Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van per ongeluk gelokaliseerde mRNA's in hersenmonsters van volwassenen. Dit wordt bereikt door de monsters in een eerste stap voor te behandelen door middel van koken en proteasedigestie om de mRNA-moleculen te ontmaskeren. Als tweede stap wordt hybridisatie uitgevoerd, gevolgd door amplificatie- en detectiestappen, die de visualisatie van het mRNA van belang mogelijk maken.

Vervolgens worden axonen gekleurd met antilichamen of kleurstoffen om te verifiëren dat het mRNA van belang gelokaliseerd is in de axonen. De resultaten tonen de aanwezigheid van TF four mRNA in hersenmonsters met behulp van verschillende onmaskeringsprocedures en tegenkleuringen, waarbij gebruik is gemaakt van kleuringsmethoden gebaseerd op microscopische analyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in de neurowetenschappen, zoals welke mRNA's gelokaliseerd en vertaald worden in axonen.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de intracone eiwitsynthese, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals dendrieten en niet-neuronale cellen en weefsels waarin mRNA-lokalisatie plaatsvindt. Nadat de hersensecties zijn gefixeerd volgens de instructies in het schriftelijke protocol, bereidt u een coplin-pot met 60 milliliters antigeen-retrievaloplossing en dompelt u de objectglazen in de oplossing. Vul vervolgens een bekerglas van één liter met gedestilleerd water en plaats deze in de magnetron om de hitte te bufferen.

Plaats bij het uitvoeren van de unmasking de coplan-pot met de coupes en de retrieval-oplossing in de magnetron. Laat de coupes vijf minuten koken op hoog vermogen. Verhit de coupes direct nadat de oplossing is gestopt met koken nogmaals vijf minuten op hoog vermogen.

Laat de preparaten afkoelen op kamertemperatuur. Dompel de preparaten na het afkoelen in een schaal met PBS om ze te wassen en herhaal deze wasstap nog twee keer. Plaats de preparaten na het wassen op een vlak oppervlak en voeg twee tot drie druppels of 100 µL DAP B-probe toe aan twee of drie hersendoorsneden als controle. Voeg om de achtergrondkleuring te beoordelen twee tot drie druppels van de target-probe toe aan de experimentele doorsneden. Om het RNA van belang te detecteren, wordt hier een probe gebruikt die gericht is op residuen 20 tot 1381 van muis a TF four RNA. Gebruik een pincet om parafilm over de preparaten te plaatsen om verdamping van de probe te voorkomen.

Plaats de objectglazen vervolgens in de bevochtigde objectglasbox in de hybridisatieoven en incubeer ze gedurende twee uur bij 40 °C. Nadat de incubatietijd is verstreken, worden de objectglazen twee minuten bij kamertemperatuur gewassen in een schaal met één x wasbuffer. Voeg daarna twee tot drie druppels amplificatiereagens a MP one fl toe aan elk hersensegment.

Dek vervolgens af met verse parafilm, plaats de dia's in de dia-doos en incubeer deze gedurende 15 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven. Nadat de dia's zoals voorheen zijn gewassen, worden twee tot drie druppels amplificatiereagens A MP four fl aan elk hersensegment toegevoegd en wordt dit afgedekt met parafilm. Incubeer de dia's in de dia-doos gedurende 15 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven.

Was de objectglazen twee keer met een 1x wasbuffer gedurende telkens twee minuten bij kamertemperatuur. Bedek na de laatste wasbeurt, zoals voorheen, elk preparaat met 100 tot 200 µL blokkeringsoplossing bestaande uit 3 mg/mL BSA, 100 mM glycine en 0,25% Triton X 100 in PBS. Dek elk objectglas af met parafilm en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie 100 tot 200 µL antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing, toe aan de objectglazen. Hier wordt een anti-cholineacetyltransferase-antilichaam gebruikt. Dek de objectglazen af met parafilm en incubeer gedurende twee dagen bij 4 °C.

Zorg ervoor dat de hersensecties niet uitdrogen; indien nodig wordt de anti-CHATT-antilichaamoplossing 24 uur na de incubatie opnieuw op de hersensecties aangebracht. Was de coupes vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in 1x PBS. Voeg bij kamertemperatuur 100 tot 200 µL van het juiste Alexa-geconjugeerde secundaire antilichaam toe aan de coupes.

Dek af met param en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Was de coupes na afloop van het uur drie keer in 1x XPBS gedurende vijf minuten per wasbeurt, zoals voorheen, en was daarna één keer met gedestilleerd water. Monteer de coupes met montagemedium dat DPI bevat en visualiseer vervolgens de hersencoupes onder de fluorescentiemicroscoop.

