Athymische Rat Model voor de Evaluatie van Engineered voorste kruisband Grafts

Het algemene doel van de volgende procedure is om een knaagdiermodel te gebruiken voor het evalueren van weefseltechnische grafts voor de vervanging van het voorste kruisband. Dit wordt bereikt door eerst een biologisch afbreekbaar polymeerskelet te fabriceren. In de tweede stap wordt het skelet geïmplanteerd in de knie van een rat.

Na 16 weken worden de neo-ligamenten die uit het scaffold zijn gevormd, geoogst voor histologische analyse. Uiteindelijk wordt de biomechanische sterkte van het collageen getest om de kwaliteit van deze tissue-engineered grafts te beoordelen voor gebruik bij ACL-reconstructie. De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van andere methoden voor scaffold-evaluatie zijn dat dit model het scaffold blootstelt aan de complexe in vivo-omgeving, terwijl het kosteneffectief blijft en gemakkelijker te hanteren is dan grotere diermodellen.

Dit model kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van tissue engineering, zoals de vraag hoe een ontwikkeld steunstructuur (scaffold) zal integreren met de in vivo omgeving om een nieuw ligament te vormen. Deze techniek kan leiden tot nieuwe behandelingen en ACL-reconstructies. Aangezien kleine diermodellen de eerste stap zijn naar klinische translatie, kan deze methode worden gebruikt om onze specifieke scaffold te evalueren.

Het kan ook worden toegepast op andere weefseltechnische constructen, zoals constructen met cellen en groeifactoren. We optimaliseren de chirurgische techniek door de methoden aan te passen die door Dr. Scott Rodeo en collega's worden gebruikt in het Hospital for Special Surgery in New York. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de electrospinning- en chirurgische stappen moeilijk te leren kunnen zijn op basis van alleen schriftelijke instructies.

Bij het electrospinnen van polycaprolacton-scaffolds is een grote acrylbox met toegangspunten voor de polycaprolacton-bronoplossing vereist. Een door een motor aangedreven opvangspoel en een door een spanningsbron aangestuurde vacuümpoort, geplaatst in een chemische zuurkast, zijn nodig om als geïsoleerd vacuümedium voor het electrospinningproces te dienen. Reinig de box vóór aanvang van de procedure grondig met 70% ethanol en bedek alle oppervlakken met parafilm-vellen om eventuele onzuiverheden te verwijderen die de kwaliteit van het ge-electrospun product kunnen beïnvloeden.

Zet vervolgens de ventilator aan en vul een spuit van 10 milliliter met een stompe 18 gauge naald met drie milliliters vers bereid polycaprolacton-polymeer. Nadat eventuele luchtbellen zijn verwijderd, wordt de oplossing in een programmeerbare spuitpomp geklemd en wordt de naald via de toegangspoort in de acrylbox gestoken, waarbij ongeveer een halve inch van de naald buiten de box blijft. Bedek daarna de roterende lattenas stevig met een dunne strip aluminiumfolie en klem de as vast in de motor aan de tegenovergestelde zijde van de box, op ongeveer 15 centimeter afstand van de spuitnaald om als collector te dienen. Steek een plastic slang in de vacuümpoort.

Sluit vervolgens de slang aan op de vacuümbron van de zuurkast en schakel deze in. Plaats nu het deksel op de acrylbox en stel de infusiesnelheid van de programmeerbare spuitenpomp in op 2,5 milliliters per uur. Aard vervolgens de negatieve leiding, schakel de motor in om de mandrel te laten draaien op 3.450 RPM en gebruik een krokodillenklem om de positieve leiding van de spanningsbron aan de naaldpunt buiten de box te bevestigen.

Zodra de infusie van de polycaprolactoonoplossing is begonnen, schakelt u de spanningsbron in en stelt u deze in op een werkspanning van 20 kilovolt. Na 12 minuten infusie is er een homogene manchet gevormd uit 0,5 milliliters van de polycaprolactoonoplossing. Schakel alle apparatuur uit, inclusief de spanningsbron, de motor, het vacuüm en de spuitenpomp.

Verwijder de mandrel van de motor, verwijder de polymeermanchet van de mandrel en maak één transversale snede om een rechthoekige electro-gesponnen mat te verkrijgen. Snijd de mat vervolgens met een laser om meerdere kleine vellen te vormen, die later in strips worden gesneden, vier lagen dik worden gestapeld en aan elkaar worden gehecht om scaffolds te vormen voordat de operatie begint. Bevestig eerst de adequate anesthesie door het ontbreken van een reactie op druk op de achterpoot.

