Name: Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Ontdek een directe conversiemethode om fibroblasten om te zetten in neurale voorlopercellen met behulp van virale transductie. Deze techniek versnelt de generatie van patiëntspecifieke cellen voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag alle leden van de Stem Cell en Regenerative Medicine Group van de Universiteit van Würzburg voor nuttige tips en Martina Gebhardt evenals Heike Arthen bedanken voor een uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79 / 1-2), het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek BMBF (01 GN 0813), de Beierse Research Network geïnduceerde pluripotente stamcellen &quot;forIPS&quot; en de &quot;Stiftung Sibylle Assmus &quot;. Figuur 1 werd geproduceerd met behulp van Servier Medical Art, verkrijgbaar bij www.servier.com.

De menselijke fibroblasten die in deze studie werden verkregen uit een huid punch biopsie na het krijgen van informed consent en ethische goedkeuring door de ethische commissie van de Universiteit van Würzburg, Duitsland (ethische verslag nr: 96/11 dd 10.06.2011). 1. Punch biopsie <ol><li> Ontsmet de huid van de patiënt. Verdoven huid waarvan een deel biopsie zal worden genomen van (bij voorkeur een minder zon blootgestelde gebied) met 0,5 tot 1 ml mepivacaine hydrochloride intracutaan en voor te bereiden de huid biopsie met een steriele 3mm biopsie punch, spoel biopsie met DPBS + 1 pl / 1ml Gentamicine en verwijder vet. Spoel biopsie tweemaal met DPBS + gentamicine aspireren DPBS volledig en deksel biopsie met Dispase II (2,4 U / ml) en incubeer 16-18 uur bij 4 ° C. </li><li> Zuig Dispase volledig, wassen tweemaal met DPBS en epidermis te verwijderen met een pincet. Was biopsie tweemaal met DPBS, voeg 2 ml Collagenase Type 2 (500 U / ml CDU), de overdracht in 15 ml buis en voeg COLLAGENAse tot 5 ml totaal volume. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Centrifuge 5 min bij 180 xg en gooi supernatant daarna. Resuspendeer pellet in 10 ml DMEM-FCS-gentamicine-medium (10% FCS, 1 ul / ml gentamicine) en centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten bij 180 x g. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 1,5 ml DMEM-FCS-Gentamicine-media. Transfer naar hechtende weefselkweek kolf T25 en incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Wijzig de media om de 3 dagen. </li><li> Na ongeveer 2 weken, wanneer de cellen confluent rond huiddelen, split cellen via trypsine / EDTA (0,05%) was cellen eenmaal met DPBS, incubeer 5 min bij 37 ° C, 5% CO 2 na toevoeging van 2 ml trypsine / EDTA (0,05%), voeg 2 ml DMEM-FCS-gentamicine-media, overbrengen naar 15 ml buis en centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten; gooi supernatant en resuspendeer pellet in de juiste hoeveelheid DMEM-FCS-Gentamicine-media. </li><li> Verdere uitbreiding van de cellen door het veranderen van het medium elke 3 rd dag en splitsen, zoals hierboven wanneer cellen zijn confluent beschreven; toevoeging van gentamicine kan na passage 2 gestopt. </li><li> Voordat u de cellen voor de directe omzetting experimenten, zorg ervoor om mycoplasma besmetting uit te sluiten door middel van standaard assays. </li><li> Wanneer cellen zijn uitgebreid, kunt u direct conversie te starten of de vriezer cellen omlaag met 10% DMSO en 90% FCS. De cellen moeten bij -80 ° C worden bewaard gedurende 2 dagen en vervolgens overgebracht naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. </li><li> Voor de bereiding van de omzetting, was cellen eenmaal met DPBS, aspireren DPBS en voeg 2,5 ml trypsine / EDTA (0,05%). Laat gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. Tik kolf zachtjes om cellen los, hersuspenderen in 2,5 ml fibroblast medium (DMEM incl. L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% natrium pyruvaat) en overbrengen naar 15 ml buis. Centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten en zuig de supernatant. Resuspendeer cellen in 1 ml fibroblast media en pipet op en neer om enkele celsuspensie te genereren. &lt;/ Li&gt; <li> Tel het aantal cellen met een Fuchs-Rosenthal- of Neubauer-telkamer cellen en plaat 3 x 10 4 cellen per putje van een 24 putjes plaat. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 2. Infectie van humane fibroblasten met Sendai Virus en Transdifferentiatie OPMERKING: Om de veiligheid te garanderen, de volgende stappen hanteren virus in een biologische veiligheid kabinet en een laminaire stroming kap, en met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, met name een chirurgisch masker, om mucosale blootstelling te voorkomen moet worden uitgevoerd. <ol><li> Schakel cellen 100 gl fibroblast media (stap 1.9). Dooi fracties van Oct4-, Klf4-, Sox2- en c-myc-Sendai-virus en resuspendeer elk virus in 1 ml fibroblast media. Voeg elk virus met een MOI van 3 tot cellen (virus titer varieert van veel te veel, maar een portie van elk virus kan in het algemeen worden gebruikt voor de infectie van 10 putjes van een 24 goed plaat) en meng voorzichtig. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;. </li><li> Na 24 uur Zuig het medium en voeg 500 pl neuroinduction media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng / ml hLIF, 3 uM CHIR99021, 2 uM SB431542) en kweek bij 39 ° C, 5% CO 2 voortaan. Wijzig de media om de andere dag. </li><li> Op dag 6 na infectie bereiden laminine bedekte 6-well-platen: verdun laminine tot 1 ug / ml in DPBS, voeg 1 ml van de oplossing op 6 goed platen en houden bij 4 ° C gedurende 24 uur. </li><li> Op dag 7 na infectie splitsen de cellen met behulp DPBS / EDTA: zuigen de media en was cellen eenmaal met DPBS, voeg 500 ul van DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Voeg 500 ui DMEM / F12 en verwijder suspensie van plaat in een 15 ml buis en centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml neuroinduction media, plaat op-laminine gecoate 6 goed platen en voeg ROCK inhibitor Y27632 in een laatste concentration van 10 uM tot de cellen, kweek bij 39 ° C, 5% CO 2. </li><li> Wijzig de media om de andere dag. </li><li> Vanaf dag 14 na infectie de cellen te kweken bij 37 ° C, 5% CO 2. Neuro kolonies zichtbaar worden rond dag 17 na infectie door fasecontrast microscopie. Ze moeten groot genoeg zijn om te worden geplukt rond dag 20 na infectie. </li></ol> 3. Isolatie van Vermoedelijke INPC Colonies <ol><li> Een dag voor het plukken, laag een 48 goed plaat met laminine: verdun laminine tot 1 ug / ml in DPBS, voeg 300 ul oplossing op platen en bewaar bij 4 ° C gedurende 24 uur. Een dag later aspireren laminine van borden en 200 ul van neuroinduction media toe te voegen aan de putjes. </li><li> Was de 6 goed platen met de koloniën eenmaal te worden opgehaald met DPBS en voeg 2 ml DPBS per putje van de 6 goed plaat. Kies de kolonies mechanisch: schraap rond kolonies met behulp van een dunne naald om zich te ontdoen van de omliggende cellen; Stel de 2001; l Pipetman op 50 ul en kies de kolonies met de desbetreffende pipet tips. </li><li> Breng een kolonie elk in een putje van een met laminine beklede 48 goed plaat en genereert een enkele celsuspensie mechanisch pipetteren en neer 10 keer. Voeg ROCK inhibitor Y27632 in een eindconcentratie van 10 uM tot de cellen. </li><li> Groeien de cellen op de 48 put-plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 dagen. Wijzig de media om de dag tot cellen te bereiken 80 - 90% confluentie (ong. 3 - 4 dagen). </li></ol> 4. Uitbreiding en Cryo-behoud van iNPCs <ol><li> Passage en uitbreiding van iNPCs <ol><li> Zuig het medium en was de cellen met DPBS. Zuig het DPBS en voeg 200 gl DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2, voeg 200 pl DMEM / F12 en verwijder suspensie van de plaat in een 15 ml buis, centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 min . </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml neuroinduction media (stap 2,2), plaat-laminine beklede 12 putjes-platen en voeg ROCK inhibitor Y27632 in een eindconcentratie van 10 uM tot de cellen, kweken bij 37 ° C, 5% CO 2. Na de cellen te bereiken 80 - 90% confluentie ze kunnen ofwel verder worden uitgebreid of als volgt bevroren beneden. </li></ol></li><li> Bevriezing van iNPCs <ol><li> Zuig het medium en was de cellen met DPBS. Zuig het DPBS en voeg 300 pl DPBS / EDTA en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2, voeg 300 ul DMEM / F12 en verwijder suspensie van de plaat in een 15 ml buis, centrifugeer bij 180 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml commercieel NSC invriesmedium. Transfer schorsing te bevriezen flacons en zet in-cell bevriezing container. Bewaar bij -80 ° C gedurende 2 dagen, vervolgens over vloeibare stikstof voor langdurige opslag. </li></ol></li></ol> 5. Differentiatie van iNPCs <ol><li> Differentiatie richting neuronal lineage <ol><li> Kweekcellen op laminine beklede platen zoals hierboven is beschreven. Verandering media om neuro-diff-medium (DMEM / F-12, 1 x N2, 1x B27, 300 ng / ml cAMP, 200 pM vitamine C, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF) wanneer cellen ongeveer 70% confluent. Verandering media om de dag gedurende drie weken. Niet splitsen cellen tijdens de differentiatie. </li><li> Na drie weken de cellen van de neuronale marker TUJ1 moet uitdrukken. Om meer volwassen neuronen krijgen en neuronale subtypes blijven differentiatie tot 3 maanden. </li></ol></li><li> Differentiatie richting gliale lineage <ol><li> Verandering media gliale inductie media (1: 1 DMEM / F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 uM β-mercaptoethanol, 100 uM niet-essentiële aminozuren, 1,5 mM L-glutamine, 5 ug / ml insuline, 40 ng / ml T3) met 20 ng / ml EGF om differentiatie te induceren in gliale voorlopercellen. Verwijder de helft van de media en vervangen door vers medium elke andere dag gedurende 2 weken. Gedurende deze periode cellen te splitsen1: 3 in aanwezigheid van 10 pM ROCK inhibitor Y27632 bij 100% confluentie bereikt. </li><li> Na 2 weken differentiëren cellen verder in astrocyten: wanneer cellen zijn bijna confluent verandering media om de handel verkrijgbare astrocyten media, media veranderen elke tweede dag. Na ongeveer 7 dagen de cellen beginnen te astrocyten markers (bijv GFAP) uit te drukken. Als cellen krijgen 100% confluent tijdens de differentiatie protocol, splitsen ze in een 1: 2 verhouding in aanwezigheid van 10 pM ROCK inhibitor Y27632. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+survive+and+integrate+into+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats.</a> Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Rhee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+human+iPS+cells+efficiently+generate+functional+dopamine+neurons+and+can+treat+a+rat+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease.</a> J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%E2%80%99s+disease+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+viral+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.</a> Cell. 136 (5), 964-977 (2009).</li>
