Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Het doel van deze procedure is de extractie van eiwit en DNA uit microbiële biomassa uit zeewater, gevolgd door de generatie van triptische peptiden voor proteomische analyse op basis van tandem-massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst cellen te lyseren die vooraf zijn opgeconcentreerd op een cartridgefilter. De tweede stap bestaat uit het concentreren van het cellysaat met behulp van ultracentrifugale filtereenheden.

Vervolgens wordt het lysaat gescheiden in twee fracties, één voor eiwitprecipitatie en één voor DNA-precipitatie. De laatste stap is het uitvoeren van in-gel trypsinedigestie van eiwitten en het extraheren van peptiden die geschikt zijn voor analyse via vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie. Uiteindelijk kan een daaropvolgende bio-informatische analyse worden gebruikt om tot expressie gekomen eiwitten in het monster te identificeren, terwijl het geïsoleerde DNA kan worden gebruikt voor metagenomische analyse en/of 16 S-R-R-N-A genanalyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat zowel eiwit als DNA gelijktijdig uit hetzelfde monster kunnen worden geïsoleerd. Begin met het uitstoten van de RNA-stabilisatielosutie uit de filtereenheid van de cartridge in een microcentrifugebuisje van 2 ml, met behulp van een spuit van 60 ml die is bevestigd aan het luer-lock-uiteinde van de filtercentrifuge. Centrifugeer het microcentrifugebuisje van 2 ml gedurende 10 minuten bij 17.000 ×g om eventueel cellulair debris te pelletteren. Draag het supernatant over naar een ultra-centrifugefiltereenheid van 10 K om alle eiwitten op te vangen die afkomstig zijn van gecalyseerde cellen uit het monster.

Gooi het pellet niet weg. Centrifugeer de ultracentrifugale filtereenheid bij 3.270 ×g gedurende 30 minuten of totdat het volume is afgenomen tot ongeveer 600 µL. Smelt ondertussen de punt van een P 10-tip en blokkeer de zijde van de cartridgefiltereenheid zonder luer-slot met het open uiteinde van de tip.

Dit zorgt ervoor dat er tijdens toekomstige stappen geen extractiebuffer en biomassa ontsnappen. Suspendeer het pellet in één milliliter SDS-extractieoplossing en pipetteer dit in de oorspronkelijke filterunit van de cartridge. De eenvoudigste manier om in de filterunit van de cartridge te pipetteren, is door een P 200-tip op een P 1000-tip te stapelen en deze dubbele tip te gebruiken voor het pipetteren. Voeg een extra milliliter SDS-extractieoplossing toe aan de filterunit van de cartridge, zodat het totale volume ongeveer twee milliliter is.

Parafilm. Sluit het luer-lock uiteinde van de cartridgefiltereenheid en plaats de cartridgefiltereenheid in de buis van 50 milliliter. Plaats vervolgens drie verfrommelde laboratoriumdoekjes op de bodem van een conische buis van 50 milliliter.

Sluit het deksel en plaats de buis in de hybridisatieoven om 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen onder rotatie. Plaats het filter na 10 minuten op een schuimrubberen vlotter en zet dit vast met een spuit van vijf milliliter op het lure-lock-uiteinde; incubeer vervolgens 15 minuten in een waterbad van 95 °C. Laat de filtercartridge-eenheid daarna één uur afkoelen bij kamertemperatuur onder rotatie. Zodra deze is afgekoeld, wordt de SDS-extractieoplossing van het cellysaat met een spuit van 60 milliliter uit het filter in dezelfde ultracentrifugale filtereenheid geperst.

Voeg, zoals voorheen, één milliliter verse SDS-extractieoplossing toe aan de filtercartridge-unit en meng dit gedurende 30 seconden handmatig. Druk vervolgens de inhoud van het filter met de 60 milliliter spuit uit in de ultracentrifugale filterunit om te spoelen en ervoor te zorgen dat alle eiwitten zijn verwijderd en opgevangen. Centrifugeer de ultracentrifugale filterunit gedurende 45 minuten bij 3.270 ×g, of totdat het volume in de filterunit minder dan 600 µL is.

Gooi het filtraat weg en vul de ultracentrifugale filtereenheid aan met verse SDS-extractieoplossing. Centrifugeer de filtereenheid nogmaals 45 minuten bij 3 270 ×g en herhaal deze stap nog twee keer. Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume in de ultracentrifugale filtereenheid aan het einde van de laatste centrifugeerstap maximaal 600 µL is.

