Detectie van Axonally Gelokaliseerde mRNA in Brain secties met behulp van High-Resolution In Situ Hybridisatie

Het algemene doel van het volgende experiment is om per ongeluk gelokaliseerde mRNA's in volwassen hersenmonsters te detecteren. Dit wordt bereikt door de monsters voor te behandelen. De monsters worden door middel van koken en protease-vertering ontdaan om de mRNA-moleculen te ontmaskeren. Als tweede stap wordt hybridisatie uitgevoerd, gevolgd door amplificatie- en detectiestappen, die de visualisatie van het mRNA van belang mogelijk maken.

Vervolgens worden axonen gekleurd met antilichamen of kleurstoffen om te verifiëren dat het mRNA van belang gelokaliseerd is in axonen. De resultaten tonen de aanwezigheid van een TF vier mRNA in hersenmonsters met behulp van verschillende ontmasked procedures en tellers, kleurmethoden gebaseerd op microscopieanalyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in de neurowetenschappen, zoals welke mRNA's gelokaliseerd en getransleerd worden zonder exons.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in intracon-eiwitsynthese, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals dendrieten en niet-neuronale cellen en weefsels waarin mRNA-lokalisatie plaatsvindt. Na het fixeren van hersensneden, volgens de instructies in het schriftelijke protocol, bereid een coplan-pot voor met 60 milliliter antigeenherstel-oplossing en dompel de slides in de oplossing. Vul vervolgens een liter beker met gedistilleerd water en plaats deze in de magnetron om de hitte te bufferen.

Bij het uitvoeren van ontmask plaats de coplan-pot met de slides en herstel-oplossing in de magnetron. Kook de slides gedurende vijf minuten op hoog vermogen. Direct nadat de oplossing is gestopt met koken, verwarm de slides opnieuw gedurende vijf minuten op hoog vermogen.

Laat de slides afkoelen op kamertemperatuur. Na afkoeling dompel de slides in een schaal met PBS om ze te wassen en herhaal de wassing nog twee keer. Na het wassen, plaats de slides op een vlakke ondergrond en voeg twee tot drie druppels of 100 microliter DAP B.Probe toe aan twee of drie hersensecties als controle. Om achtergrondkleuring te beoordelen, voeg twee tot drie druppels van de targeterende sonde toe aan de experimentele secties. Om het RNA van belang te detecteren, wordt hier een sonde gebruikt die targeterende residuen 20 tot 1381 van muis a TF vier RNA is. Gebruik pincetten om param over de slides te plaatsen om verdamping van de sonde te voorkomen.

Plaats vervolgens de slides in de bevochtigde slidebox in de hybridisatieoven en incubeer ze gedurende twee uur op 40 graden Celsius. Na het verstrijken van de incubatietijd, was de slides in een schaal met één x wasbuffer gedurende twee minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens twee tot drie druppels amplificatiemiddel a MP een fl toe aan elke hersenslice.

Bedek vervolgens met vers parafilm, plaats in de slidebox en incubeer gedurende 15 minuten op 40 graden Celsius in de hybridisatieoven. Na het wassen van de slides zoals eerder, voeg twee tot drie druppels amplificatiemiddel A MP vier fl toe aan elke hersenslice en bedek met perfil. Incubeer de slides in de slidebox gedurende 15 minuten op 40 graden Celsius in de hybridisatieoven.

Was de slides twee keer met één x wasbuffer gedurende twee minuten elk op kamertemperatuur. Zoals eerder, volgend op de laatste wassing, bedek elke slice met 100 tot 200 microliter blokkeringsoplossing die drie milligram per milliliter BSA, 100 millimolair glycine en 0,25% Triton X 100 in PBS bevat, bedek elke slide met paraform en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na de incubatie 100 tot 200 microliter antilichaam verdund in blokkeringsoplossing toe aan de slides. Een anti-choline acetyltransferase antilichaam wordt hier gebruikt. Na het bedekken van de slides met perfil, incubeer gedurende twee dagen op vier graden Celsius.

Zorg ervoor dat hersensneden niet uitdrogen, indien nodig, breng 24 uur na incubatie opnieuw anti CHATT-antilichaamoplossing aan op hersensneden. Na het wassen van de slides drie keer in een XPBS gedurende vijf minuten. Voeg bij kamertemperatuur 100 tot 200 microliter van de geschikte Alexa-geconjugeerde secundaire antilichaam toe aan de slides.

Bedek met param en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur terwijl beschermd tegen licht. Was de slides drie keer in een XPBS gedurende vijf minuten elk, zoals eerder, en was vervolgens één keer met gedestilleerd water. Monteer de slides met montagemedium dat DPI bevat en visualiseer vervolgens de hersensneden onder de fluorescentiemicroscoop.

Na het voorbereiden van formele en gefixeerde paraffine-ingebedde menselijke hersenmonsters, volgens de instructies in het schriftelijke deel van het protocol, voer hitte-geïnduceerde antigeenontmaskering uit door de slides in hete voorbehandeling twee-oplossing te dompelen en gedurende 15 minuten te koken. Na het wassen drie tot vijf keer in gedestilleerd water en drie tot vijf keer in vers 100%ethanol, laat de slides gedurende vijf minuten op kamertemperatuur drogen om protease-geïnduceerde antigeenontmaskering uit te voeren. Voeg vier druppels voorbehandeling drie toe, bedek met perfil en incubeer gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius in de hybridisatieoven. Was vervolgens drie tot vijf keer in gedestilleerd water.

Zoals eerder, voeg vier druppels van de DAP B-sondeset toe aan controlehersensecties om achtergrondkleuring te beoordelen en vier druppels van de targeterende sondeset aan de experimentele secties. Plaats het paar met film bedekte slides in de slidebox en incubeer gedurende twee uur op 40 graden Celsius in de hybridisatieoven. Na het volgen van de stappen in het schriftelijke protocol om het DAB-signaal voor het mRNA van belang te ontwikkelen, controleer op de aanwezigheid van een signaal onder een helderveldmicroscoop.

Definieer referentiegebieden in de hersenmonsters waarin u de aanwezigheid van puncta gedurende de counterkleuringsprocedure kunt controleren. Om te counterkleuren. Plaats eerst de slides in luxal fast blue voorverwarmd tot 60 graden Celsius en incubeer gedurende 30 minuten op 60 graden Celsius.

Na de incubatie, spoel de slides