Engineering 3D Cellularized Collageen Gel voor Vasculaire Tissue Regeneration

Het algemene doel van deze procedure is om buisvormige constructen te ontwikkelen voor weefselregeneratie in bloedvaten. Dit wordt bereikt door eerst type één collageen en gladde spiercellen te combineren in een cilindrische geometrie met behulp van een giettechniek. De tweede stap is om het construct in een speciaal ontworpen statische bioreactor te laten rijpen.

Vervolgens worden de volwassen constructen zorgvuldig geoogst en worden endotheelcellen geplaatst op het lumen van het construct met behulp van een roterende wand bioreactor actor. Uiteindelijk worden histologie, metabole tests en mechanische tests uitgevoerd om de eigenschappen van deze buisvormige constructen te evalueren. De originaliteit van deze techniek is dat het slechts één stap gebruikt om cellen en collageen te combineren om een weefselconstruct te produceren met gerichte mechanische eigenschappen zonder enige aanvullende fysieke of chemische behandeling.

Bovendien kan het construct gemakkelijk worden gemanipuleerd dankzij specifiek ontworpen grijpers, die de manipulatie en eindverbindingen mogelijk maken. Deze methode kan inzicht bieden in de interactie tussen cellen en extracellulaire matrix tijdens groei en remodellering voor weefselregeneratie in bloedvaten. Bovendien kan het worden toegepast voor een aantal gerichte weefsels, zoals pezen, huidtransplantaten, hartpatch en zenuwstelsel.

Om te beginnen met het fabriceren en assembleren van de statische bioreactor zoals beschreven in de bijbehorende tekstprotocol zijn details opgenomen over reservoir en gaas, grijperfabricage, manchetdop en de montage van de behuizingsmal en sterilisatietechnieken. Vervolgens worden varkens aorta gladde spiercellen uitgebreid in een 175 vierkante centimeter weefselkweekkolf tot ze 90%confluent zijn. Gebruik standaard kweektechnieken om de cellen te oogsten en hersuspendeer ze vervolgens bij 4 miljoen cellen per milliliter in compleet kweekmedium.

Combineer vervolgens één deel bufferoplossing, twee delen steriele collageenoplossing van vier gram per liter en één deel celsuspensie. Meet in deze volgorde de pH van het mengsel en zorg ervoor dat deze tussen pH 7,0 en 7,4 ligt. Giet vervolgens voorzichtig het celcollageenmengsel in de geassembleerde complexe behuizingsmal.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het mengsel zitten. Laat het collageengel een uur in een steriele omgeving op kamertemperatuur staan. Verwijder na een uur de behuizingsbuis en breng het construct voorzichtig over in het reservoir met 35 milliliter voorverwarmd kweekmedium.

Incubeer het construct in verticale positie gedurende één of twee weken van statische rijping. Ververs het kweekmedium om de twee dagen door het oude medium van de onderste septumpoort te aspireren en het reservoir op te vullen met een gelijkwaardige hoeveelheid vers kweekmedium. Als gewenst, verzamel één milliliter van zowel het oude als verse kweekmedium bij elke mediumwisseling voor biochemische analyse elke uur gedurende de eerste 12 uur en elke 24 uur daarna.

Verwijder het construct uit het kweekmedium onder steriele omstandigheden en plaats het loodrecht in de weg van een scannende laserinterferometer om de dikte van het construct te meten na een tot twee weken van statische rijping. Breng de bioreactor in een celkweekkap en verwijder voorzichtig het construct van zijn mandrel. Plaats het, eenmaal vrij, in een petrischaal van 100 millimeter diameter met 40 milliliter vers kweekmedium.

Richt vervolgens een micro mechanische tester in die is uitgerust met een belastingscel van vijf tot tien Newton en grijpers die zich uitstrekken tot in een bad van PBS gehouden op 37 graden Celsius. Verwijder het construct uit zijn petrischaal en verbind het met gespecialiseerde grijpharingen voor longitudinale tests en ontworpen om te verbinden met het gaasgedeelte van het construct zonder het gel te verpletteren. Gebruik Teflon-tape om te voorkomen dat de grijpharingen tijdens het testen wegglijden.

Monteer vervolgens het construct op de micro mechanische tester. Voer vervolgens een vermoeidheidstest uit op de longitudinale richting door het construct eerst uit te rekken tot de initiële maatstaaflengte en het daar 10 minuten vast te houden. Breng vervolgens 30 cycli van een 10%cyclische spanning aan met een snelheid van 5%per seconde.

Verhoog de spanning in incrementele stappen van 10%cyclische spanning tot het monster niet langer kan worden getest in de circumferentiële richting. Snijd eerst het monster in ringen van 10 millimeter lang. Monteer vervolgens de ringen op roestvrijstalen staven die in plaats van de grijpers worden gebruikt.

Zoals bij de longitudinale richtingtesten, rekt u het construct eerst uit tot de initiële maatstaaflengte en houdt u het daar 10 minuten vast. Breng vervolgens 30 cycli van een 10%cyclische spanning aan met een snelheid van 5%per seconde. Zodra het construct is gerijpt en het uit zijn mandrel is verwijderd, bevestigt u het construct met beide uiteinden aan het reservoir en plaatst u het in de reservoirsamenstelling.

Zoals hier getoond, vult u het exterieur van het reservoir met 30 milliliter kweekmedium. Vul vervolgens 75%van het luminale volume van het construct met een mengsel van eiwitten en sluit vervolgens beide uiteinden van het construct.

Om lekkage van de eiwitoplossing te voorkomen, plaatst u de bioreactor in een incubator en draait u de bioreactor gedurende één uur op 4,02 keer 10 tot de negatieve vijf GForce om het luminale oppervlak te coaten met eiwitten terwijl de lumin wordt gecoat. Oogst menselijke navelstrengslagaders en tial cellen gekweekt met standaardtechnieken wanneer ze 90%confluent zijn. Hersuspendeer de cellen en suppleteer M1 99 kweekmedium. Zie vervolgens de menselijke navelstrengslagaders en urotheelcellen in het lumen van het construct.

Met een dichtheid van 1000 cellen per vierkante centimeter, sluit u de bovenste uiteinden van het construct om lekkage van de celoplossing te voorkomen. Incubeer de constructen die in de roterende wand bioreactor worden gehost gedurende twee dagen bij een constante rotatie van 4,02 keer 10 tot de negatieve 5G kracht. Tijdens statische rijping van de vaatconstructen, werd de externe diameter van de cellulaire rijsconstructies snel verminderd.

Zoals hier getoond, we