Name: Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer hoe intranasale vaccinatie met recombinante influenza vaccins mucosale immuniteit in chimerische muismodellen bestudeert. Deze methode analyseert dendritische celmigratie en CD8+ T-celproliferatie voor verbeterde vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Sergio Gómez-Medina voor uitstekende technische ondersteuning bij muizenexperimenten. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Leibniz Association en het Leibniz Center of Infection. A.L. is ontvanger van een pre-doctorale beurs van de Leibniz Graduate School.

Animal experimenten werden uitgevoerd volgens de goedgekeurde protocollen en volgens de richtlijnen van de Duitse dierenbescherming wet. Alle medewerkers uitvoeren van dierproeven doorgegeven opleidingen volgens categorie B of C van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations. 1. Generatie van recombinant levend verzwakt Influenza Vaccines door Reverse Genetics OPMERKING: De gedetailleerd protocol voor het genereren van recombinant influenzavirussen van reverse genetics is beschreven door de vorige studies 5 en buiten het bereik van dit rapport. In het kort wordt redding van koude aangepaste griepvaccins (CAV) gedaan in een klasse II bioveiligheid kast onder bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) insluiting, en omvat stappen hieronder. De transfectie en infectie protocol volgt die van Martinez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Genereer een reassortant koude aangepast influenzavirusvaccin gebruikt als achtergrond van de aan koude aangepaste stam A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), en het hemagglutinine (HA) en een gemodificeerde neuraminidase (NA) van de A / PR / 8/34 (H1N1) stam ( Figuur 1A). De wijziging in het NA-gen bestaat uit een PCR-gebaseerde vervanging van een geconserveerde sequentie in het eiwit steel (resten 65-72) van een korte cDNA sequentie die voor het kippen ovalbumine (OVA) afgeleide peptide SIINFEKL (Figuur 1B). De SIINFEKL peptide een zeer immunodominant peptide in de context van de H-2b MHC klasse I-beperkte reactie van C57BL / 6-muizen 12. </li><li> Plate 10 6 293T-cellen per putje in 6-well platen middels DMEM 10% foetaal runderserum (FBS) aangevuld met 1% penicilline / streptomycine (P / E). </li><li> Bereid plasmide transfectie mengsel: Voeg 1 pg van elk van de plasmiden die coderen voor PB2 cDNA, PB1, PA, NP, M, NS van influenza A / Ann Arbor / 6/60-stam en 1 ug van de plasmiden die coderen voor de NA -SIINFEKL enHA van influenza A / PR / 8/34. Add voorverwarmde OptiMEM (15 pl voor een eindvolume van 100 gl / putje). </li><li> Incubeer transfectie mix gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 100 ul van transfectiemengsel / putje en incubeer gedurende 16 uur bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Verander celmedia DMEM met 0,3% BSA 1% P / E bij 33 ° C en 5% CO2 gedurende 5 uur. </li><li> Voeg 10 6 influenza permissieve MDCK cellen in DMSO die 1 ug / ml trypsine uit runderen pancreas behandeld met L-1-Tosylamide-2-fenylethyl chloormethylketon (TPCK-trypsine). Handhaaf de 293T-MDCK co-kweken voor 2-3 dagen bij 33 ° C en 5% CO 2. </li><li> Verzamel supernatanten van MDCK-293T cellen co-kweken en duidelijk door centrifugatie bij 260 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Inoculeer 9-10 dagen oude kippen bevruchte eieren in steriele omstandigheden. Hiervoor maken een gat op de top van de eierschaal zoals aangegeven door Martinez-Sobrido et al. 5. </li><li> Bedek de eierschaal with gesmolten was met een wattenstaafje en incubeer de geënte kippeneieren gedurende 3 dagen bij 33 ° C. </li><li> Oogst de allantoïsvocht van de besmette bevruchte eieren: Was de eierschalen met 70% ethanol. Open het ei met een zeer zacht scheur in het bovenste gedeelte en verwijder de allantoïs membraan met steriele pincet. Gebruik een pipet 10 ml te verzamelen zoveel vloeistof mogelijk (gewoonlijk 6-10 ml). Centrifugeer bij 260 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het gewiste allantoïsvloeistof nieuwe buizen. </li></ol> 2. Tracking Vaccin-specifieke immuniteit <ol><li> Opsporen van peptide-dragende dendritische cellen (DCs) <ol><li> Voor muizen vaccinatie verdoven muizen met 5% isofluraan in zuurstof met een precisie vaporizer. Gebruik een pipet om 200 ul 50 ul PBS dat 10 3-plaque vormende eenheden (pfu) van het vaccin de SIINFEKL peptide via druppeltjes expressie direct naar muis neus toedienen. </li><li> Drie dagen na de vaccinatie, euthanize muizen via isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Til de muis huid op de middenlijn net onder de ribbenkast met een tang en snijd een kleine incisie door de huid met een schaar. Vanuit het oogpunt van de incisie, maak een 3-5 cm lange dwars door de huid naar beide kop en staart, vervolgens twee incisies 2 cm vanaf de middellijn zijwaarts van elk eind. Trek de huid naar de peritoneale holten en thoracale onthullen. Knip voorzichtig door de membranen rond het buikvlies aan de thorax bloot. </li><li> Om het mediastinum stuurde de diafragma en de onderkant van de kooi rib. Zoek en verwijder 2 mediastinale lymfklieren (MLNS), iets dorsaal en lateraal grenst aan de thymus, mediaal grenzend aan de brachiocephalicus slagader, in de buurt van de ventrale zijde van de luchtpijp. </li><li> Om de oogst van het MLNS gebruiken gebogen pincet. Plaats tang onder de lymfeklieren en trek ze voorzichtig omhoog. Plaats lymfeklieren in een 6-wells plaat met 1 ml DMEM en verwijder alle verbve of vetweefsel rond het knooppunt. <ol><li> Plaag elk monster grondig met twee 26 G naalden grenst aan 1 ml injectiespuiten. Om de lymfeklier plagen, houd hem neer met een naald tijdens het openbreken van de lymfeklieren met de andere naald. Wanneer dit goed gebeurt, geconcentreerd cellen barsten van de lymfeknoop gemakkelijk waargenomen in de media. Pass alle weefsel materiaal door een 70 um nylon filter om enkele celsuspensies te verkrijgen. </li></ol></li><li> Centrifuge enkele cel suspensies gedurende 10 min bij 260 xg in een gekoelde centrifuge. Resuspendeer de cel pellet in 2 ml van rode bloedcellen Lysing (RbCl) buffer om rode bloedcellen te lyseren. Laat lysis men gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Neutraliseren rbcL buffer via centrifugeren en cel resuspensie in 2 ml ijskoude PBS. </li><li> Plaat cellen in U-vormige 96-well platen in een concentratie van 10 