Mouse Model van Allo-immuun geïnduceerde Vascular Afwijzing en Transplant Aderverkalking

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een end-to-end aortageeftransplantatie bij muizen om vasculaire afstoting en transplantatie-arteriosclerose te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst een segment van de abdominale aorta van de donormuis te oogsten. Vervolgens wordt dit segment orthotoop getransplanteerd in de intrarenale aorta van een allogene ontvanger die genetisch verschilt van de donor.

In de laatste stap wordt het getransplanteerde vaatsegment weggesneden en geanalyseerd op de ontwikkeling van transplantatie-arteriosclerose. Uiteindelijk kan de mate van transplantatie-arteriosclerose en immuungemedieerde vasculair allograft-afstoting worden beoordeeld door de meting van de intimale verdikking en luminale vernauwing, evenals door immunohistochemische analyse van het weefsel op de accumulatie van immuuncellen.

Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn aan deze procedure tijd nodig om vertrouwd te raken met de microsurgische techniek, omdat het een hoog niveau van behendigheid en oefening vereist om deze te beheersen. Desalniettemin zou de methode voor de meeste onderzoekers bereikbaar moeten zijn met consistente oefening. De procedure wordt daarom gedemonstreerd door Ms. Winnie, een getalenteerde neurochirurg, en Adam Roso, een getalenteerde PhD-student in mijn lab. Begin met het plaatsen van de donormuis in rugligging op een schoon, dun plexiglas bord dat is omwikkeld met een steriel laken onder de operatiemicroscoop bij een 8,30 x vergroting.

Bevestig eerst dat de chirurgische anesthesie adequaat is door middel van een knijptest bij de teen, en maak vervolgens met een steriele schaar een enkele mediane incisie van het schaambeen tot het ZipID-proces. Gebruik daarna een kleine retractor om de buikwand te openen en zo de buikholte bloot te leggen. Gebruik vervolgens steriele wattenstaafjes om de darmen voorzichtig superieur naar links van het dier te verschuiven.

Bedek het weefsel met gaas bevochtigd met zoutoplossing en verschuif de voortplantingsorganen inferieur om de aorta infrarenalis en de vena cava inferior of VCI te lokaliseren. Gebruik nu medische pincetten nummer vijf om de aorta te scheiden van de VCI bij de linker nierslagader nabij de bifurcatie. Gebruik vervolgens 10-0 polyamide monofilament hechtingen om de kleine vertakkingen nabij de aorta af te binden.

Wanneer de aorta en de vena cava inferior (VCI) van de donor zijn gescheiden, verzadigt u het vat met zoutoplossing, bedekt u de blootgelegde holte met vochtig gaas en plaatst u de donor in een steriel gebied. Plaats nu de recipiëntmuis onder de microscoop en scheid de aorta van de recipiënt van de VCI zoals zojuist is gedemonstreerd. Plaats vervolgens twee microvasculaire klemmen van vier millimeter, proximaal en distaal van het betreffende segment, met een onderlinge afstand van ongeveer vijf millimeter.

Maak vervolgens met diverse buisvormige microscharen een enkele horizontale aortotomie en resecteer niet meer dan 0,5 millimeters van de abdominale aorta om plaats te maken voor het donor-aortagraft. Plaats de donor terug onder de microscoop en transecteer een graftsegment van drie tot vier millimeter, zoals zojuist gedemonstreerd. Gebruik daarna een 25 gauge 5/8 naald om de geëxcideerde aorta te spoelen met gehepariniseerde zoutoplossing.

Zorg ervoor dat de naaldpunt het vat niet raakt en plaats het vat in een container met hepariene ijszoutoplossing op ijs. Plaats het donor-aortagraften binnen 30 minuten na de excisie in de orthotope positie bij de ontvanger, waarbij de respectieve anatomische oriëntatie van het graft wordt afgestemd op die van de ontvanger. Pak vervolgens voorzichtig de tunica externa van het vat vast en gebruik de pincet nummer vijf om deze lichtjes weg te buigen.

Gebruik nu de pincet om een naald, bevestigd aan een 10-nul polyamide monofilament hechtmateriaal, door de volledige dikte van de vaatwand te drijven om het donor-aortagraft te fixeren aan het geresecteerde vat van de ontvanger voor het plaatsen van continue hechtingen. Positioneer fixatiehechtingen op negen uur aan zowel het bovenste als het onderste uiteinde van het graft. Begin vervolgens aan het bovenste uiteinde van het graft vanaf de anastomose op drie uur.

Hecht de geresecteerde uiteinden met twee doorlopende hechtingen en bevestig de hechting aan de fixatiehechting. Draai vervolgens het transplantaat om en zet de doorlopende hechting voort naar het dorsale deel van het vat, tot aan de oorsprong.

Zet de hechting vast. Bevestig de hechting zonder veel druk op het vat uit te oefenen en herhaal het hechten voor de onderste anastomose. Zodra de anastomose voltooid is.

Laat de distale microvasculaire klem los om retrograde bloedstroom door het vat mogelijk te maken. Indien er geen bloeding wordt waargenomen, laat dan de proximale klem los. Indien er geen bloedobstructies worden waargenomen, gebruik dan een pincet om voorzichtig één uiteinde van de hechtingsdraden vast te pakken en het vat lichtjes opzij te bewegen om de achterwand van het vat te inspecteren.

Er mag geen plooiing waarneembaar zijn. Indien een krachtig pulserend patroon wordt waargenomen in zowel de donor- als de recipiëntvaten, gebruik dan wattenstaafjes om de darmen terug in de buikholte te plaatsen. Sluit tenslotte de buikwand met een naaldhouder en grove pincetten met 5-0 polypropyleen hechtingen en een doorlopende hechting. Sluit de huidlaag met dezelfde hechtingen middels een subcuticulaire sluiting.

De motorische functie van de achterpoten kan worden geobserveerd om het succes van de operatie te beoordelen. De mate van immuun-gemedieerde vasculaire schade aan het allograft wordt onderzocht door de intimale verdikking en luminale vernauwing in de gegrafted aortasegmenten te kwantificeren op dag 30 na transplantatie.

Zoals waargenomen, ontwikkelen de allograft-arteriesegmenten aanzienlijke intimale verdikking en luminale occlusie, terwijl er geen veranderingen worden waargenomen in de ISO-graft-controlearteriesegmenten. Daarnaast kan de rekrutering van leukocyten in de allograft-arterie worden geëvalueerd door middel van immunohistochemie, door de accumulatie van CD4- en CD8-positieve T-cellen en macrofagen te onderzoeken. Zoals verwacht werden alle drie de typen immuuncellen aangetroffen binnen de intima van de donorarterieweefsels na ontwikkeling.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het vakgebied van transport om allo-immuungemedieerde vasculaire reductie en transplantatie-arteriële sclerose te bestuderen.