<li>Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Montserrat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+poly-beta-amino+esters+as+the+non-viral+gene+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system.</a> J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).</li>
<li>Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA.</a> Sci Rep. 2, 657(2012).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible factors.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+using+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins.</a> Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).</li>
<li>Awe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+and+conversion+to+putative+clinical-grade+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state.</a> Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87(2013).</li>
<li>Kadari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+viral+reprogramming+cassettes+by+Cre+protein+transduction+enables+rapid%2C+robust+and+efficient+derivation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47(2014).</li>
<li>Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).</li>
<li>Han, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+and+region-specific+neural+progenitors+from+primate+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts.</a> Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+OCT4-mediated+direct+reprogramming+into+expandable+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells.</a> Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).</li>
<li>Hemmer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells+achieve+long-term+survival+and+functional+integration+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).</li>
<li>Conti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-independent+symmetrical+self-renewal+of+a+mammalian+tissue+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell.</a> PLoS Biol. 3 (9), e283(2005).</li>
<li>Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ES+cell-derived+rosettes+reveal+a+functional+distinct+early+neural+stem+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage.</a> Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PLoS One. 8 (3), c59252(2013).</li>
<li>Ring, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+multipotent+neural+stem+cells+with+a+single+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor.</a> Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).</li>
<li>Zou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+neuronal+restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors.</a> J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).</li>
<li>Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis.</a> PLoS One. 3 (9), e3145(2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulation+by+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendroglial+progenitors+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).</li>
<li>Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+fetal+tissue+from+spontaneous+abortions+to+a+rodent+model+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease.</a> Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).</li>
<li>Takagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+generated+from+monkey+embryonic+stem+cells+function+in+a+Parkinson+primate+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model.</a> J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+midbrain+dopaminergic+neurons+in+the+brain+of+a+primate+model+of+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parkinson%E2%80%99s+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease.</a> J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Dezawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+induction+of+neuronal+cells+from+bone+marrow+stromal+cells+and+application+for+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation.</a> J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).</li>
<li>Izrael, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oligodendrocytes+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+Effect+of+noggin+on+phenotypic+differentiation+in+vitro+and+on+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo.</a> Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).</li>
<li>Cassady, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversion+of+adult+mouse+liver+cells+and+B+lymphocytes+to+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).</li>
<li>Castano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+neural+conversion+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).</li>
<li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier tonen we de isolatie en rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in expandeerbare-transgen vrije neurale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen als mogelijke basis voor cell-vervangingstherapie of toepassing in geneesmiddelscreening analyses. Direct lineage omzetting van somatische cellen in NPC is bereikt door geforceerde expressie van afstammings-specifieke transcriptiefactoren 26,33,34. Niettemin vaak foetale fibroblasten werden voor transdifferentiatie experimenten 33,34. ...