7 cellen / ml in een uiteindelijk volume van 100 pi. </li><li> Voor flowcytometrieanalyse, blok cel Fc-receptoren met behulp1 ug anti-muis CD16 / CD32 antilichamen per 10 6 cellen gedurende 15 min op ijs. </li><li> Centrifuge borden en gooi supernatantia door bord te vegen. Incubeer afzonderlijke putjes met het oppervlak antilichaam combinatie van keuze. Typisch voor detectie van dendritische cellen in lymfklieren, de antilichaam cocktail moet omvatten: 0,25 ug anti-CD 11 c, CD 11 b 0,25 ug, 0,5 ug van MHC klasse II, 0,25 ug CD103 en 0,15 ug CD8a in een eindvolume van 100 ul. </li><li> Bij negatieve gating, voeg 0,25 ug anti-CD3, CD19, NK1.1 of een afstamming cocktail (Figuur 2A). Alternatieve gating strategieën en protocollen voor een juiste vergoeding van meerdere fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gevonden op de website van de immunologische Genome Project. Naast de oppervlakte markers gekozen, voeg 1 ug van een antilichaam tegen H-2Kb gebonden aan SIINFEKL aan de cocktail. Dit commercieel beschikbaar antilichaam zal visualisatie van DCs i toestaann die SIINFEKL peptide gebonden aan MHC klasse I oppervlakte </li><li> Incubeer de cellen met antilichamen tegen oppervlak 30 min op ijs. Bescherm plaat uit licht. Centrifugeer platen bij 260 xg gedurende 5 minuten en wassen met 2 ml PBS twee keer. Overdracht cellen om flowcytometrie buizen voor analyse. </li></ol></li><li> Evaluatie van het vaccin-specifieke T-cel proliferatie <ol><li> Verkrijgen van donor-T-cellen uit commercieel verkrijgbare TCR-transgene muizen (OT-I-muizen) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J) waarbij alle gegenereerde CD8 T-cellen specifiek voor het SIINFEKL peptide. Euthanaseren muizen met isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst de milt door het uitvoeren van een incisie in de buikholte. Plaats milt / s in 2 ml DMEM / milt en verwijder bindweefsel en vetweefsel. </li><li> Genereer enkele cel suspensies van milt na de in 2.1.2 en 2.1.3 beschreven procedure. </li><li> Om verder te verrijken de enkele celsuspensie op T-cellen, gelden magnetische kraal scheiding protocollenmet behulp van positieve of negatieve selectie procedures 12. Om donor van de ontvanger cellen te onderscheiden, gebruik congene muizen zodat bijvoorbeeld ontvangende muizen drukken de leukocyten marker CD45.1 terwijl donor T-cellen te uiten CD45.2 12. </li><li> Om T-cellen te labelen, incubeer ze in 1 ml PBS dat 5 uM carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) een optimale celdichtheid van 5 x 10 6 cellen / ml. Incubeer cellen gedurende 20 minuten bij 37 ° C beschermd tegen blootstelling aan licht. Na incubatie Centrifugeer cellen bij 260 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 3 ml foetaal runderserum (FBS) te neutraliseren CFSE. </li><li> Centrifugeer cellen bij 260 xg gedurende 10 min en resuspendeer in het toereikend volume PBS dat 100 pi oplossing bevat 2 x 10 6 cellen. Bezielen ontvanger congene muizen met 2 x 10 6 cellen / muis via retro-orbitale sinus injectie 13. </li><li> Euthanaseren ontvangende muizen op dag 3, 4 en 5 post-vaccinatie met behulp van isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst mediastinale lymfeklieren en voor te bereiden enkele celsuspensies voor flowcytometrie zoals aangegeven in 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identificeer donorcellen door kleuring van de eencellige suspensies in 100 ui van een antilichaam cocktail bevattende: 0,25 ug anti-muizen CD3, CD4 en CD8 antilichamen; 0,5 ug anti-muis antilichaam CD45.1 of CD45.2 (afhankelijk van het fenotype van donorcellen). Laat de FL-1 kanaal van de flowcytometer geopend (FITC) aan de verwatering profiel van CFSE 12 (figuur 2B) te bepalen. </li></ol></li></ol> 3. Chimère muizen Gene-specifieke Vaccin Reacties ontleden Opmerking: Het produceren van competitieve beenmerg middels chimaera DTR-gebaseerde muismodellen maakt discriminatie van celspecifieke functies tijdens immuunrespons op vaccins. Hier laten we een extra strategie welke combinatie van DTR-uiting donor cel met cellen uit knockout muizen toelaat om gen-specifieke functies te bestuderen tijdens de immuniteit in specifieke cel compartimenten. In het voorbeeld genereren we muizen met specifieke verwijdering van toll-like receptor 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DCs. <ol><li> Bereiding van beenmerg donorcellen <ol><li> Werken onder een bioveiligheidsniveau II kabinet. Vermijd verontreiniging door het gebruik van uitsluitend geautoclaveerd instrumenten. </li><li> Om beenmerg chimere muizen te genereren, gebruiken congene CD45.1 + C57BL / 6 vrouwelijke muizen als ontvangers en gebruik TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, of wt muizen die CD45.2 + als donor. Met congenic donor en ontvangende muizen maakt de differentiatie van donor en ontvanger cellen via stroomcytometrie en dit laat enting worden geëvalueerd. </li><li> Om donor beenmergcellen te verkrijgen, euthanaseren donor muizen met isofluraananesthesie gevolgd door cervicale dislocatie. Met een scherpe schaar voeren incisies rond de enkels, zodat de mOuse musculatuur wordt blootgesteld. </li><li> Met behulp van stompe tang trekken muis huid en vacht van de enkel in de richting van de heupen zodat beenspieren zichtbaar zijn. </li><li> Met scherpe schaar knippen muis benen op de hoogte van de heupen en boven de kop van het dijbeen. </li><li> Plaats benen op een petrischaal en op ijs. Werk snel en verwijder alle spieren aan de botten bloot. </li><li> Aparte bovenbenen en tibiae. Plaats botten in een oplossing van 70% ethanol gedurende 5 minuten om eventuele bacteriën te verwijderen en deze direct op een andere petrischaal met 5 ml serumvrij DMEM. Snijd bot eindigt met een scherpe schaar en spoel het beenmerg in de DMEM. Hiervoor spoelen 1 ml van DMEM in het bot door het met een 26 G naald bevestigd aan een injectiespuit 5 ml. Zorg ervoor dat de botten er wit uitzien (leeg) na het spoelen. </li><li> Verzamel alle beenmergcellen van donor muizen in 10 ml DMEM. Genereer enkele cel suspensies van beenmergcellen door het passeren van de oogst door een 70 um cel zeef. </li><li> Clear enkelvoudige celsuspensies van beenmergcellen door centrifugatie bij 260 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge. Resuspendeer celpellet in 10 ml PBS. Afbreken rode bloedcellen middels rbcL oplossing zoals beschreven in 2.1.3 en 2.1.4. </li><li> Telling