Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie
12 mei 2015
Tijdens de postnataal ontwikkeling van de cerebellum, vertonen onrijpe granulecellen afkomstig uit de germinale zone verschillende modaliteiten van migratie om hun uiteindelijke bestemming te bereiken en neuronale netwerken te vestigen. Dit protocol beschrijft de bereiding van cerebellaire plakjes en de confocale macroscopische benadering die wordt gebruikt om de factoren die neuronale migratie reguleren te onderzoeken.
Het algemene doel van deze procedure is om migrerende neuronen in levende herfsneden te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst het cerebellum te dissecteren van een P 10 rat. De volgende stappen zijn het bereiden van acute cerebellumsneden en het labelen van de neuronen met een fluorescente sonde.
Vervolgens wordt het time-lapse experiment uitgevoerd door middel van macro confocale beeldvorming of confocale microscopie. De laatste stap is om de neuronen in de resulterende films te volgen. Uiteindelijk wordt ex vivo microscopie gebruikt om de rol van endogene factoren of giftige stoffen die neuronale migratie reguleren, te tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals confocale microscopie, is dat macro confocale beeldvorming het gevoel van zicht verhoogt van levende cerebrale kunstsneden direct geplaatst op de liesinzet. Ik had het idee voor deze methode toen ik problemen ondervond bij het overbrengen en stabiliseren van cerebrale kunstsneden voor confocale microscopie experimenten. Begin met toegang te krijgen tot de schedel van een onthoofdde P 10 rattenkop, gebruik fijne irisschaar om voorzichtig twee laterale incisies te maken van de basis tot het rostrale gebied van de schedel. Verwijder vervolgens de gedissecteerde schedel met twee nummer drie forceps, breek eventuele hechting tussen de hersenen en de schedel.
Schop nu de hersenen eruit met het lepeluiteinde van een spatel en doe ze in een 35 millimeter petrischaal met twee milliliters koude HBSS op ijs. Nu, onder een stereomicroscoop, isoleer het cerebellum van de hersenen door D-laceratieën met behulp van twee nummer drie forceps. Schep het cerebellum naar een nieuwe schotel met ijskoud buffer.
Vervolgens, met behulp van dezelfde gereedschappen, verwijder en gooi de resterende ruggenmerg en de schil membraan. Bereid een nummer drie solide scalpelhandvat voor met een nummer 15 chirurgisch mes. Gebruik het mes onder een stereomicroscoop om het cerebellum tussen de verus en de rechter hemisfeer te snijden.
Nu op de vibrato, doe een druppel cyanocrylaatlijm op de specimenschijf en wacht 15 tot 25 seconden tot het oplosmiddel is verdwenen voordat je het cerebellum naar de schijf overbrengt. Bevestig vervolgens de rand van het cerebellum aan de specimenschijf en wacht 10 seconden. Gebruik nu de manipulator om de specimenschijf in de bufferlade te steken zodat de transversale as van het cerebellum loodrecht staat op de meshouder.
Zorg ervoor dat de schijf wordt vastgezet met een aluminium moer. Bedek vervolgens het cerebellum voorzichtig met HBSS en laad gemalen ijs in het koelbad. Om het specimen te snijden, plaats een schoongemaakt mes zodat de rand zich net achter de achterste rand van het specimen bevindt.
Definieer dit als het startpunt voor het ijs. Gebruik vervolgens de voorwaartse opdracht om het eindpunt te definiëren als net voorbij de voorrand van het specimen. Stel nu de snededikte in op 180 micron.
Stel vervolgens de snedesnelheid in op 2,5 en de frequentie op acht en begin met het snijden van het specimen. Verzamel maximaal vijf sneden per cerebellum. Neem elke sectie op met behulp van een afgeknotte brede zwijnsborstel glaspijp.
Breng de secties over naar een schotel met koud HBSS op ijs. Nadat de plakken zijn verzameld onder een stereomicroscoop, verwijder voorzichtig de hersenvliezen met behulp van twee nummer vijf forceps. Scheid ook voorzichtig de LOEs voor een betere sondebelasting.