In 2006 Yamanaka en collega&#39;s voor het eerst konden aantonen de mogelijkheid van herprogrammering van somatische cellen in een pluripotente toestand 1. Deze dedifferentiatie werd bereikt door overexpressie van vier transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc in murine fibroblasten. Het gegenereerde zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vertonen functionele equivalentie embryonale stamcellen (SER) en kan dus worden onderscheiden in alle celtypes van het volwassen organisme. Een jaar later herprogrammering iPSCs kan ook worden bereikt voor humane fibroblasten 2. Experimenten in diermodellen aangetoond dat iPSC-afgeleide cellen kunnen in het algemeen worden gebruikt voor celvervangingstherapie, bijvoorbeeld in Parkinson&#39;s Disease (PD) 3-5. Echter verscheidene beperkingen van het gebruik van iPSCs vormen obstakels voor de volledige hun therapeutisch potentieel. Allereerst herprogrammering van cellen in een pluripotente toestand en daaropvolgendekwaliteitscontrole is over het algemeen een tijdrovend en inefficiënt proces waardoor in uitgebreide en dus dure procedures celcultuur. Ten tweede moeten iPSCs opnieuw worden gedifferentieerd in de gewenste celtype van belang voor biomedische toepassing en de kans op resterende pluripotente cellen in gedifferentieerde latie aanzienlijke tumorigene potentieel en vertoont dus een hoog risico na celtransplantatie 6. Ten derde, wordt het herprogrammeringsproces gewoonlijk bereikt door het induceren van de herprogrammering factoren door lenti- of retrovirale infectie. De integratie van deze virussen in het gastheergenoom kan leiden tot mutagenese en / of ongecontroleerde heractivering van de transgenen 7,8. Non-integratieve systemen zijn ontwikkeld om de herprogrammering factoren leveren aan doelcellen, waardoor het risico van insertie mutagenese en transgene reactivering minimaliseren. Voorbeelden van deze transgen vrije benaderingen herprogrammering van cellen met niet-integrerendeAdeno of Sendai virus 9,10, DNA-gebaseerde vectoren 11 en de toepassing van DNA-vrije werkwijzen zoals transfectie van synthetisch mRNA 12 of transductie van recombinante eiwitten 13,14. Een andere veelbelovende methode voor het afleiden van transgene vrije iPSC het gebruik van loxP gemodificeerde lentivirale herprogrammering constructen en daaropvolgende verwijdering van transgenen met het Cre-loxP DNA recombinatiesysteem 15,16. Een eenvoudiger benadering van neurale cellen te genereren voor celvervangingstherapie vertegenwoordigt directe omzetting van fibroblasten in post-mitotische neuronen 17-20. Vierbuchen et al. Gerapporteerd dat de overexpressie van transcriptiefactoren Ascl1, Brn2 en Myt1l resulteert in het genereren van 20% neuronen tegen murine fibroblasten 17. In 2011 werd aangetoond, dat dezelfde drie transcriptiefactoren in combinatie met overexpressie van NeuroD1 mogelijk transdifferentiatie van humane fibroblasten in neuRons 19. Human geïnduceerde neuronen kunnen ook worden gegenereerd door overexpressie van Ascl1 en Ngn2 onder dual SMAD- en GSK3β- remming 20. Met name directe omzetting van fibroblasten in neuronen genereert een non-proliferatie, post-mitotische cel populatie die verdere uitbreiding en biobanking niet toestaat. Onlangs heeft de directe omzetting van fibroblasten in een prolifererende neurale stamcellen / voorlopercellen cel populatie werd gerapporteerd 21-26. Duidelijkheidshalve zullen al deze celtypen worden genoemd geïnduceerd neurale stamcellen (iNPCs) in dit rapport. Han et al. Overexpressie Brn4, Sox2, c-Myc en Klf4 iNPCs te genereren. Net als hun tegenhangers neurale stamcellen afgeleid van zowel primaire weefsel of pluripotente cellen deze iNPCs zijn tripotential en kon worden onderscheiden in neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 21. Onze groep rapporteerde een iets andere conversie protocol waarbij overexpressie van Sox2, Klf4En c-Myc en geïnduceerde Oct4 expressie slechts 5 dagen. Met deze aanpak kunnen we stabiel uitdijende iNPCs van muizen embryonale en volwassen fibroblasten dat volledige silencing vertonen van de herprogrammering factoren 22 genereren. In tegenstelling tot iPSCs, hoeft