Name: Triggering Reactief gliosis In Vivo Door een voorhersenen Stab Injury (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer reactieve gliose induceren in de volwassen muizen voorhersenen via een stekenblessure. Deze methode maakt onderzoek naar gliale littekenvorming en GFAP-expressie mogelijk zonder extra apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedanken Katherine Clark voor technische assistentie. A.D.R.G. wordt gedeeltelijk gefinancierd door 5K01MH097957-03

Volwassen (3-4 maanden) mannelijke muizen op een gemengde C57BL / 6 achtergrond werden gebruikt in dit protocol. De dieren werden op een 12 uur licht / donker cyclus gehouden, en de vrije toegang tot voedsel en water. Alle procedures uitgevoerd in dit protocol werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Drexel University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. Voorbereiding Chirurgische omgeving <ol><li> Ontsmet chirurgische tafel met 70% ethanol en vervolgens de gehele chirurgische bank met absorberende kussentjes en regelen chirurgische instrumenten naast stereotaxisch. </li><li> Opzetten stereotaxische apparatuur zonder manipulator arm. Schik de verwarming pad op de stereotaxische en ingesteld op 37 ° C. Vermijd oververhitting van het dier door het plaatsen van een klein stukje papier handdoek of chirurgische pad tussen het dier en de verwarming pad. </li><li> Met geautoclaveerd schaar gesneden kleine stukjes geautoclaveerde gelfoam in een steriele petrischaal met 0,9% steriele zoutoplossing tot reaDY gebruikt. Opmerking: Handhaaf steriele werkomgeving met behulp van geautoclaveerd instrumenten en steriele chirurgische benodigdheden. Re-steriliseren chirurgische instrumenten tijdens de procedure of tussen de dieren door dompelen in een kraal sterilisator voor 10-15 sec, als dat nodig is. Handhaving van schone handschoenen tijdens de hele procedure door te wrijven handen met 70% ethanol, zoals nodig, ontsmet. </li></ol> 2. Prepping Muis voor Heelkunde <ol><li> Verwijder de muis uit huis kooi en weegt (g). </li><li> Place muis aan isofluraan inductie kamer en stelt zuurstof 2 l / min en isofluraan vaporizer tot 5 een chirurgische vlak van anesthesie, ongeveer 3-5 min induceren. Monitor voor vertraagde ademhaling en immobilisatie. Controleer of de muis is volledig verdoofd met behulp van de teen knijpen reflex. </li><li> Wanneer de muis is volledig verdoofd, plaatsen in stereotaxische frame, zet de neus in de neuskegel, die is verbonden met slang aan de isofluraan. Plaats oor bars in de gehoorgang en draai, zodat het hoofd is stabiel. </li><li> Scheer het hoofd van oor tot oor en van tussen de ogen om achter de oren. </li><li> Steriliseer de huid met afwisselende doekjes isopropylalcohol en betadine joodoplossing, 3 keer per. </li><li> Pas kunstmatige tranen in beide ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens de chirurgische ingreep. </li></ol> 3. Chirurgische Procedure <ol><li> Bewaken van de diepte van de anesthesie door knijpen de teen of staart. De muis in de juiste chirurgische vlak wanneer er geen respons en de ademhaling is traag en zelfs. </li><li> Maak een parasagittal huidincisie van net achter de ogen bijna tussen de oren in een enkele, stevige beweging met behulp van een nummer 11 scalpel. Beweeg de huid opzij en clip rechterkant met hemostat. </li><li> Duidelijke schedel van bovenliggende membraan met behulp van de saaie kant van de nummer 11 scalpel en katoen getipt applicators. Eventueel, veeg de schedel met een wattenstaafje gedoopt in 0,9% zoutoplossing. Laat volledig drogen. </li><li> Onsing een liniaal, markeer de voorste rand van de craniotomie bij 1 mm caudaal van de coronale hechtdraad en de linkerrand van de craniotomie bij 1 mm lateraal van de pijlnaad (figuur 1), met een permanente marker. Markeer rechts en caudale grens van de craniotomie op 4 mm van de sagittale en coronale hechtingen, respectievelijk (figuur 1). </li><li> Met behulp van een 0,5 mm boor, beginnen te craniotomy maken door het boren langzaam naar aanleiding van de permanent marker omtrek. Zorg ervoor dat u niet helemaal doorbreken van de schedel. Druk voorzichtig op de geïsoleerde stuk pariëtale bot met No. 5 tang, gebieden van zwakte zal plaatsmaken voor de druk. Wanneer de uitgedund bot is de hele omtrek voldoende zwak, het bot stuk is klaar voor verwijdering. OPMERKING: Als de onderzoeker ervaringen moeite verwijderen van de bot in een stuk, dit suggereert dat het bot tijdens het boren niet voldoende is uitgedund. Denk verder boren van de schedel in de daaropvolgende dieren Facilitate gemakkelijk verwijderen van het bot stuk. </li><li> Met