beenmergcellen behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Beoordelen cel levensvatbaarheid door bepaling van dode cellen via trypaanblauw vlekken 13. Optimaal één enkel dier levert ongeveer 3 x 10 7 witte bloedcellen / muis met een levensvatbaarheid van ten minste 80%. </li><li> Bij totale beenmerg chimaera bereiden TLR-3 - / - en wt donorcellen. De optimale celconcentratie is 2 x 10 7 cellen / ml sinds 2 x 10 6 cellen in 100 pi PBS worden gebruikt voor transplantatie. Indien niet onmiddellijk gebruikt, behouden donorcellen bij -80 ° C met behulp van trage invriezen technieken en FBS met 10% DMSO. Voor de gemengde chimerische model, meng Langerin-DTR-donorcellen en TLR3 - / - </sup&gt; Donorcellen in een 75:25 verhouding. Bereid een mengsel van 75: 25 Langerin-DTR: wt beenmergcellen controlemuizen genereren. </li></ol></li><li> Mouse bestraling en transplantatie <ol><li> Bestralen vrouwelijke muizen tussen 6-8 weken oud in een Cesium-137 bron bestraler. Geef muizen twee doses van 550 rad 4 uur apart. Split bestraling minimaliseert acute levertoxiciteit en vermindert dus de muis dodelijkheid te wijten aan de bestraling protocol. </li><li> Na bestraling houden muizen onder behandeling met antibiotica gedurende twee weken. Geef antibiotica met het drinkwater op 2,5-5 mg Baytril / kg. </li><li> 2 - 4 uur na de tweede bestraling, transplantatie muizen met donor beenmergcellen intraveneus. Voer de injectie van donorcellen via retro-orbitale sinus injectie 13 en onder isofluraan anesthesie maximumwaarden volume van 100 ul PBS dat 2 x 10 6 cellen. </li><li> Vier weken na transplantatie evalueren engraftment in een monster van 100gl perifeer bloed via stroomcytometrie onder toepassing van een machine dat minstens twee kleuren lezen. Om onderscheid te maken tussen donor en radio-resistente ontvangende cellen, commercieel verkrijgbaar fluorescent gelabelde CD45.1 en CD45.2 anti-muis antilichamen met behulp van verdunningen tussen 1/100 en 1/200. Optimale enting van donorcellen ten minste 80% van hematopoietische cellen in perifeer bloed. </li></ol></li><li> Vaccinatie en doelgerichte uitputting <ol><li> Vaccineren muizen met recombinant levend verzwakt griepvaccin via intranasale. Voor muizen vaccinatie verdoven muizen met 5% isofluraan in zuurstof met een precisie vaporizer. Gebruik een pipet om 200 ul 50 ul PBS dat 10 3-plaque vormende eenheden (pfu) van het vaccin toe. </li><li> Bij het inbrengen muismodel genereren behandel muizen met 50 ng DT verdund in 50 pl PBS intranasaal. Dien DT druppel voor druppel rechtstreeks aan de neusgaten van verdoofde muizen, zoals beschreven in 3.3.1. Treat mice met dagelijkse doses begin van de behandeling op dag -2 voor de vaccinatie tot en met dag 2 na de vaccinatie (Figuur 3B). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understand+memory%2C+design+better+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understand memory, design better vaccines.</a> Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).</li>
<li>Gaucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+vaccine+induces+integrated+multilineage+and+polyfunctional+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses.</a> J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).</li>
<li>Querec, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approach+predicts+immunogenicity+of+the+yellow+fever+vaccine+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans.</a> Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+influenza+virus+from+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA.</a> J Vis Exp. 3, (2010).</li>
<li>Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tissues+Contain+CD141hi+Cross-Presenting+Dendritic+Cells+with+Functional+Homology+to+Mouse+CD103%2B+Nonlymphoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells.</a> Immunity. 37, 60-73 (2012).</li>
<li>Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+functional+specialization+of+dendritic+cells+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse.</a> Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+CD11c%2B+dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8%2B+T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17, 211-220 (2011).</li>
<li>Lahl, K., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+FoxP3%2B+Tregs+using+the+DEREG+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model.</a> Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).</li>
<li>Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+macrophages+reveals+distinct%2C+opposing+roles+during+liver+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).</li>
<li>Meredith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+zinc+finger+transcription+factor+zDC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of the zinc finger transcription factor zDC.</a> J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).</li>
<li>Girón, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Polyinosinic-Polycytidylic+Acid+Improves+Protection+Elicited+by+Replicating+Influenza+Vaccines+via+Enhanced+Dendritic+Cell+Function+and+T+Cell+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity.</a> J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22bib.usb.ve%22%5BJournal%5D)">Culture of animal cells: a manual of basic technique.</a> bib.usb.ve. , (1983).</li>
<li>Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+immunity+and+vaccination+strategies.+Comparison+of+the+immune+response+to+inactivated+and+live%2C+attenuated+influenza+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines.</a> Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).</li>
<li>Gowdy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD8%28%2B%29+T+cell+immunity+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+leads+to+persistent+and+severe+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection.</a> Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie beschrijven we hoe reverse genetics chimerische muismodellen kan worden gebruikt om de fysiologische en moleculaire mechanismen van door vaccin geïnduceerde immuniteit te helderen. Influenza reverse genetics is opgericht in veel laboratoria en heeft een hoofdrol in het begrijpen van influenza pathogenese, replicatie en transmissie 17 gespeeld. Een belangrijk punt in ons protocol is redding van koude aangepaste influenzavaccins uiting buitenlandse epitopen. Hoewel de strategie van integratie van...

