Neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in serum-vrije monolaagkweek
14 mei 2015
Dit protocol beschrijft in detail de methode voor het genereren van neurale progenitoren uit embryonale stamcellen met behulp van een serumvrije monolaagmethode. Deze progenitoren kunnen worden gebruikt om rijpe neurale celtypen te verkrijgen of om het proces van neurale specificatie te bestuderen en is geschikt voor schaalvergroting in multiwell-formaat voor compound screening.
Het algemene doel van deze procedure is om embryonale stamcellen van muizen te differentiëren naar een neurale lijn in een serumvrije monolayer-celcultuur. Dit wordt bereikt door het cultuurvat eerst te coaten met gelatine. In de tweede stap worden de embryonale stamcellen geassocieerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen in differentiatiemedium en verdund tot de juiste plating-densiteiten.
In de laatste stap worden de cellen gezaaid op de met gel ENC gecoate plaat. Ten slotte wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om het succes van de differentiatie te bevestigen door visualisatie van de relevante neurale markers. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien het zaaien met de juiste dichtheid cruciaal is voor het bereiken van een goede differentiatie.
Er zijn verschillende factoren die de platingdichtheid zowel direct als indirect beïnvloeden. Warm vóór het uitplaten van de cellen een aliquot van 1% gelatine op in een waterbad van 37 °C tot het is opgelost. Meng de gelatine vervolgens met 500 milliliters warme PBS en bedek de bodem van de celkweekcontainer met net genoeg van de oplossing om het oppervlak te coaten terwijl de gelatine hecht.
Spoel de subconfluente cultuur van muis embryonale stamcellen twee keer met PBS. Voeg vervolgens één milliliter dissociatiereagens toe aan de cultuur. Tik na twee tot vijf minuten tegen het vat om de monoclaag los te maken tot een enkelcel-suspensie en verzamel de cultuur in een totaal volume van 10 milliliter medium en cel-dissociatiereagens.
Breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en centrifugeer deze. Na zorgvuldige aspiratie van het supernatant wordt het pellet vervolgens geresuspendeerd in 10 milliliter voorverwarmd N two B 27 door het pellet tegen de wand van de buis te tritiumeren. Tel vervolgens de cellen en noteer de concentratie; resuspendeer ze daarna in voorverwarmd N two B 27 op het juiste aantal cellen per volume-eenheid per well volgens de tabel, waarbij u voorkomt dat er bellen ontstaan.
Aspireer vervolgens de gelatine uit het kweekvat en zaai de cellen uit zonder de container te schudden. Plaats de culturen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% carbon dioxide. Vervang het medium elke één tot twee dagen.
Met vers N2 B27 zullen de cellen beginnen te differentiëren en SOX1-expressie vertonen binnen vier tot zes dagen om de cellen te kleuren voor immunofluorescentie-imaging. Verwijder het differentiatiemedium uit de culturen en fixeer de cellen in 500 µL 4% paraformaldehyde. Was en permeabiliseer de cellen na 15 minuten twee keer met 2 mL PBS met tween. Blok vervolgens eventuele aspecifieke binding door de cellen één uur te incuberen.
In één milliliter PBS-tween aangevuld met serum op een platen-shaker, nadat de cellen zijn gewassen zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg 500 microliters muis IgG tegen bèta drie tubuline toe aan de culturen voor een incubatie van één nacht op de platen-shaker bij vier graden Celsius. De volgende dag.
Incubeer de monsters na het wassen van de cellen in een fluorescentie-gelabeld anti-US IgG secundair antilichaam bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, met langzame schudbewegingen gedurende één uur. Spoel de cellen opnieuw en kleur ze vijf minuten lang met 500 microliters DPI. Bewaar de cellen tot slot, na een laatste wasbeurt, tot twee weken in PBS-tween bij vier graden Celsius.
Tot het moment van beeldvorming. In dit experiment werden embryonale stamcellen van muizen met een endogene SOX1 GFP-reporter gebruikt om de neurale differentiatie te volgen. Op dag zes werden de cellen gefixeerd en gekleurd voor de neuronale marker bèta III-tubuline.
Bij de optimale dichtheid differentieerden de cellen tot neurale progenitorcellen en neuronen, terwijl een hogere dichtheid leidde tot een afname van het aantal SOX1 GFP- en bèta-tubuline III-positieve cellen. Ook het volume van de celkweekcontainer beïnvloedt de optimale plating-dichtheid. Zo vereisen cellen die in een 96-wells plaat worden gekweekt een celdichtheid die ongeveer 10 keer hoger is dan deze.
De cellen zijn geplaatst in een kweekplaat met zes putjes om de optimale en twee verschillende confluenties van de celdichtheid te bereiken. Tijdens de differentiatie veranderen embryonale stamcellen geleidelijk van morfologie. In deze afbeeldingen kan bijvoorbeeld de morfologie van de cellen en koloniën worden waargenomen van dag één tot zes na het uitplaten bij de optimale celdichtheid.
Op dag vier beginnen de cellen neurale progenitorcellen te worden, wat blijkt uit de verschijning van een groen fluorescent signaal van de SOX1 GFP-reporter. Tegen dag zes zijn de meeste cellen SOX1-positief. Hoewel de aanwezigheid van enkele niet-neurale cellen wordt verwacht. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de neurale differentiatie van muizen-embryonale stamcellen in een monolaag celcultuur initieert.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft in detail de differentiatie van embryonale stamcellen van muizen tot neurale progenitors met behulp van een serumvrije monolayer-methode. Deze benadering maakt de generatie van volwassen neurale celtypen mogelijk en is geschikt voor opschaling naar multiwell-formaten voor compound-screening.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Stamcelonderzoek
Achtergrond
- Embryonale stamcellen kunnen differentiëren tot verschillende celtypen.