behulp van een 10 ml spuit uitgerust met een 23 G naald, een kleine hoeveelheid van 0,9% zoutoplossing om de geïsoleerde bot geboord gebied geniet. </li><li> Bevestig de manipulator arm naar de stereotaxische apparatuur. Bevestig een nieuw nummer 11 scalpel om de sonde houder met de scherpe kant van het mes tegenover rostraal. Opmerking Hoewel de rostrale en caudale weefsels ervaren scherpe en stompe hoeken van het mes respectievelijk de mechanische schade veroorzaakt door de penetrerende verwonding vergelijkbaar gedurende de omvang van de laesie. We zien geen merkbare verschillen in belangrijke kenmerken van reactieve gliosis waaronder opregulatie van GFAP expressie of proliferatie, tussen rostrale en caudale secties. </li><li> Houden van de manipulator arm uit de weg, til de geïsoleerde bot met behulp van 5/45 schuine pincet. Steek de punt van de tang in de zijkant van de geïsoleerde bot en een lift, met behulp van leverage te trekken uit het stuk bot achtergelaten in een full beweging. OPMERKING: Wees voorzichtig niet naar de hersenen steken of verstoren de dura onder de schedel. </li><li> Neem een ​​klein stukje van de geweekte absorbeerbare gel schuim en plaatsen op de onbedekte hersenen om te voorkomen dat het uitdroogt en geniet van alle bloed dat aanwezig zou kunnen zijn. </li><li> Zodra de gel schuim is op zijn plaats, draai de manipulator arm op zijn plaats en passen blad naar het centrum van craniotomy over de gel schuim. Verwijder de gel schuim en laat het mes tot aan de punt raakt de dura zonder aanprikken van de dura. Mark dorsale / ventrale coördinaten met behulp van de nonius schaal op de verticale arm van de stereotaxische. </li><li> De manipulator arm, langzaam lager het blad precies 3 mm in de hersenen. Dit wordt mogelijk door de nonius markeringen op de manipulator arm. Laat het blad om te verblijven in plaats voor 5-10 sec. Beweeg de stereotaxische arm met mes bevestiging rostral tot drie keer waardoor het mes aan de rostrale en caudale grenzen van de craniotomie bereiken caudaal voordat hij naar de opposite einde. OPMERKING: De dura is niet voorafgaand aan het plaatsen van het mes verwijderd. In tegenstelling tot de rat dura, die ~ 80 urn dik 7, de muis dura aanzienlijk dunner (slechts enkele cellagen dik) en geen merkbare weerstand tegen scalpel produceren tijdens het inbrengen. Gebruik een nieuwe scalpel voor elke muis zodat elk dier krijgt een consistente letsel. </li><li> Langzaam verhogen de stereotaxische arm, het verwijderen van het mes uit de hersenen. Na verwijdering van het mes, onmiddellijk een nieuw vel van gelfoam op het hersenoppervlak te genieten van overtollig bloed of vloeistof. </li><li> Ondertussen, verwijder de stereotaxische arm en gooi de No. 11 scalpel. Zodra bloeden is gestopt, verwijder de gelfoam. </li><li> Sluit de wond hechten van de huid met niet-absorbeerbare hechtdraad, zoals Ethilon of Prolene. Hechtingen moeten na de operatie worden verwijderd 9-10 dagen. </li><li> Zet de muis aan zijn kooi, en laat de muis langzaam terug op een heating pad en monitor voor tekenen van nood. Herstel van-isofluorane geïnduceerde anesthesie treedt meestal binnen 2-5 minuten na verwijdering uit de isofluorane. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het borstbeen recumbancy heeft herwonnen. </li><li> Dien 0,5-1 ml Ringer&#39;s oplossing subcutaan om hydratatie te verzekeren. </li></ol> 4. Post-chirurgische zorg <ol><li> Nauw post-operatief te controleren dieren tot het herstel van de anesthesie alvorens terug te keren naar de kolonie. <ol><li> Om pijn en ongemak postoperatief te verminderen, te beheren 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine door ip injectie onmiddellijk na de procedure. </li><li> Observeer dieren voor 2-3 dagen post-operatief voor ernstige tekenen van angst zoals beperkte bewegingen, gebrek aan verzorging, of gewichtsverlies. Euthanaseren dieren demonstreren een van deze tekenen van nood en uit de studie. </li></ol></li><li> Om histopathologie van gewonde weefsels te onderzoeken, euthanaseren dieren door standaard intracardiale perfusie. <ol><li> Kort verdoven dieren met een overdosis van ketamine / xylazine, vervolgens intracardiaal geperfuseerd met 15-20 ml 0,9% NaCl of totdat de lever verwijdering van bloed, gevolgd door 60 ml van 4% paraformaldehyde aan het einde van het experiment. </li></ol></li><li> Ontleden hersenen en post-fix voor 2-4 uur in 4% paraformaldehyde alvorens naar 30% sucrose-oplossing. Sectie hersenen op een cryostaat bij 40-60 urn en proces standaard histologische en immunohistochemische procedures, of zoals beschreven in Garcia 8,9. </li></ol>