Het genereren van immunologische geheugen in de afwezigheid van ziekte is de fysiologische basis van efficiënte vaccinatie 1. Onlangs zijn systemen-biologie gebaseerde benaderingen bleek dat succesvolle vaccins zoals gele koorts vaccin, induceert een sterke inductie van de aangeboren immuunrespons en activatie van verschillende subsets van dendritische cellen (DCs), die op hun beurt leiden tot activatie van antigeen multilineage specifieke T-cellen 2,3. Aangezien DCs de enige immuuncel populatie met de mogelijkheid om antigenspecifieke naïeve T-cellen activeren 4, de studie van hun functie tijdens de vaccinatie essentieel voor de immuunrespons op vaccins begrijpen en toekomstige strategieën te ontwikkelen tegen pathogenen uitdagend. Een systeem dat opsporing van verschillende DC subsets tijdens de immuunrespons op vaccins zou wenselijk zijn om een ​​nauwkeurige kinetiek van DC migratie naar lymfoïde weefsel vast te stellen en derhalve te voorzieninzicht in de fysiologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de initiatie van de vaccin-specifieke adaptieve immuniteit. Reverse genetica gebaseerde aanpak bieden de mogelijkheid genereren gemodificeerd levend-verzwakte vaccins die experimenteel kan worden met dit doel. Sinds de uitvoering ervan op influenza onderzoek, heeft-plasmide gebaseerde reverse genetics op grote schaal toegepast om recombinante influenzastammen inclusief LAIVs genereren. Standaardprotocollen te redden recombinante influenzavirussen vereist multi-transfectie van sterk transfectable cellijnen ambisense plasmiden (die zowel positieve als negatieve sense RNA) die de acht segmenten van influenza virus en amplificatie in een tolerante systeem zoals Madin-Darby Canine Kidney ( MDCK) cellen en / of geëmbryoneerde kippeneieren 5. De toepassing van reverse genetica moleculaire technieken genereren om de immune mechanismen van vaccinatiestudie blijft onontdekt. The generationvan nieuwe muismodellen waardoor specifieke uitputting van immuuncelsubklassen, inclusief DC, heeft geopend nieuwe mogelijkheden om de fundamentele immuun onderliggende mechanismen-vaccin ontlokte bescherming begrijpen. De vergelijking tussen DC subgroep functies in muis en mens is gebleken dat, voor een groot deel, muis en humane DCs functioneel homoloog 6,7 Deze bevindingen suggereren sterk dat de ontwikkeling van muismodellen om specifieke depletie van DCs in de steady state en bij ontstekingsaandoeningen, kan dienen om de fysiologie van DC responsen in mensen begrijpen. In de afgelopen jaren een aantal muismodellen zijn gegenereerd dragende transgenen tot expressie het simian difterietoxine (DT) receptor (DTR) onder de controle van het promotorgebied van een gen van interesse 8,9. Sinds muisweefsels nature niet uitdrukken DTR, deze modellen maken voorwaardelijke uitputting van de cel subsets die het doelwit gen van belang bij de muis inenting met DT. Aldus onze ability specifieke DCs en andere leukocyten in vivo afbreken tijdens fysiologische processen, is sterk verbeterd door de ontwikkeling van DTR-gebaseerde ro. Hoewel transgene muismodellen zijn uitgebreid toegepast om de ontogenie van het immuunsysteem begrijpen ervan op vaccinontwikkeling is nauwelijks onderzocht. Hier, door het combineren van influenza reverse genetics en DTR-gebaseerde competitieve beenmerg chimeren, stellen we een methode om de kinetiek van vaccinimmuniteit evenals individuele bestudering van genfunctie tijdens de immuunrespons op vaccins in vivo. De toepassing van deze technologie voor preklinische evaluatie van nieuwe vaccins tegen uitdagende infectieziekten kan bijdragen tot vaccinontwerp rationaliseren en vaccin gegadigden in vivo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&acute;s Modified Eagle Medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Embryonated eggs</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;M Nylon Filters</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td><td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&epsilon; (145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation dye</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin&nbsp;</td><td>Molecular probes&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>Diphteria Toxin (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo cell analysis software 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatic Cell Counter</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