Na het snijden van het specimen, gebruik een afgeknotte brede zwijnsborstel pijp om ze over te brengen met wat HBSS naar een zes-welplaat met maximaal drie plakken in elk putje. Voeg vervolgens, nadat het medium in elke geladen put is geleegd, vijf milliliters laadoplossing toe met 10 micromolar van de fluorescente kleurstof om de monsters tegen licht te beschermen, bedek de plaat met folie. Zet vervolgens de plaat op een mutator ingesteld op 35 RPM.
Laat de plaat 10 minuten op kamertemperatuur incuberen om de kleurstof de cellen goed te laten labelen. Breng vervolgens de plakken zoals eerder naar het membraan van een transwell-inzet met drie microporiën. Zuig vervolgens het laadmedium af en laat alleen de plakken achter.
Verwijder nu de inzet en de plakken om de put te vullen met 1,9 milliliter DMEM. Plaats vervolgens de inzet terug en voeg nog eens 100 microliter DMEM toe om de weefsels te bedekken. Incubeer deze bereiding gedurende twee uur waarna korrelcellen zichtbaar zullen zijn.
Breng de plaat zonder deksel over naar een omgevingskamer met constante gasstroom op een confocale microscoop. Plaats vervolgens een glazen deksel op de plaatinzet van de confocale microscoop voor time-lapse experimenten. Laat de cellen twee extra uur in de kamer incuberen voordat u verder gaat.
Om de korrelcellen die migreren in de weefselsneden te visualiseren, verlicht u de bereiding met 488 nanometer licht en gebruikt u een twee x droge objectief. Detecteer fluorescente emissie van 500 tot 530 nanometer met behulp van image J.Voer voor elke afbeelding van de time-lapse film een Zack projectie uit met behulp van de standaarddeviatiemodus, pas de contrast en helderheidsniveaus van elke afbeelding aan zodat de gelabelde korrelcellen gemakkelijk te zien zijn. Kies nu de handmatige tracking plugin uit het deeltjeanalysemenu.
Gebruik de plugin om op het centrale punt van elk gelabeld cellichaam te klikken gedurende de time-lapse beeldsequentie. Exporteer vervolgens de ruwe trackinggegevens naar een spreadsheet voor verdere analyse. Herorganiseer de geëxporteerde ruwe trackinggegevens van Image J met een slim zelfgemaakt hulpmiddel dat elke cel en bijbehorende posities identificeert met behulp van het programma.
Bereken de totale afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid van migratie voor elke cel. In het vroege postnatale cerebellum vertonen korrelcellen significante veranderingen in hun migratiemodus en -snelheid terwijl ze verschillende corticale lagen overstaken. CTG-gelabelde korrelcellen in PM rat cerebellum weefselsneden werden onderzocht.
Zoals beschreven, migreerden de korrelcellen radiaal in de moleculaire laag met een gemiddelde
Overzicht
Deze studie richt zich op de migratie van onrijpe korrelcellen in het postnatale cerebellum, waarbij een confocale macroscopische benadering wordt gebruikt om neuronale beweging in levende hersencoupes te visualiseren. Het protocol beschrijft de preparatie van cerebellaire coupes en de factoren die de neuronale migratie beïnvloeden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuronale migratie
- Confocale microscopie
Achtergrond
- Korrelcellen migreren om neurale netwerken te vormen tijdens de ontwikkeling van het cerebellum.
- Inzicht in neuronale migratie is cruciaal voor het begrijpen van hersenontwikkeling en neurologische aandoeningen.
- Confocale microscopie maakt gedetailleerde visualisatie van het neuronale gedrag mogelijk.
- Ex vivo microscopie kan de effecten van diverse factoren op de neuronale migratie onthullen.
Doel van de studie
- Om de migratie van korreltcellen in het cerebellum te visualiseren.
- Om de invloed van endogene factoren en toxische stoffen op de neuronale migratie te onderzoeken.
- Om technieken voor het bestuderen van neuronale dynamiek in hersendoorsneden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissectie van het cerebellum van een P10-rat en bereiding van acute coupes.