<ol><li>Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+as+therapeutic+targets+for+CNS+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders.</a> Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).</li>
<li>Bush, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+infiltration%2C+neuronal+degeneration%2C+and+neurite+outgrowth+after+ablation+of+scar-forming%2C+reactive+astrocytes+in+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Leukocyte infiltration, neuronal degeneration, and neurite outgrowth after ablation of scar-forming, reactive astrocytes in adult transgenic mice.</a> Neuron. 23 (2), 297-308 (1999).</li>
<li>Faulkner, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+protect+tissue+and+preserve+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).</li>
<li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+Stat3+or+Socs3+discloses+a+dual+role+for+reactive+astrocytes+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of Stat3 or Socs3 discloses a dual role for reactive astrocytes after spinal cord injury.</a> Nature Medicine. 12 (7), 829-834 (2006).</li>
<li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Astrocytes+Form+Scar-Like+Perivascular+Barriers+to+Leukocytes+during+Adaptive+Immune+Inflammation+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reactive Astrocytes Form Scar-Like Perivascular Barriers to Leukocytes during Adaptive Immune Inflammation of the CNS.</a> Journal of Neuroscience. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Gliosis+and+the+Multicellular+Response+to+CNS+Damage+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive Gliosis and the Multicellular Response to CNS Damage and Disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Maikos, J. T., Elias, R. A., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+dura+mater+from+the+rat+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of dura mater from the rat brain and spinal cord.</a> Journal of neurotrauma. 25 (1), 38-51 (2008).</li>
<li>Garcia, A. D., Doan, N. B., Imura, T., Bush, T. G., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP-expressing+progenitors+are+the+principal+source+of+constitutive+neurogenesis+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain.</a> Nat Neurosci. 7 (11), 1233-1241 (2004).</li>
<li>Garcia, A. D., Petrova, R., Eng, L., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+discrete+populations+of+astrocytes+in+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates discrete populations of astrocytes in the adult mouse forebrain.</a> J Neurosci. 30 (41), 13597-13608 (2010).</li>
<li>Amat, J. A., Ishiguro, H., Nakamura, K., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+diversity+and+kinetics+of+proliferating+microglia+and+astrocytes+following+cortical+stab+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic diversity and kinetics of proliferating microglia and astrocytes following cortical stab wounds.</a> Glia. 16 (4), 368-382 (1996).</li>
<li>Hozumi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+prosaposin+ameliorates+spatial+learning+disturbance+and+reduces+cavity+formation+following+stab+wounds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Administration of prosaposin ameliorates spatial learning disturbance and reduces cavity formation following stab wounds in rat brain.</a> Neuroscience letters. 267 (1), 73-76 (1999).</li>
<li>Ness, R., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+cells+modulate+the+neurite+growth+promoting+properties+of+astrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal cells modulate the neurite growth promoting properties of astrocytes in vitro.</a> Glia. 19 (1), 47-57 (1997).</li>
<li>Byrnes, K. R., Fricke, S. T., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+differences+between+rats+and+mice+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+magnetic+resonance+imaging+%3A+JMRI%22%5BJournal%5D)">Neuropathological differences between rats and mice after spinal cord injury.</a> Journal of magnetic resonance imaging : JMRI. 32 (4), 836-846 (2010).</li>
<li>Steward, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neurotrauma+research%3A+opportunities+and+potential+pitfalls+of+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neurotrauma research: opportunities and potential pitfalls of murine models.</a> Experimental neurology. 157 (1), 19-42 (1999).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nature neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Hanisch, U. -K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debris+clearance+by+microglia%3A+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2008).</li>
<li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Barrier+to+Regeneration+in+the+CNS%3A+Activated+Macrophages+Induce+Extensive+Retraction+of+Dystrophic+Axons+through+Direct+Physical+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Another Barrier to Regeneration in the CNS: Activated Macrophages Induce Extensive Retraction of Dystrophic Axons through Direct Physical Interactions.</a> Journal of Neuroscience. 28 (38), 9330-9341 (2008).</li>
<li>Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Cells+Contribute+to+Myelin+Degeneration+and+Axonopathic+Changes+in+Mice+Overexpressing+Proteolipid+Protein+in+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune Cells Contribute to Myelin Degeneration and Axonopathic Changes in Mice Overexpressing Proteolipid Protein in Oligodendrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 26 (31), 8206-8216 (2006).</li>
<li>Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+systemic+inflammation+to+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Contribution of systemic inflammation to chronic neurodegeneration.</a> Acta neuropathologica. 120 (3), 277-286 (2010).</li>
<li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> Journal of Neuroscience. 19 (24), 10778-10788 (1999).</li>
<li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+beyond+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 32 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Buffo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+progeny+of+reactive+gliosis%3A+A+source+of+multipotent+cells+in+the+injured+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and progeny of reactive gliosis: A source of multipotent cells in the injured brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3581-3586 (2008).</li>
<li>Sirko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+glia+in+the+injured+brain+acquire+stem+cell+properties+in+response+to+sonic+hedgehog.+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. [corrected].</a> Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het is essentieel dat de schedel of de onderliggende dura niet worden beschadigd tijdens het boren. Gebruik lichte druk tijdens het boren aan de schedel te verzekeren wordt niet doorboord. Bovendien dient men tijdens het heffen de schedel stuk naar de dura waarborgen is niet opgeheven met het bot. De voorhersenen stab letsel hier beschreven modellen een indringende letsel aan het centrale zenuwstelsel. Hoewel minder klinisch vertaalbaar dan TBI modellen zoals FPI of CCI, de voorhersenen stab...

Een grote uitdaging voor het ontwikkelen van succesvolle therapieën om het beschadigde centrale zenuwstelsel te behandelen, is het onvolledige begrip van de complexe multicellulaire gebeurtenissen die door het trauma worden geactiveerd. Reactieve astrocyten krijgen steeds meer erkenning als een veelbelovend doelwit voor nieuwe therapieën1. Hoewel ze historisch gezien als vijandig voor neurale reparatie werden beschouwd, worden reactieve astrocyten nu erkend als kritieke onderdelen van een complexe, multicellulaire neuroprotectieve respons die verzwakking van inflammatoire processen en beperking van secundaire schade en neurodegeneratie omvat2-6. Hoewel de neuropathologische kenmerken van reactieve gliose lang goed gedefinieerd zijn, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die de reactieve gliose reguleren, en de diverse reeks downstreamgevolgen, slecht begrepen. Het begrijpen van de mechanismen die reactieve gliose aansturen, evenals de daaropvolgende cellulaire en moleculaire gebeurtenissen, is een belangrijke stap in de ontwikkeling van strategieën gericht op het bevorderen van de neuroprotectieve eigenschappen van reactieve gliose, terwijl de schadelijke effecten worden verzwakt. 
Hier demonstreren we een methode om ernstige reactieve astrogliose in de voorhersenen van volwassen muizen te induceren met behulp van een steekwond. In tegenstelling tot andere modellen voor traumatisch hersenletsel (TBI), zoals gecontroleerde corticale impact (CCI) of vloeistofpercussieletsel (FPI), die gespecialiseerde apparatuur vereisen om een letsel te veroorzaken, vereist de voorhersenensteek slechts een stereotactisch apparaat om het hoofd te stabiliseren en een No. 11 scalpelmes. Daarom is het voorhersenensteekletselmodel toegankelijker voor een breed scala aan laboratoria die geen toegang hebben tot de gespecialiseerde apparaten die nodig zijn voor het creëren van een FPI- of CCI-letsel. De hier beschreven methode stelt onderzoekers in staat om op betrouwbare en reproduceerbare wijze een robuuste glioserespons te activeren om de daaropvolgende cellulaire en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken. Eenmaal hersteld van de operatie kunnen dieren die een voorhersenensteekletsel hebben ontvangen langere tijd overleven zonder dat er speciale zorg voor nodig is en kunnen ze worden teruggezet naar de kolonie voor acute, intermediaire of chronische studies. Hoewel minder klinisch te vertalen dan FPI- of CCI-modellen van TBI, dient een voorhersenenletsel geproduceerd door een steekwond als een eenvoudig maar nuttig experimenteel model om basisbiologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan reactieve gliose en andere neuropathologische gebeurtenissen na trauma aan het centrale zenuwstelsel.