intranasale toediening van recombinante influenza vaccines in chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccins zijn een van de grootste prestaties van de mensheid en hebben in de afgelopen eeuw miljoenen levens gered. Paradoxaal genoeg is er weinig bekend over de fysiologische mechanismen die immuunresponsen op vaccins mediëren, misschien vanwege het algehele succes van vaccinatie, wat de belangstelling voor de moleculaire en fysiologische mechanismen van vaccinimmuniteit heeft verminderd. Echter, verschillende belangrijke humane pathogenen, inclusief het influenzavirus, blijven een uitdaging voor vaccinatie en kunnen mogelijk baat hebben bij immuun-gebaseerde strategieën.
Hoewel influenza reverse genetics met succes is toegepast op de generatie van levend-geattenueerde influenzavaccins (LAIVs), is de toevoeging van moleculaire tools in vaccinpreparaten, zoals tracercomponenten om de kinetiek van vaccinatie in vivo te volgen, niet aangepakt. Daarnaast heeft de recente generatie muismodellen die specifieke depletie van leukocyten tijdens kinetiekstudies mogelijk maken, een raam van opportuniteit geopend om de basisimmuunmechanismen die ten grondslag liggen aan vaccin-geïnduceerde bescherming te begrijpen. Hier beschrijven we hoe de combinatie van reverse genetics en chimerische muismodellen kan helpen nieuwe inzichten te verschaffen in hoe vaccins werken op fysiologisch en moleculair niveau, als voorbeeld gebruikend een recombinant, koud-geadapteerd, levend-geattenueerd influenzavaccin (LAIV). We gebruikten in het laboratorium gegenereerde LAIVs met celtracers en competitieve beenmergchimere (BMCs) om de vroege kinetiek van vaccinimmuniteit en de belangrijkste fysiologische mechanismen verantwoordelijk voor het initiëren van vaccin-specifieke adaptieve immuniteit te bepalen. Daarnaast laten we zien hoe deze techniek genfunctiestudies kan vergemakkelijken bij enkele dieren tijdens immuunresponsen op vaccins. We stellen voor dat deze techniek kan worden toegepast om huidige profylactische strategieën te verbeteren tegen pathogenen waarvoor dringende medische tegenmaatregelen nodig zijn, bijvoorbeeld influenza, HIV, Plasmodium en hemorragische koortsvirussen zoals het Ebola-virus.