- Labelen van neuronen met fluorescente probes voor visualisatie.
- Time-lapse imaging met behulp van macro-confocale microscopie.
- Tracking van neuronale beweging en analyse van migratiesnelheid en -afstand.
Belangrijkste resultaten
- Granulcellen vertoonden significante veranderingen in migratiepatronen en -snelheden over de corticale lagen heen.
- De gemiddelde migratiesnelheid in de moleculaire laag bleek 18 microns per uur te zijn.
- Toepassing van specifieke geneesmiddelen veranderde de migratiesnelheid van granulcellen significant.
- De resultaten bieden inzicht in de regulatiemechanismen van neuronale migratie.
Conclusies
- De studie visualiseert succesvol de migratie van korrelcellen in cerebellaire coupes.
- De bevindingen benadrukken de impact van endogene factoren op de neuronale beweging.
- Deze methode verbetert het begrip van de neuronale dynamiek tijdens de ontwikkeling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executives
Deze methode maakt real-time visualisatie van neuronale migratie in levende hersensnijden mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie bij de validatie van neurodevelopmentele targets. Door de migratiesnelheid en de dynamiek van de paden te kwantificeren, biedt het voorspellende zekerheid voor de evaluatie van compound-effecten op neuronale circuits. De aanpak slaat een brug tussen discovery biology en de preklinische beoordeling van neuroactieve stoffen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de migratie van korrelcellen te visualiseren als een functionele aflezing van de integriteit van neurale pathways.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door directe observatie van de effecten van endogene factoren en toxische stoffen op de celbeweging.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door migratieveranderingen te koppelen aan potentiële functionele tekorten in de cerebellaire circuitry.
Screening en assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door baseline migratiekinetiek in corticale lagen vast te stellen.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via kwantitatieve tracking van de totale afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid.
- Screening-gereedheid: Benadrukt de schaalbaarheid en het hergebruik van het platform voor betrouwbare evaluatie van verbindingen in time-lapse formaat.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele Continuïteit: Bespreekt de relevantie voor ziektebeelden door dysregulatie van migratie te koppelen aan tekortkomingen in diverse cerebellaire functies.
- Risicogebaseerde Vooruitgang: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van neuroactieve verbindingen.
- Predictieve Risicoreductie: Richt zich op mechanisch inzicht bij het evalueren van stoffen zoals alcohol of methylkwik op neuronale migratie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Plaatst de methode binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, ondersteund door het vermogen om migratie als functioneel eindpunt te meten.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie van neuronale migratiemechanismen ondersteunt.
- Screening: Beschrijft assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve outputs bij het volgen van de beweging van korrelcellen in reactie op verbindingen.
- Analytics: Benadrukt metingen, readouts of statistische outputs die teams helpen om migratiesnelheid en -afstand over verschillende condities te vergelijken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming, uitsluitend wanneer de bron dit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in neuronale migratiepaden.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van time-lapse imaging- en trackingprotocollen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologisch risico in een laat stadium bij het screenen van neuroactieve verbindingen.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van migratie-fenotypegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in neuroanatomie, fluorescente labeling en confocale microscopie.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder een klimaatkamer, een confocale macroscoop en Image J met tracking-plug-ins.
- Eisen aan standaardisatie tussen teams voor de preparatie van coupes, consistentie van de labeling en kwantificering van migratie.
- Overwegingen bij aanpassing aan verschillende modelsystemen, zoals variërende postnatale leeftijden of soorten.
- Praktische beperkingen onderbouwd door bronmateriaal, waaronder het venster van levensvatbaarheid van coupes en risico's op fototoxiciteit tijdens langetermijn-imaging.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Dissecting Cerebellums from P10 Rats
2:26
Preparing Acute Cerebellar Slices
4:27
Fluorescent Staining of Living Interneurons
5:44
Ex Vivo Imaging
6:27
Cell Tracking Using ImageJ
7:25
Results: Analysis of Granule Cell Migration
8:26
Conclusion