- Neurale progenitorcellen zijn essentieel voor het bestuderen van de neurale ontwikkeling.
- Serumvrije kweekmethoden kunnen de reproduceerbaarheid verbeteren.
- Een juiste platingdichtheid is cruciaal voor een succesvolle differentiatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het genereren van neurale progenitorcellen.
- Om de studie van neurale specificatieprocessen te vergemakkelijken.
- Om high-throughput screening mogelijk te maken naar verbindingen die de neurale differentiatie beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Het coaten van kweekvaten met gelatine.
- Het maken van een enkelcellige suspensie van embryonale stamcellen.
- Het uitplaten van cellen op de met gelatine gecoate platen.
- Het gebruik van immunofluorescentiemicroscopie om het succes van de differentiatie te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van embryonale stamcellen tot neurale progenitorcellen.
- Visualisatie van neurale markers bevestigt de differentiatie.
- Vaststelling van optimale platingdichtheden voor een effectieve differentiatie.
- De methode is schaalbaar voor toepassingen bij compoundscreening.
Conclusies
- De serumvrije monolaagmethode is effectief voor de generatie van neurale progenitorcellen.
- Immunofluorescentie is een betrouwbare techniek voor het beoordelen van differentiatie.
- Dit protocol kan worden aangepast voor diverse onderzoeksapplicaties in de neurowetenschappen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt de schaalbare generatie van neurale progenitorcellen uit embryonale stamcellen van muizen mogelijk in een gedefinieerd, serumvrij monoluersysteem, ter ondersteuning van vroege doelwitvalidatie en mechanische risicoreductie bij het ontdekken van geneesmiddelen voor neurowetenschappen. De methode biedt een reproduceerbaar, kwantitatief platform voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op neurale differentiatie, wat de identificatie van lead-verbindingen en het voorspellende vertrouwen in preklinische pijplijnen faciliteert. De compatibiliteit met reporterlijnen en cultuurformaten met een hoge dichtheid maakt integratie in screeningsworkflows voor pathway-modulatie en studies naar target-engagement mogelijk.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om neurale specificatiemechanismen te onderzoeken en neurodevelopmentale targets functioneel te valideren via gerichte differentiatie.
- Operationele waarde: Biedt een gedefinieerd, serumvrij systeem dat variabiliteit vermindert en de reproduceerbaarheid tussen experimenten en cellijnen verhoogt.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de beoordeling van door verbindingen geïnduceerde veranderingen in de opbrengst van neurale progenitoren en marker-expressie, wat inzicht geeft in target-engagement en pathway-modulatie.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een homogene populatie neurale progenitorcellen die geschikt is voor compound-screening en fenotypische beoordeling van neurale differentiatie.
- Operationele waarde: Aanpasbaar aan multiwell-formaten (bijv. 96-wells) met schaalbare optimalisatie van de plating-dichtheid, wat medium- tot high-throughput-toepassingen mogelijk maakt.
- Assay-gereedheid: Compatibel met immunofluorescentie, flowcytometrie en moleculaire read-outs voor multiparametrische analyse van differentiatie-efficiëntie en marker-expressie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt progressie mogelijk van de generatie van neurale progenitorcellen naar de rijping van functionele neuronen en glia, wat bijdraagt aan ziekterelevante modellering.
- Mechanistische risicoreductie: Vergemakkelijkt de studie van lineage-committing en differentiatiedynamiek door het gebruik van reporterlijnen (bijv. SOX1-GFP) om neurale specificatie in real-time te monitoren.
- Preklinisch nut: Maakt evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op neurale rijping en gliale differentiatie, ter ondersteuning van veiligheidsfarmacologie en studies naar het werkingsmechanisme.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking, waarbij targetvalidatie wordt ondersteund door mechanistische analyse van neurale differentiatie, en maakt assayontwikkeling mogelijk voor compoundscreening binnen neurowetenschappelijke portfolio's.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van neurodevelopmentale pathways en targetvalidatie via gerichte differentiatie en markergebaseerde readouts.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid in monolayerkweek mogelijk, waarbij de platingdichtheid een kritische parameter is voor een consistente generatie van neurale progenitorcellen.
- Analytics: Levert kwantitatieve resultaten via immunofluorescentie (bijv. SOX1-GFP, βIII-tubulin) en flowcytometrie om de differentiatie-efficiëntie en de respons op verbindingen te meten.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de vroege generatie van neurale progenitorcellen met de daaropvolgende rijping tot functionele neuronen en glia, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Een gedefinieerd, schaalbaar protocol ondersteunt hergebruik over meerdere ESC-lijnen, kweekvaten en screeningcampagnes, waardoor de inspanning voor herontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit in neurale differentiatiepaden te verminderen.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde, serumvrije condities verbeteren de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen laboratoria en cellijnen.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling mogelijk te maken van de effecten van verbindingen op de neurale lineage-commitment en differentiatie-efficiëntie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroscience-targets via mechanische risicoreductie en padvalidatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelcultuur, differentietechnieken en immunofluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van toegang tot CO2-incubatoren, centrifuges, microscopen en reagentia zoals gelatine, N2B27, dissociatiereagentia en antilichamen.
- Standaardisatie van de platingdichtheid en gelatinecoatingsprocedures tussen gebruikers en locaties is noodzakelijk om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende ESC-lijnen of reporterconstructen kan optimalisatie van de zaaidichtheid en differentietiming vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de gevoeligheid voor de platingdichtheid en de noodzaak voor zorgvuldige dissociatie van de monolaag om klontering of een incomplete enkelcellesuspensie te voorkomen.