Generering van recombinant levend geattenueerde influenza vaccins kunnen worden bereikt door transfectie van plasmiden die coderen voor de acht segmenten van influenza virus onder controle van bidirectionele promoters 5. Een koude aangepast influenzavaccin bevat gewoonlijk zes segmenten van een aan koude aangepaste stam en de HA en NA van influenza-stam gekozen (bijvoorbeeld H1N1) (Figuur 1A). Het principe van aanpassing aan koude is gebaseerd op virus beperkte replicatie bij 33 ° C,...

Er is een algemene kennisgebrek over hoe vaccins werken. Hier stellen we het gecombineerde gebruik van omgekeerde genetica en botmerg chimerische muizen voor om inzicht te krijgen in de vroege gastheer immuunreacties op vaccins met een speciale focus op dendritische cellen en T-cel immuniteit.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van een systeem om de fysiologische initiatie van vaccin-specifieke adaptieve immuniteit te evalueren. Dit wordt eerst bereikt door middel van reverse genetica om levende, geattenueerde influenzavaccins te genereren die een specifiek immunogeen peptide bevatten, waarna een kiजembryo wordt gebruikt om het virus te vermeerderen. Vervolgens worden cellen geoogst uit de lymfeklieren van gevaccineerde muizen en wordt fax-analyse gebruikt om de migratie van dendritische cellen te volgen.In de volgende assay worden CD8-positieve T-cellen die reactief zijn voor het immunogene peptide gelabeld en geïnjecteerd in gevaccineerde muizen, gevolgd door FACS-analyse om de proliferatie van deze cellen te meten en de immuunrespons in meer detail te analyseren. Een competitieve beenmergchimeera wordt gemaakt door beenmergcellen die de difterietoxine-receptor tot expressie brengen in bestraalde congene muizen te infuseren, die vervolgens worden blootgesteld aan difterietoxine. Na een succesvolle deplete worden de muizen gevaccineerd en worden gelabelde antilichamen en tetrameren gebruikt om CD8-positieve T-cellen te identificeren.Het herkennen va

