duurt gemiddeld 3-5 min. Blijf roeren met tussenpozen totdat witte neerslagen beginnen te vormen op de bodem en wanden van de beker. OPMERKING: Wanneer dit gebeurt, isopentaan heeft optimale vriestemperatuur bereikt (-150 ° C) </li><li> Dompel het -vormen met spieren in de gekoelde 2-methylbutaan. Freeze kleine spieren zoals het membraan en extensor digitorum longus (EDL) gedurende 6-12 sec en grotere spieren zoals de gastrocnemius soleus (GS) en triceps gedurende 15-20 sec. Laat de spieren niet te bevriezen te lang, omdat dit kan leiden tot scheurvorming. </li><li> Breng de bevroren weefsel op droog ijs en laat de isopentaan verdampen (dit proces duurt gemiddeld ongeveer 15 - 20 min). Wikkel de weefsels in aluminiumfolie en bewaar ze bij uLTRA lage temperatuur (-70 ° C tot -80 ° C) tot snijden. </li></ol> 2. Inbedding de weefsels in oktober naar Tissue Block Bereid <ol><li> Transport weefsels op droog ijs naar cyrostat te ontdooien te voorkomen. Overdracht weefsel kamer (ingesteld op -20 tot -24 ° C volledig ontdooien van weefsels te voorkomen) en laat ze equilibreren gedurende 30 min Cryostaat. </li><li> Draai de baai Peltier koeling op. Als de cryostaat deze koeling niet heeft, gebruikt aerosol koeling spray om snel te bevriezen de LGO. Laat niet de spier dooi op enig moment tijdens de inbedding, want dit kan resulteren in vorstschade. </li><li> Voeg een uniforme dunne laag van oktober op het monster schijf en laat het afkoelen. Wanneer de meeste van de oktober onderaan terwijl vloeistof op de bovenkant bevroren, plaatst het weefsel in de juiste richting (loodrecht op oktober voor dwarsdoorsneden evenwijdig aan oktober voor langsprofielen). Gebruik aerosol koelnevel snel bevriezen oktober Raak de unembeded deel van het weefsel met warmte extractor en wacht 45 sec. </li><li> Voeg een dun laagje oktober rond de spier, nevel met aerosol koelnevel en uitpakken warmte in de vorige stap. </li><li> Voeg hieraan oktober in kleine stappen snel invriezen oktober een combinatie van aerosol koelnevel en warmteafvoerblok totdat alle spieren bedekt. </li><li> De thermische extractor bovenop de weefselblokje en wacht 5 minuten. </li></ol> 3. Voorbereiden van Profielen en identificeren van de secties van Mid-buik regio van de spieren <ol><li> Monteer het monster op de objectkop. Draai de knop om de schijf te beveiligen. Zorg ervoor dat het monster schijf in goed contact met het monster hoofd. </li><li> Pas de kamer temperatuur tussen -21 en -24 ° C en wacht tot de ingestelde temperatuur is bereikt. </li><li> Pas de dikte instellingen (7 urn); trimmen van het blok door oprukkende of terugtrekken van de blok met grove en fijne instellingen. </li><li> Verzamel de sectieson voorverwarmde positief geladen objectglaasjes door de bovenkant van de schuif op de secties via de aantrekking tussen tegengestelde ladingen op de hechting van de snijvlakken aan de slede te vergemakkelijken. </li><li> Identificeer de mid-belly secties door het meten doorsnede (CSA) van de secties. Gebruik hiervoor imaging software op de computer die is aangesloten op de microscoop. OPMERKING: fasecontrastbeelden genomen en de omtrek van de gehele spier wordt gemeten via een tracing functie het softwareprogramma. Daardoor wordt het CSA als minimale fret diameter (maat fiber dwarsdoorsnedeafmeting die wordt uitgedrukt als de kleinste afstand tussen twee evenwijdige raaklijnen aan weerszijden van een deeltje) metingen verkregen. Opmerking: Wanneer CSA en minimale fret diameter metingen beginnen te plateau, is medio buik bereikt. </li><li> Inventarisatie en archiveren van de dia&#39;s bij -80 ° C voor toekomstige vlekken. OPMERKING: oktober hoeft niet vooraf te worden verwijderd staining procedures. Zodra dia&#39;s worden afgedekt, zijn ze klaar om direct te worden gekleurd. </li></ol> 4. kleuring OPMERKING: Terwijl de uitvoerige stap-voor-stap procedures kan gevonden worden op het product informatieblad en moet worden gevolgd voor het kleuren procedures, kunnen persoonlijke optimalisatie nodig zijn om een ​​optimale kleuring te verkrijgen. <ol><li> Omdat fixeermiddelen (zie tabel) niet mengbaar is met water, droogt dia&#39;s door toenemende graden van alcohol (2 minuten elk in 70%, 95% en 100% ethanol) en duidelijke hen met xyleen (100% gedurende 5 minuten) om te waarborgen slides niet ondoorzichtig geworden in de tijd. </li><li> Coverslip secties en laat ze drogen. Afbeelding met microscoop uitgerust met imaging software. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Histologie en immunohistochemie werden gebruikt als essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de openbaring en de progressie van de pathologie in verschillende neuromusculaire aandoeningen. Klassiek, werden spierbiopten eerst vastgesteld in formaldehyde en vervolgens ingebed met paraffine. Terwijl formaldehyde fixatie behoudt weefsel architectuur en maakt het weefsel opslag en transport bij RT, maar inactiveert ook enzymen en crosslinks eiwitten noodzakelijk verdere stappen om nauwkeurige immunokleuring bereiken. D...