Maak vervolgens een verticale incisie van twee centimeter aan de mediale zijde van de knie, gecentreerd op het niveau van de patella, waarbij de huid indien nodig lateraal wordt teruggetrokken. Gebruik daarna een scalpel om een mediale parapatellaire arthrotomie te maken net mediaal van de patella, die proximaal wordt uitgebreid tot het niveau van de musculotendineuze overgang van de quadriceps en distaal tot het niveau van de aanhechting van de patellapees op de tuberositas tibiae. Maak nu een verticale incisie van één centimeter door het kniekapsel net lateraal van de patellapees om de patella lateraal te mobiliseren.

Zorg vervolgens dat de knie is gestrekt, voer een fijne schaar onder de patella door van de laterale naar de mediale zijde, en spreid de schaar een paar keer zodat het extensiemechanisme naar beide zijden kan worden verschoven terwijl de knie wordt gebogen. Verschuif de patella lateraal om de binnenzijde van het kniegewricht bloot te leggen, waarbij een duidelijke visualisatie van de intercondylaire inkeping en de femorale condylen wordt bevestigd. Transecteer vervolgens de ACL en PCL in de inkeping.

Plaats nu de punt van een K-draad van 1,6 millimeter, bevestigd aan een elektrische boor, op de oorsprong van de ACL in de intercondylaire inkeping en boor superolateraal terwijl een assistent de knie stabiliseert. Voer de K-draad vervolgens enkele keren in en uit om een vrije passage voor het transplantaat te garanderen. Visualiseer het uitgaande punt aan de laterale zijde van het femur en verwijder indien nodig zacht weefsel met een scalpel.

Wanneer het tunnelkanaal vrij is, plaatst u de K-draad op de ACL-voetafdruk op het tibiale plateau en boort u lateraal terwijl een assistent de knie stabiliseert. Visualiseer vervolgens het uitstappunt op de anterolaterale proximale tibia en gebruik een scalpel om het weke weefsel naar behoefte te verwijderen, zodat het punt waar de K-draad de tibia verlaat volledig zichtbaar is, en voer een verkorte Keith-naald van maximaal twee inch lengte door de femorale bottunnel. Rijg nu de twee hechteinden van één uiteinde van het transplantaat door het oog van een naald en gebruik de naald om één uiteinde van het transplantaat door de femorale tunnel te trekken.

Gebruik vervolgens de naald om het andere uiteinde van het transplantaat via een 4-0 Vicryl-hechtdraad door het tibiale tunnelkanaal te leiden. Bevestig daarna het femorale uiteinde van het transplantaat aan het omringende weke weefsel met een achtsteek, terwijl de knie in extensie wordt gehouden om handmatige spanning op het transplantaat uit te oefenen. Gebruik een tweede achtsteek om het tibiale uiteinde van het transplantaat aan het omringende weke weefsel te bevestigen, waarbij het overtollige transplantaat aan beide uiteinden met een schaar wordt afgeknipt en er aan elk uiteinde 1 tot 2 mm voorbij de hechting wordt gelaten.

Strek tot slot de knie en reduceer de patella. Plaats vervolgens met een 4-0 Vicryl-hechtdraad een enkele acht-hechtsteek om het mediale gewrichtskapsel te sluiten, ter voorkoming van laterale subluxatie van de patella, en sluit de huid met een doorlopende subcuticulaire 5-0 Monocryl- of Vicryl-hechtsteek. Bij histologische analyse van de doorsnede van de knie, 16 weken na de reconstructie, blijkt dat de scaffoldmatrix grotendeels is geïnfiltreerd door fibroblasten die eosinofiel collageen uitscheiden, met een goede integratie in de botkanalen.

In dit experiment werden de biomechanische eigenschappen van het gewricht onmiddellijk na opoffering beoordeeld. Alle geteste monsters faalden in de substantie van het midden, waarbij gebruik werd gemaakt van verplaatsingscurven met een lage amplitude die waren gegenereerd via trekproeven. De faallast en stijfheid werden voor elke groep berekend.

16 weken na implantatie was de piekbelasting en stijfheid van het electro spon polymeertransplantaat ongeveer verdubbeld ten opzichte van het transplantaat dat direct na implantatie was getest. Hoewel deze waarden nog steeds lager waren dan die van de natuurlijke ACL, kan de operatie bij dieren, eenmaal onder de knie, in ongeveer 15 minuten worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat er een goede sluiting moet worden aangebracht waarbij geen hechting vanaf de buitenkant zichtbaar is.

Na deze procedure kunnen andere eindpuntanalyses worden uitgevoerd, zoals aanvullende kleuringen en biochemische assays. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering om meerdere graft-opties voor ACL-reconstructie te evalueren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een polymere scaffold fabriceert voor implantatie in een knaagdiermodel voor ACL-reconstructie.

Vergeet niet dat het werken met levende dieren gevaarlijk kan zijn en dat er te allen tijde voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure, zoals het naleven van veterinaire aanbevelingen en het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen.