Isolatie en karakterisering van Satellite Cellen van Rat Head Branchiomeric Spieren

Het algemene doel van deze procedure is om satellietcellen te isoleren uit representatieve spieren afkomstig van de eerste, tweede en vierde brachiale bogen voor hun cultivering op een extracellulaire matrix. Gelplekken. Dit wordt bereikt door eerst de massacre-, digastricus- en levada vli palatine-spieren van een jonge volwassen rat te disseceren.

In de tweede stap worden de satellietcellen uit elk spiermonster geïsoleerd door middel van enzymatische vertering en duur. De cellen worden vervolgens gekweekt op de extracellulaire matrixgels. Uiteindelijk kan de dynamische toestand van myogenese van de satellietcellencultuur worden gevolgd door middel van kleuring voor de spiermarkers van belang.

Een gespleten lip en gehemelte is een van de meest voorkomende c-craniofaciale misvormingen bij mensen. Wanneer een spleet aanwezig is, is chirurgische reparatie nodig om het defect te sluiten en een normale spraakontwikkeling mogelijk te maken. Fibrose en defecte spierregeneratie kunnen echter de functionele herstel van de zachte gehemeltespieren belemmeren. Na reparatie van een gespleten gehemelte kunt u een innovatieve methode demonstreren voor de kweek van vers geïsoleerde satellietcellen met behulp van exocellulaire matrixgelplekken met een grootte van slechts millimeter.

Dit voorkomt de vereiste voor expansie. Plaats acht welbuisjes in een 100 millimeter petrischaal en zet de schaal op een koude oppervlakte en breng deze een dag vóór de isolatie aan. Na 10 minuten gebruikt u een voorgevulde micropipet om een enkele druppel van 10 microliter extracellulaire matrixgel in elk putje te doseren.

Nadat de dia's nog zeven minuten zijn gekoeld, verwijdert u het resterende gel volledig en laat u de putjes 's nachts op 37 graden Celsius drogen. Om de massacrespier te disseceren, verwijdert u de huid van het hoofd van een negen weken oude rat en gebruikt u hypodermische naalden om het hoofd op zijn zij te fixeren. Op een siliconenpad isoleert u de parotisklier en de aangezichtszenuw en verwijdert u de klier.

Gebruik vervolgens een schaafmesje nummer 15 om voorzichtig de aangezichtszenuw te verwijderen. Identificeer de oppervlakkige kop van de masseterspier. Gebruik vervolgens een rechte pincet om de pees van zijn oorsprong bij het zygomatisch uitsteeksel te scheiden, gevolgd door voorzichtig snijden van de pees met dissererschaar.

Gebruik het schaafmesje om de oppervlakkige kop van de massacre te disseceren tot aan de invoeging bij de hoek en de onderste helft van het laterale oppervlak van de tak van de onderkaak. Om de achterste buik van de digastricusspier te disseceren, fixeert u het hoofd in rugligging met naalden en verwijdert u het onderhuidse vet dat zich boven zowel de sublinguale als de submandibulaire klieren bevindt. Breng vervolgens de voorste en achterste digastricusspierbuiken bloot en houd de voorste pees van de achterste buik vast met een rechte pincet en snijd voorzichtig de pees tot aan de oorsprong in de tympanische buler.

Om de levada vli palatino-spier te disseceren, lokaliseert u de stylo-halloide spier. Trek deze lateraal en verwijder voorzichtig het spierweefsel. Lokaliseer vervolgens de pees van de levada vli palatino die zich in de tympanische buler invoegt en disseceer deze voorzichtig.

Til vervolgens de slokdarm op van achter de luchtpijp. Identificeer het gebied van het zachte gehemelte waar de levada vli palato wordt ingebracht en snijd het spier los. Dompel vervolgens de spier onder in 70%ethanol en breng deze over in ijskoud PBS aangevuld met antibiotica.

Om de satellietcellen te isoleren, brengt u elke spier over in afzonderlijke putjes van een zesputjesplaat en snijdt u de weefsels in kleine stukjes van twee millimeter. Zorg ervoor dat u de spieren niet te veel hak. Vervolgens incubeert u de weefselfragmenten voorzichtig in 2,5 milliliter 0,1% pronase-oplossing per putje bij 37 graden Celsius gedurende 60 minuten met zacht schudden elke 20 minuten.

Wanneer de vezelbundels een verlosde uitstraling vertonen bij 2,5 milliliter DMEM aangevuld met paardenserum en antibiotica in elk putje en brengt u het verteerde weefsel over in afzonderlijke 15 milliliter conische buisjes. Draai de weefselslurries neer en decanteer de supernatanten. Voeg vervolgens vijf milliliter medium toe aan elke buis en homogeniseer het weefsel met een 10 milliliter plastic pipet.

Draai de weefsels opnieuw neer en breng de supernatanten over in nieuwe 15 milliliter conische buisjes. Voeg vervolgens nog vijf milliliter medium toe aan de buisjes en tri rateer de weefselstukken opnieuw totdat de fragmenten gemakkelijk door de pipet gaan. Na nog een centrifugatie brengt u de supernatanten over in de bijbehorende buisjes en filtert u de celsuspensies door 40 micrometer zeefjes in afzonderlijke 50 milliliterbuisjes.

Was de zeefjes met één milliliter DMEM voor maximale celafwinning. Draai vervolgens de cellen neer, resuspendeer de pelletjes in vers medium en tel de cellen om de geïsoleerde satellietcellen te kweken. Verdun vervolgens de celsuspensies tot 1,5 keer 10 tot de drie cellen per 10 microliter kweekmedium.

Voeg vervolgens 10 microliter cellen toe aan elk eerder bereid extracellulair matrixgelplekje en incubeer de gels bij 37 graden Celsius na zes uur. Voeg voorzichtig 400 microliter kweekmedium toe aan elk gelplekje en plaats de dia's weer in de incubator. Na drie dagen begint u met de differentiatie van de cellen met de toevoeging van het juiste kweekmedium onmiddellijk na isolatie.

Meer dan 90%van de vers geïsoleerde satellietcellen drukt pack zeven uit. Tegen dag vier worden pack zeven en MyoD uitgedrukt door de satellietcellen van alle spiergroepen. My OG wordt sterk uitgedrukt op dag zeven in alle spiergroepen. Vier dagen na het zaaien op de extracellulaire matrix, gelplekken, beginnen de proliferende cellen te versmelten en kleine multinucleaire myo-buizen te vormen, die op dag zeven en tien myosine zwaar ketting uitdrukken.

Lange