Onderzoek van de spieren histologie speelt een cruciale rol in het begrijpen van verschillende soorten neuromusculaire aandoeningen 1-4. In combinatie met andere technieken, laat onderzoekers een beter beeld van de openbaring en de progressie van de pathologie krijgen en kunnen ook van essentieel belang voor de efficiëntie van een therapeutische interventie 10/05 evalueren. Echter, om nauwkeurig te zijn, moet het weefsel op de juiste wijze worden bewaard om de fysiologische toestand onmiddellijk voor excisie behouden. Dit vereist grote zorg tijdens het verwijderen, behoud, snijden, en vlekken. Weefsels kunnen worden bereid op twee verschillende manieren voor lichtmicroscopische studie. De eerste methode, formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) secties, vereist weefsels in 10% natuurlijk gebufferd formaldehyde vast te stellen voordat ze worden ingebed met paraffine 11,12. De fixatie stap helpt om de morfologie beter, maar ook kruisverbindingen endogene pr behoudenoteins dus noodzakelijk ingewikkelde antigen retrieval procedures voor immunokleuring en het elimineren van de mogelijkheid van enzymatische vlekken op dergelijke secties 12. Vriescoupes, anderzijds, hoeven niet vooraf vastgesteld of verwerkt; Daarom, eiwitten zijn in staat om inheemse biologische conformaties 13,14 behouden. Verder vriescoupes stelt snel doorlooptijd, die soms noodzakelijk is, bijvoorbeeld in de intra-operatieve diagnose van sarcomen en andere chirurgische biopten 15. Indien niet goed uitgevoerd, deze methode is gevoelig voor beschadiging, die wijzigingen van de spierarchitectuur waardoor de secties geschikt zijn voor histologisch onderzoek introduceert bevriezen. Dit document zal de meest effectieve methode om spieren biopten te bereiden met het oog op een optimale kleuring voor de juiste examen te bereiken schetsen.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., kantoor telefoon 1-800-248-0123 Alternatief: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefoon: 1-631-547-8500 Alternatief: Olympus</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefoon: 1-631-547-8500 Alternatieven: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternatieve bron: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Wegwerp weefselvorm</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus-glazen</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethylalcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butaan</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>XYleen</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxyline Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosine</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

do&#39;s en don&#39;ts in de voorbereiding van muscle weefsel secties voor histologische analyse

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Histologische evaluatie van de spier biopsieën heeft gediend als een onmisbaar hulpmiddel in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van de pathologie van neuromusculaire aandoeningen. Echter, om dit te doen, de juiste zorg moet worden genomen bij het uitsnijden en conservering weefsels optimale kleuring bereiken. Een methode van weefsel behoud impliceert vaststelling van weefsels in formaldehyde en vervolgens inbedding ze met paraffine. Deze werkwijze behoudt morfologie goed en zorgt voor langdurige opslag bij kamertemperatuur, maar is omslachtig en vereist behandeling van toxische stoffen. Verder formaldehyde fixatie leidt antigeen cross-linking die antigen retrieval protocollen noodzakelijk voor een effectieve immunokleuring. Integendeel, ofwel bevroren coupes geen fixatie nodig en behoudt dus biologische antigen conformatie. Deze methode biedt ook een duidelijk voordeel in snelle draai rond tijd, waardoor het vooral handig in situaties nodig snel histologische evaluatie zoals intraoperatief chirurgische biopten. Hier beschrijven we de meest effectieve methode voor het bereiden spierbiopsieën visualisatie met verschillende histologische en immunologische vlekken.