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Lenhard, A. et al. A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates a mouse co-infection model in which the influenza virus triggers the transition of Streptococcus pneumoniae from a colonizer to a pathogen. It outlines the steps involved in bacterial colonization, viral infection, and disease progression.

A Mouse Model to Study the Pathogenic Transition of Streptococcus pneumoniae Following Viral Co-Infection

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

This video demonstrates intranasal BCG immunization in mice, activating both innate and adaptive immune responses, leading to the development of lung-resident memory T cells and effector B cells, thus enhancing protection against Mycobacterium infections.

Intranasal Immunization with BCG in a Mouse Model

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

We demonstreren de procedure voor intra-tracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. Dit is een zeer nuttige tool om signaleringsroutes te bestuderen die luchtwegontsteking reguleren in muismodellen.

Intratracheale toediening van<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

In deze studie presenteren we een protocol voor het uitvoeren van twee-foton intravital beeldvorming en cel interactie analyse in de lymfkliertest tracheale mucosa na infectie met influenzavirus. Dit protocol is relevant voor onderzoekers bestuderen immuun cel dynamiek tijdens infecties van de luchtwegen.

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Dit protocol geeft instructies voor intranasale toediening van IAV en downstream-analyse van longbeschadiging bij muizen en bijbehorende transcriptionele veranderingen in longceltypen.

Modellering van dysplastisch en functioneel longalveolair herstel na griepinfectie

Leer hoe intranasale vaccinatie met recombinante influenza vaccins mucosale immuniteit in chimerische muismodellen bestudeert. Deze methode analyseert dendritische celmigratie en CD8+ T-celproliferatie voor verbeterde vaccinontwikkeling.

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Meer video's verkennen