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>High speed micro drill</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724950</td><td></td></tr><tr><td>stainless steel scalpel blade, #11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45 angled forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anti-GFAP</td><td>DAKO</td><td>&nbsp;Z033429-2</td><td>Dilution - 1:20.000 (bright-field); 1:1.000 (fluorescentie)</td></tr><tr><td>Shp anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>Dilution - 1:20.000 (bright-field); 1:500 (fluorescentie)</td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Biotinylated rabbit anti-sheep</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 goat anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>Dilution - 1:400 (bright-field)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 donkey anti-sheep</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>Dilution - 1:1.000 (fluorescentie)</td></tr><tr><td>DAPI Nucleic Acid Stain</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>Dilution - 1:1.000 (fluorescentie)</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>Dilution - 1% (bright-field)</td></tr></tbody></table>

triggering reactief gliosis<em&gt; in vivo</em&gt; door een voorhersenen stab injury

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

Na een letsel aan het centrale zenuwstelsel ondergaan astrocyten een breed scala aan biochemische, morfologische en moleculaire veranderingen, die gezamenlijk reaktieve astrogliose worden genoemd. Reactieve astrocyten oefenen zowel inflammatoire als beschermende effecten uit die respectievelijk de neurale reparatie remmen en bevorderen. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de diverse functionele eigenschappen van reaktieve astrogliose zijn niet goed begrepen. Het bereiken van een beter begrip van deze mechanismen is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën om het beschadigde centrale zenuwstelsel te behandelen. Hier demonstreren we een methode om reaktieve astrogliose in de voorhersenen van een volwassen muis te activeren met behulp van een prikletsel in de voorhersenen. Dit letselselmodel is eenvoudig, betrouwbaar en vereist alleen een stereotactisch apparaat en een scalpelmes om het letsel te veroorzaken. Het gebruik van prikletsels als letselselmodel in de voorhersenen is goed gevestigd en geschikt voor studies die zich richten op een breed scala aan neuropathologische uitkomsten, zoals neuronale degeneratie, neuro-inflammatie en verstoringen in de bloed-hersenbarrière (BBB). Daarom dient het prikletselselmodel van de voorhersenen als een krachtig hulpmiddel dat kan worden toegepast voor een breed scala aan studies over de reactie van het centrale zenuwstelsel op trauma.

Omdat dieren die in deze procedure niet behoeft speciale post-operatieve zorg, korte of lange-termijn overleving perioden worden gemakkelijk opgenomen in de studie, afhankelijk van de behoefte aan acute of chronische pathologie na letsel te onderzoeken. Belangrijkste kenmerken van reactieve gliosis, zoals opregulatie van GFAP en hypertrofie van de soma, kan zo vroeg 2-3 dagen na letsel worden genomen. De piek fase van de proliferatie van reactieve astrocyten is gedurende 3-5 dagen na verwonding 10. De represe...

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om een voorhersenen-steekletsel te veroorzaken bij volwassen muizen. De steekwond veroorzaakt ernstige reactieve gliose en gliale littekenvorming die vervolgens kan worden onderzocht met standaard immunohistochemische methoden.