De set-up voor de oogst en bevriezen van weefsel te zien in figuur 1. Uitgesneden weefsels moeten worden opgeslagen op een gaasje gedrenkt in PBS tot drogen (figuur 1A) voorkomen. Wanneer weefsels zijn geselecteerd om te worden gebruikt voor histologische analyse moeten ze worden ondergedompeld in OCT en aangelegd op cryo schimmel in de juiste oriëntatie en zo dicht mogelijk fysiologische lengte mogelijk nauwkeurige morfologie (figuur 1B) te waarborgen. Slurry isopentaa...

Hier demonstreren we de meest efficiënte methoden voor het invriezen, inbedden, cryosecteren en kleuren van spierbiopten om bevriezingsartefacten te voorkomen.

Do&#39;s en Don&#39;ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Het algemene doel van deze procedure is om valkuilen bij het bereiden van vriescoupes van spierbiopten te vermijden, zoals het ontstaan van vriesartefacten. Dit wordt bereikt door de spier eerst snel te vriezen in dimethylbutaan die is gekoeld met vloeibare stikstof. Nadat de spierbiopten zijn geëquilibreerd in de cryostaat, worden ze bij kamertemperatuur in kleine stappen ingebed in een optimum cutting temperature-medium, met snelle vriezing door middel van aerosolkoeling en warmteafvoer.Vervolgens worden coupes van zeven micron gesneden en overgebracht naar warme, positief geladen glazen objectglazen. De laatste stap is het kleuren van de weefselcoupes naar behoefte om de histologie van het weefsel te evalueren. Uiteindelijk leiden correct geprepareerde spierbiopten tot een goed behouden weefselhistologie zonder vriesartefacten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals het snijden van in paraffine ingebed weefsel, is dat deze zeer snel is en de endogene antigeenstructuur of -functie niet verandert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de gezondheid en ziekte van de spierbiologie, zoals groei, regeneratie, ontsteking, fibrose en necrose. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van spierziekten, omdat het mogelijk maakt om de conditie van gezond en ziek spierweefsel te bepalen.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in verschillende vormen van spierdystrofie, kan ze ook worden toegepast op andere systemen, zoals cachexie geassocieerd met terminale stadia van kanker en aids, en spierverlies bij oudere populaties. Begin met het euthanaseren van een muis met een overdosis isofluorine onder een zuurkast en in een secundaire beheersingslaag, zoals een stolp.Maak nu de vacht nat met 70% alcohol. Dit voorkomt dat losse haren aan de spieren blijven kleven. Ga vervolgens over tot het verwijderen van de huid van het ledemaat met een fijne pincet nummer vijf.Scheid de gewenste spier zorgvuldig van het bot, beginnend bij de pees. In dit geval wordt de musculus tibialis anterior geïsoleerd. Bedek de spier na het wegsnijden met OCT en leg deze plat op een gelabelde wegwerpvriesvorm.Later zal er nog meer OCT worden toegevoegd vóór het snijden. Zorg ervoor dat de spier in zijn normale fysiologische oriëntatie langs de as van kop naar staart ligt en dat de spier niet is uitgerekt. Koel nu af.Gebruik wat isopentaan in een stalen bekerglas met vloeibare stikstof. Roer gedurende drie tot vijf minuten met tussenpozen met een plastic spatel. Wanneer er een wit neerslag vormt, heeft het isopentaan zijn optimale temperatuur bereikt; doop op dat moment de gevulde mallen in de oplossing.Kleine spieren, zoals het diafragma en de musculus extensor digitorum longus, vereisen zes tot 12 seconden. Grotere spieren vereisen 15 tot 20 seconden; overbevriezing kan leiden tot scheurvorming. De volgende stap is om de bevroren weefsels op droogijs te plaatsen zodat het resterende isopentaan kan verdampen, wat ongeveer 15 tot 20 minuten duurt.Zodra het weefsel droog is, wikkel het in folie en bewaar het in een vriezer van -80 °C tot het in plakjes kan worden gesneden. Voor het snijden worden de bevroren weefsels op droogijs naar de cryostaat getransporteerd.Breng het weefsel over naar een cryostaatkamer die is ingesteld tussen -24 en -20 °C en laat ze 30 minuten equilibreren. Het weefsel zal bij deze temperatuur niet volledig ontdooien. Bedrijf vervolgens eerst het weefsel.Schakel indien beschikbaar de koeling van de Peltier Bay in. Breng vervolgens een gelijkmatige dunne laag OCT aan op de specimen-schijf en laat deze afkoelen. Plaats daarna het weefsel, zodra de OCT aan de onderzijde is bevroren maar aan de bovenzijde nog vloeibaar is; oriënteer het weefsel loodrecht op de OCT voor transversale coupes en parallel aan de OCT voor