Meet op dit punt het volume van het concentraat en verdeel het concentraat in twee delen. Eén fractie wordt gebruikt voor DNA-precipitatie en de andere voor eiwitprecipitatie. Voeg voor de eiwitprecipitatie vier volumes methanol en aceton in een verhouding van 50 op 50 toe aan één volume concentraat, vortex 10 seconden en incubeer dit gedurende de nacht bij -20 °C.

Centrifuge het mengsel de volgende dag 30 minuten lang bij 17,000 ×g. Decanteer het supernatant en laat de pellet één uur drogen in een speed vac. Droog de pellet niet te veel, omdat dit het opnieuw resuspenderen kan bemoeilijken.

Suspendeer het pellet in 25 µL SDS-extractieoplossing. Laat dit één uur staan en resuspendeer vervolgens door herhaaldelijk te pipetteren. Voer SDS-PAGE uit op de eiwitten zoals beschreven in het tekstprotocol, waarbij u werkt in een biologische veiligheidskabinet om contaminatie te minimaliseren; snijd voor elke baan het overtollige gel onder de 10 kilodalton ladder-markering af.

Elke lane wordt geanalyseerd op de tandemmassaspectrometer. Snijd elke lane apart in vierkantjes van één millimeter bij één millimeter om het oppervlak te vergroten en plaats alle vierkantjes van de lane in een low-binding microcentrifugebuisje. Herhaal dit voor alle lanes; 1% azijnzuur kan worden gebruikt om te voorkomen dat de gel uitdroogt en moeilijk te snijden wordt.

Ga verder met de in-gel trypsinedigestie en peptide-extractie zoals beschreven in het tekstprotocol, of voeg SDS-extractie-oplossing toe aan de geconcentreerde fractie voor DNA-precipitatie tot aan de markering van 500 µL. Deze stap is uitsluitend bedoeld om het volume van de oplossing te vergroten, zodat deze gemakkelijker te hanteren is. Voeg vervolgens 0,583 volumes van een proteïne-precipitatie-reagens toe, zoals het MPC proteïne-precipitatie-reagens, en vortex.

Centrifuge gedurende 10 minuten bij 17.000 ×g en 4 °C, waarbij een wit neerslag wordt gevormd. Draai na centrifugatie het supernatant over naar een andere microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 0,95 volumes isopropanol toe; keer de buis 30 tot 40 keer om voordat u opnieuw 10 minuten centrifugeert bij 4 °C op maximale snelheid, waarna het supernatant voorzichtig wordt afgegoten en weggegooid. Spoel de pellet vervolgens tweemaal met 750 µL 70% ethanol.

Verwijder zoveel mogelijk ethanol met een pipet en laat het pellet vervolgens aan de lucht drogen. Droog het DNA niet te veel, omdat dit het resuspenderen na het drogen kan bemoeilijken. Suspendeer het pellet in 25 µL low T buffer P eight.

Kwantificeer het DNA met een assaykit voor dubbelstrengs DNA en volgens de instructies van de fabrikant. Voer daarnaast agarosegelelektroforese uit op drie µL van het DNA om de kwaliteit te controleren; peptiden werden onderworpen aan tandem-massaspectrometrie-analyse. Per monster werden meer dan 23.000 spectra gegenereerd, op basis waarvan peptiden en eiwitten werden geïdentificeerd.

De taxonomische en functionele samenstelling van de metaproteomen werd geanalyseerd met een combinatie van blast P en de metagenome analyzer software package. Eiwitten die werden toegewezen aan alfaproteobacteria waren het sterkst vertegenwoordigd in de dataset, waarvan de overgrote meerderheid werd toegewezen aan de SAR R 11-clade.

De Roter-clade van Alpha Proteobacteria was ook sterk vertegenwoordigd en werd geïdentificeerd, het meest frequent in oppervlaktewaters. Eiwitten die werden toegewezen aan bacteriële ziekten waren gelijkmatig verdeeld tussen het oppervlak en het chlorofylmaximum, maar eiwitten van geflagelleerde bacteriën werden in grotere mate geïdentificeerd bij het chlorofylmaximum.

Proteïnen van gamma-proteobacteriën waren gelijkmatig verdeeld over de gehele waterkolom, terwijl proteïnen van beta-proteobacteriën voornamelijk in de oppervlakte werden aangetroffen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie dagen worden uitgevoerd mits correct uitgevoerd.