Nadat de formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde menselijke hersenmonsters zijn klaargemaakt volgens de instructies in het schriftelijke gedeelte van het protocol, wordt de hitte-geïnduceerde antigeen-unmasking uitgevoerd door de coupes onder te dompelen in hete pre-treat twee-oplossing en 15 minuten te koken. Na drie tot vijf keer wassen in gedistilleerd water en drie tot vijf keer in verse 100%ethanol, worden de coupes vijf minuten bij kamertemperatuur gedroogd om de protease-geïnduceerde antigeen-unmasking uit te voeren. Voeg vier druppels pretreat drie toe, dek af met perfil en incubeer 30 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven. Was vervolgens drie tot vijf keer in gedistilleerd water.

Voeg, zoals voorheen, vier druppels van de DAP B-sondeset toe aan de controle-hersensneden om de achtergrondkleuring te beoordelen en vier druppels van de target-sondeset aan de experimentele secties. Plaats het paar met folie afgedekte objectglazen in de objectglasbox en incubeer deze gedurende twee uur bij 40 °C in de hybridisatieoven. Nadat de stappen in het geschreven protocol zijn gevolgd om het DAB-signaal voor het mRNA van belang te ontwikkelen, wordt onder een lichtveldmicroscoop gecontroleerd op de aanwezigheid van een signaal.

Definieer referentiegebieden in de hersenmonsters waarin de aanwezigheid van puncta gedurende de tegenkleuringsprocedure kan worden gemonitord. Voor de tegenkleuring: plaats de objectglazen eerst in Luxol Fast Blue dat is voorverwarmd tot 60 °C en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 60 °C.

Spoel de preparaten na de incubatie meerdere keren af met gedestilleerd water en dompel ze vervolgens meerdere keren in een 0,05% lithiumcarbonaatoplossing om de differentiatie te starten. Dompel de preparaten daarna twee keer in verse 75% ethanol en spoel ze af met gedestilleerd water. Controleer de hersensecties onder een lichtveldmicroscoop.

Let op dat grijze en witte stof onderscheidbaar moeten worden en dat RNA-granules nog steeds zichtbaar zijn als donkerblauw-zwarte puncta. Controleer of axonen beginnen te verschijnen als lichtblauwe vezels; herhaal de luxal blue-kleuringsprocedure door te incuberen met luxal blue in stappen van 10 tot 20 minuten, waarbij de tegenkleuring en de aanwezigheid van RNA-granules zorgvuldig worden gemonitord tot de optimale kleuring is bereikt. Plaats de gespoelde coupes na de incubatie in een kristalvioletoplossing en incubeer deze gedurende 10 minuten.

Spoel de objectglazen met gedestilleerd water. Dompel de objectglazen vijf tot 10 keer in 70% ethanol en dehydrateer ze vervolgens via drie snelle wissels van 100% ethanol in een zuurkast. Klaar de hersensecties door deze tweemaal te incuberen in xyleen.

Alternatief klaarmaakmiddel gedurende twee minuten en een derde maal gedurende vijf minuten. Monteer de hersensecties bij kamertemperatuur in een permanent monteermiddel op basis van xyleen en analyseer deze onder een lichtveldmicroscoop. De vis werd behandeld met protease-geïnduceerde onmaskering, gevolgd door antilichaamdetectie van choline acetyltransferase, weergegeven in het rood.

Het antilichaam herkende chat niet wanneer er een proteasebehandeling werd uitgevoerd. Voorbeelden van resultaten verkregen met een niet-doelspecifieke probe en de ATF4-doelspecifieke probe, gebruikmakend van dezelfde microscoopinstellingen en beelaanpassingen, worden getoond. Groene ATF4-positieve granules met onduidelijke axonale lokalisatie zijn aangegeven met vraagtekens.

Blauwe gebieden zijn dappy-gekleurde kernen wanneer de visprocedure werd uitgevoerd met behulp van hitte-geïnduceerde antigeen-unmasking; immunofluorescente kleuring, opnieuw weergegeven in rood, was succesvol. TF four-positieve granules gelokaliseerd in axonen verschijnen oranje en zijn gemarkeerd als okay; de axonen werden tegengekleurd met luxal.

Fast blue en neuronale SOTA werden tegengekleurd met crestal violet suboptimal luxal. Fast blue-kleuring kan optreden als de temperatuur wordt verlaagd. Hier werden de monsters vier uur lang gekleurd met luxal fast blue bij 40 °C.

Vier a TF four-positieve korrels met onduidelijke accidentele lokalisatie zijn aangegeven met vraagtekens. Suboptimale kleuring treedt ook op wanneer de intensiteit van de tegenkleuring niet wordt gecontroleerd na korte incubatieperioden, zoals hier te zien is. Voorbeelden van optimale LFB-kleuring in combinatie met ish met gebruik van een non-target probe of de a TF four-targetprobe worden hier getoond.

De beeldacquisitie werd automatisch aangepast voor de beste signaal-ruisverhouding. Axon lokaliseerde vier TF-granules die als correct zijn gemarkeerd. Eenmaal voltooid.

Deze techniek kan in één tot drie dagen worden uitgevoerd, afhankelijk van de gekozen tegenkleuringsmethode na de ontwikkeling. Deze techniek stelt neurowetenschappers in staat om mRNA-translatie en lokalisatie in detail te onderzoeken.