longitudinale coupes.Gebruik nu een aerosol-koelspray om het OCT snel te laten bevriezen. Raak vervolgens het niet-geïnventiseerde deel van het weefsel aan met een hitte-extractor en houd deze 45 seconden tegen het weefsel aan. Zorg ervoor dat de spier tijdens geen enkele stap in dit proces ontdooit.Indien de cryostaat niet is voorzien van Peltier-koeling, gebruik dan aerosolkoeling om het OCT rondom het weefsel snel te bevriezen. Voeg nu een weitere dunne laag OCT rond de spier toe, spuit met de aerosolkoelingsspray en onttrek de warmte zoals in de vorige stap. Blijf in kleine hoeveelheden OCT toevoegen en bevries het OCT snel met een combinatie van aerosolkoelingsspray en een warmte-extractor totdat de gehele spier bedekt is.Plaats vervolgens de warmte-extractor bovenop het weefselblok en wacht vijf minuten voordat u begint met het snijden. Het monster is nu klaar om op de monsterhouder te worden gemonteerd. Draai eerst aan de knop om de schijf vast te zetten.Zorg ervoor dat de monsterdisk goed contact maakt met de monsterkop terwijl de kamer een temperatuur tussen -24 en -20 °C bereikt. Stel de snijdikte in op 7 µm zodra de kamer op temperatuur is en begin met het trimmen van het blok. Gebruik de grove en fijne verstelling om het blok te bewegen.Wanneer de coupes klaar zijn om te verzamelen, druk de bovenkanten hiervan op positief geladen glaasjes die zijn opgewarmd met een lamp. Als het weefsel correct is ingevroren, moet het weefseloppervlak krijtwit zijn. Weefsel dat echter onjuist is ingevroren of is ontdooid tijdens het montageproces, zal rood tot roze kleuren.De coupes kunnen voor toekomstige analyse worden bewaard in de diepvriezer. De middelste sectie van de buik van het weefsel kan worden geïdentificeerd door de oppervlakte van de dwarsdoorsnede te meten via fasecontrastbeelden met behulp van de traceerfunctie van een beeldbewerkingspakket. Deze analyse verschaft zowel de oppervlakte als de metingen van de minimale ferret-diameter.Wanneer deze metingen beginnen te plateau-en, is het midden van de buik bereikt. Hoewel fabrikanten stap-voor-stap instructies leveren voor de meeste kleuringsprotocollen, kan persoonlijke optimalisatie nodig zijn om optimale kleuringsintensiteiten te bereiken. Het OCT hoeft niet te worden verwijderd.Voor optimale immunokleuring dient een bevochtigingskamer te worden gebruikt. Deze moet worden afgedekt met Perflex, op een nat vel keukenpapier worden geplaatst en in een klein doosje worden afgesloten om uitdroging van de coupes te voorkomen. Tijdens het kleuringsproces voor permanent gemonteerde coupes die niet immunogekleurd zijn, moeten de coupes, volgens het kleuringsprotocol, worden gedehydrateerd via oplossingen met een toenemende alcoholconcentratie.Omdat het montage medium niet mengbaar is met water, worden de coupes eerst vijf minuten behandeld in een bad van 100% xyleen. Dit voorkomt dat de preparaten na verloop van tijd troebel worden. Ga vervolgens over tot het monteren en afbeelden van coupes van de mid-buikregio van de gekleurde musculi tibiales anteriores.Met gebruik van hematoxyline en eosine. Secties die correct zijn verwerkt, vertonen een consistente morfologie en een gelijkmatige kleuring. Onjuist verwerkte spieren die door bevriezing zijn beschadigd of voortijdig zijn ontdooid, vertonen meerdere onderbrekingen in de morfologie en zien eruit als versnipperde granen.Immunohistochemie werd ook uitgevoerd op deze coupes. Deze kleuringen waren bevredigend. Fibronectine is groen gekleurd en DAPI is in het blauw zichtbaar.Na het bekijken van deze video zou u een grondige kennis moeten hebben van het bereiden van een kwalitatieve cryosectie uit spierbiopten voor de evaluatie van de spierarchitectuur. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer vier tot vijf uur worden uitgevoerd, mits alle stappen correct worden doorgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te voorkomen dat de spieren ontdooien na het volgen van deze stappen.Andere methoden, zoals immunokleuring en in situ hybridisatie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld groei en regeneratie.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Aangetoond in deze video zijn de technieken voor flash invriezen en snijden embryonale hersenweefsel van de muis. Nuttige tips voor het gebruik van de cryostaat worden gegeven, waaronder het oplossen van problemen methoden die gebruikt kunnen worden tijdens het snijden om ervoor te zorgen dat de resulterende weefsel secties zijn vrij van scheuren en andere vervormingen.

Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen

This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

De analyse van skeletspierweefsels om structurele, functionele en biochemische eigenschappen te bepalen, wordt enorm gefaciliteerd door een geschikte voorbereiding. Dit protocol beschrijft geschikte methoden om skeletspierweefsel voor te bereiden voor een breed scala aan fenotyperingsstudies.

Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

In dit manuscript presenteren we een hoogdoorvoerige, semi-geautomatiseerde cryohistologieplatform om gealignde composietbeelden te produceren van meerdere responsmaatregelen uit verschillende rondes van fluorescentiebeeldvorming op bevroren secties van gemineraliseerde weefsels.

High-throughput, Multi-Beeld Cryohistology gemineraliseerde weefsels

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor acute skeletspier regeneratie bij volwassen muizen en latere manipulaties van de spieren, zoals dissectie, bevriezen, snijden, routine kleuring en myofiber dwarsdoorsnede analyse induceren.

Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection

Opeenvolgende cryo-secties verzameld histologische toepassingen en verrijking van RNA voor genexpressie metingen met aangrenzende gebieden van een enkele muis skeletspier schakelen. Hoogwaardige RNA wordt verkregen 20-30 mg samengevoegd vriescoupes en metingen worden direct vergeleken verschillende applicaties.

Cryosectioning aaneengesloten Regio&#39;s van een enkele muis skeletspieren voor Gene Expression en histologische Analyses

Dit protocol beschrijft een procedure voor spierweefsel bevriezen door ze rechtstreeks dompelen in vloeibare stikstof. Dit protocol wijst een nieuwe cryovial dat de "blanket effect" stikstofgas kan voorkomen bij vloeibare stikstof contact maakt met het weefseloppervlak van een monster.

Een multi-hole Cryovial Voorkomt bevriezen Artefacten als spierweefsel direct worden ondergedompeld in vloeibare stikstof

Actieve autofagie is geassocieerd met productieve spierregeneratie, die essentieel is voor het activeren van spierstamcellen (MuSC). Hier bieden we een protocol voor de in situ detectie van LC3, een autofagie marker in MyoD-positieve MuSCs van spierweefsel secties van controle en gewonde muizen.

In situ Immunofluorescente Staining of Autophagy in Spier Stamcellen

Hier beschreven is een protocol voor directe immuunetikettering van necrotische myovezels in spier cryosecties. Necrotische cellen zijn permeabel voor serum proteïnen, waaronder immunoglobuline G (IgG). Het onthullen van de opname van IgG door myofibers maakt het mogelijk de identificatie en kwantificering van myovezels die necrose ondergaan ongeacht spieraandoening.

Immunolabeling Myofiber degeneratie in spier biopsies

Dit protocol beschrijft methoden die worden gebruikt om de stemplooien van ratten voor te bereiden op histochemisch neuromusculair onderzoek.

Voorbereiding van de rattenzangplooi voor neuromusculaire analyses

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Leer efficiënte methoden voor het voorbereiden van spierbiopten voor histologische analyse met behulp van snelvriestechnieken. Deze aanpak minimaliseert bevriezingsartefacten en behoudt de weefselintegriteit voor nauwkeurige diagnostiek.

Do's en Don'ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse

Meer video's verkennen