Triggering Reactief gliosis<em&gt; In Vivo</em&gt; Door een voorhersenen Stab Injury

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het opwekken van reactieve astrogliose in de voorhersenen van een volwassen muis door het aanbrengen van een mechanische laesie, om zo de cellulaire en moleculaire processen die ten grondslag liggen aan reactieve gliose te onderzoeken. Dit wordt bereikt door een craniotomie uit te voeren en vervolgens een steriel scalpelblad drie tot vier millimeter diep en lang in de voorhersenen in te brengen om de laesie te creëren. Dieren kunnen overleven tot acute of chronische tijdspunten, waarna hun weefsels aan het einde van het experiment worden geoogst.Vervolgens kan het weefsel worden verwerkt voor histologische, biochemische of moleculaire biologische analyses om de moleculaire en cellulaire processen die reactieve astrogliose aansturen te onderzoeken. De resultaten tonen aan dat deze procedure een sterke reactieve gliose teweegbrengt, gebaseerd op de dramatische upregulatie van GFAP en proliferatie van reactieve astrocyten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals fluid percussion injury of controlled cortical impact, is dat reactieve gliose eenvoudig kan worden geïnduceerd en bestudeerd zonder

triggering-reactive-gliosis-in-vivo-by-a-forebrain-stab-injury

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the cortical stab injury procedure in mice, involving skull exposure and brain lesion creation. It induces reactive astrogliosis, a neuroprotective response of astrocytes, to study CNS trauma, inflammation, and repair mechanisms.

Generating A Cortical Stab Injury in a Mouse Model to Induce Reactive Astrogliosis

Een blessure paradigma met behulp van de Drosophila larven ventrale zenuw koord aan het centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie te onderzoeken wordt beschreven. Stekende gevolgd door laser scanning confocale microscopie in time-lapse en vaste monsters, gecombineerd met kwantitatieve analyse met doelgericht ontwikkelde software en genetica, worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.

Acute Brain Trauma in Muizen gevolgd door Longitudinale Twee-foton Imaging

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

Dit systematische protocol beschrijft een nieuw diermodel van posttraumatische epilepsie na repetitief licht traumatisch hersenletsel. Het eerste deel details stappen voor traumatisch hersenletsel inductie met behulp van een gewijzigd gewicht daling model. Het tweede deel geeft instructies over de chirurgische aanpak voor single- en multi-channel elektro-encefalografische data-acquisitiesystemen.

Inducerende posttraumatische epilepsie in een muis model van repetitive diffuse traumatisch hersenletsel

Het protocol beschrijft licht traumatisch hersenletsel in een muismodel. In het bijzonder wordt een stapsgewijs protocol om een milde middellijn gesloten hoofdletsel en de karakterisering van het diermodel te induceren volledig uitgelegd.

Elektromagnetisch gecontroleerd gesloten-hoofd model van mild traumatisch hersenletsel bij muizen

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Dit protocol beschrijft een op maat gemaakt luchtdruksysteem dat is ontworpen om verwondingen aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van een gesloten systeem bij muizen te induceren, inclusief oculaire, hersen- en ruggenmergtrauma's. Het doel van dit protocol is om een kader te bieden voor onderzoekers om het systeem gemakkelijk aan te passen en uit te breiden voor hun unieke CZS-traumastudies.

Systeem voor focaal, gesloten systeem letsel aan het centrale zenuwstelsel

Vereenvoudigde modellen voor traumatisch hersenletsel (TBI) hebben de ontwikkeling van therapeutische benaderingen vergemakkelijkt. Dit protocol schetst de aanmaak van een niersteekwond muiscortex met behulp van naalden, waardoor bloedingen en ontstekingen kunnen worden geanalyseerd. Het steekwond TBI-muismodel biedt het voordeel dat het kan worden uitgevoerd zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.

Steekwondmuismodel voor het bestuderen van bloedingen en ontstekingen bij traumatisch hersenletsel

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

Leer reactieve gliose induceren in de volwassen muizen voorhersenen via een stekenblessure. Deze methode maakt onderzoek naar gliale littekenvorming en GFAP-expressie mogelijk zonder extra apparatuur.

Triggering Reactief gliosis

Meer video's verkennen