Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Het algemene doel van het volgende experiment is om de ruimtelijke colocalisering van doelparen kwantitatief te beoordelen, in dit geval het onderzoeken van door geneesmiddelen geïnduceerde receptortransport. Dit wordt bereikt door levende gekweekte cellen te behandelen met een geneesmiddel om gewijzigd receptortransport te induceren. Als tweede stap, dubbele immunolabeling van de doelreceptoren en intracellulaire transportcompartimenten maakt ruimtelijke lokalisatie van de doelparen mogelijk door meerkanaals confocale microscopie.

Kwantitatieve colocaliseringsanalyse wordt gebruikt om de neiging van de doelreceptoren en compartimenten te meten om op dezelfde plaats te worden gevonden. De resultaten tonen veranderingen in receptortransport na geneesmiddelbehandeling op basis van de colocalisering van receptoren en intracellulaire transportcompartimenten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals overlay-colocalisatie, is dat het gekwantificeerde maatregelen van colocalisering biedt, wat vervolgens veel krachtigere analyses en complexe experimentele ontwerpen mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in receptortransport, kan deze ook worden toegepast op veranderingen in de ruimtelijke colocalisering van vrijwel elk tweetal eiwitten in gekweekte cellen. Om deze procedure te beginnen, verwijdert u het oorspronkelijke groeimedium en vervangt u het door medium dat het geneesmiddel van belang bevat in de gekozen concentratie. Vervolgens incubeert u de cellen in de oorspronkelijke groeiomstandigheden gedurende de gekozen behandelingsduur.

Na incubatie, was de cellen voorzichtig met elk keer een milliliter wasbuffer gedurende drie keer. Fixeer de cellen met 300 microliter 4% para formaldehyde in 0,1 molair PBS gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de cellen opnieuw met elk keer een milliliter wasbuffer gedurende drie keer.

Vervolgens incubeert u de cellen in 300 microliter blokkeringsbuffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Daarna, incubeert u de cellen met primaire antilichamen in 300 microliter antilichaamverdunning gedurende 48 uur bij vier graden Celsius. Was vervolgens de cellen voorzichtig met elk keer een milliliter wasbuffer gedurende drie keer.

Vervolgens incubeert u de cellen met secundair antilichaam geconjugeerd aan Fluor in 300 microliter antilichaamverdunning gedurende een uur bij kamertemperatuur en bescherm de cellen tegen licht. Na een uur, was de cellen voorzichtig met elk keer een milliliter wasbuffer gedurende drie keer. Om de deksel van de 24 welplaat te verwijderen, houd de plaat onder een hoek van 45 graden.

Plaats de punt van een paar fijne pincetten aan de bovenrand van de deksel waar deze de bodem van de put ontmoet. Kantel vervolgens voorzichtig de deksel in de wasbuffer weg van de putbodem. De deksel zal tegen de putwand komen te liggen waar het gemakkelijk kan worden verwijderd met pincetten.

Monteer vervolgens de deksels met de cellen naar beneden op microscoopglazen met anti-vervagende montagemedium met behulp van een 100 x hoge vergroting objectief. Localiseer eerst een representatieve cel om te worden afgebeeld met behulp van epifluorescentie. Configureer vervolgens de instellingen voor beeldopname. Neem acht bit ongecomprimeerde tiff-beelden van elk gelabeld kanaal op om elk kanaal achtereenvolgens af te beelden en om vier tot zes scans voor het uiteindelijke beeld te gemiddelen.

Schakel vervolgens over naar het confocale beeldvormingspaad en focus op een Z-vlak door het centrum van de cel. Optimaliseer de pinhole-laservermogen en de spanning en offset van de fotomultiplierbuis voor elk kanaal. Noteer deze instellingen en gebruik dezelfde instellingen voor het beeldvormen van alle cellen gelabeld voor een gegeven doelpaar.

In dezelfde Replicaat volgende lokalerende cellen om te worden afgebeeld met een hoge vergroting objectief. Gebruik epifluorescentie, schakel over naar het confocale beeldvormingspaad en focus op een Z-vlak door het centrum van de cel indien beschikbaar. Gebruik de software zoom crop functie om het scangebied te beperken tot de cel van belang. Daarna.

Vang beelden voor elk gelabeld kanaal in met behulp van de eerder vastgestelde instellingen, en herhaal de procedures om 15 of meer cellen per conditie per replicaat af te beelden. Om voldoende monsterverzameling te garanderen. Open in deze procedure het paar afbeeldingen van een cel in image J. Gebruik de opdracht kanaal samenvoegen voor beeldkleuren om een RGB-beeld te genereren.

Teken vervolgens rond de cel van belang. Gebruik de image j-plugin de SC colocalisering om de colocalisering van de doelen in de geselecteerde cel te kwantificeren. Noteer de gewenste colocaliseringsmaat en herhaal de procedure voor elke beeldcel.

Bereken vervolgens het gemiddelde van de geregistreerde colocaliseringswaarden van de gemeenschappelijke controlecondities van elke replica van elke labelconditie. Vermenigvuldig de gemiddelden met min één om de offset voor elke replica in elke labelconditie te verkrijgen. Voeg vervolgens de offset voor elke replica in elke labelconditie toe aan elke colocaliseringswaarde in die replica.

Dit normaliseert de gegevens zodanig dat het gemiddelde colocaliseringsmaat voor de gemeenschappelijke controleconditie nul is in elke replica van elke labelconditie. Hierna zullen alle gegevens uit alle replica's van elke labelconditie de analyse van veranderingen in colocalisering tussen replica's mogelijk maken. Hier worden de primaire culturen van dorsale wortelganglion sensorische neuronen getoond die zijn blootgesteld aan langdurige en acute geneesmiddelbehandelingen. De cellen werden vervolgens immunogelabeld voor delta-opioïde receptoren en een marker van recycleringsendosomen met verschillende primaire secundaire antilichaamparen en werden afgebeeld door tweekanaals sequentiële confocale microscopie.

Naast de daaropvolgende kwantitatieve colocalisering en analyse, zijn deze representatieve afbeeldingen verwerkt om valsgekleurde colocaliseringskaarten te genereren die hier worden getoond. De gemiddelde colocaliseringsscores voor delta-opioïde receptoren en markeren van vroege endosomen, recycleringsendosomen en lysosomen, receptorcolocalisering met elk compartiment worden vergeleken tussen groepen die verschillende acute geneesmiddelbehandelingen ontvangen en worden geneesmiddelgeïnduceerde veranderingen in receptortransport waargenomen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het be