iNPCs geen tumorigeen potentieel vertonen na transplantatie 27. We gebruikten geconverteerde cellen in een diermodel van demyelinisatie, myeline deficiënte ratten, aangetoond dat iNPCs klinisch bruikbaar 22. Tot die tijd, kon NPCs alleen worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen of primaire zenuwweefsel 28-32. iNPCs zijn stabiel expandeerbare cellen die kunnen worden gecryoconserveerd en kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Veel inspanningen werden geleverd om de directe omzetting protocol uit muizen passen aan menselijke cellen 23,26,33,34. In 2012 werd gepubliceerd dat overexpressie van de enkele factor Sox2 in fibroblasten is voldoende om muizen en menselijke iNPCs genereren <sup&gt; 33. De auteurs gemeld generatie van de menselijke iNPCs uit foetaal voorhuid fibroblasten en gekenmerkt hen door kleuring tegen Sox2 en Nestin. De doelwitcellen voor herprogrammering slechts een zeer bepaald celtype die niet met de klinische praktijk en er was geen functionele karakterisatie van omgezet cellen door transplantatie in een diermodel uitgevoerd. Een recente publicatie beschrijft de vorming van neuronale voorlopercellen beperkt uit humane foetale fibroblasten door overexpressie van Sox2, c-Myc en hetzij Brn2 of Brn4 34. De gegenereerde cellijnen vertoonden zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende soorten terminal neuronen. Echter, het gebruik van foetale fibroblasten ongunstig, omdat deze cellen zijn van heterogene oorsprong naar de aanwezigheid van residuele bijvoorbeeld neurale stamcellen in de preparaten niet uit. In 2014, Zhu et al. Beschreven de directe omzetting van humane volwassen en neonatale fibroblasten in tripotential neurale stamcellen door overexpressie van Sox2 met Oct4 of Oct4 staan ​​toevoeging van kleine moleculen aan het celkweekmedium. Met name op basis van hun studie Sox2 alleen was onvoldoende om rechtstreekse omzetting 26 induceren. Recenter Lu et al. Beschreven dat de overexpressie van het Yamanaka factoren Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc van Sendai virus 24 uur en daaropvolgende inactivering van het virus door verhoogde temperatuur resulteert in het genereren van expandeerbare tripotential neurale precursorcellen 23. Samenvattend, alhoewel de conversie protocollen gepubliceerd menselijke cellen hebben gemeen overexpressie van ten minste één of meer van de Yamanaka factoren vaak tijdig beperkte wijze tot nu toe is er geen duidelijke aanwijzing voor de minimale moleculaire factoren nodig direct besturen omzetting in iNPCs. De tijdige beperkte overexpressie van Oct4 door een genetische middelen transfectie met synthetisch mRNA of cell-permeant eiwit met constitutieve expressie van Sox2, Klf-4, en c-Myc niet resulteren in stabiele humane INPC lijnen nog. Zo is de toepassing van Sendai virus al Yamanaka factoren overexpressie tijdig hun activiteiten beperken door hitte inactivatie van het virus 23 met geoptimaliseerde neurale media inductieomstandigheden 22,31 vertegenwoordigt de voorkeursstrategie tot nu toe. Verschillende studies tonen de mobiele functionaliteit van NSC of hun gedifferentieerde tegenhangers in verschillende dierziekten modellen. Neurale voorlopercellen uit menselijke pluripotente stamcellen werden getransplanteerd in muismodellen van de neuro-inflammatoire aandoening multiple sclerose 35,36. De toepasselijkheid van hESC-afgeleide neurale stamcellen in EAE (experimentele auto-immune encephalomyelitis) -mice werd voor het eerst getoond in 2008 35. Multipotente neurale voorloper cellen werden geïnjecteerd in de ventrikels van de hersenen van muizen, en de transplantatie resultaated in de vermindering van de klinische symptomen van EAE. Kim et al. Gegenereerd oligodendrogliale voorlopers van hESCs en getransplanteerd die intracerebroventriculair in EAE-muizen. Hoewel transplantatie overleefden niet langer dan 10 dagen, muizen vertoonden significante verbetering van neurologische functie en vermindering van proinflammatoire immuuncellen in de witte stof 36. Stamcel therapie is ook toegepast voor preklinische richten van de ziekte van Parkinson als NPC succes kan worden toegepast bij de respectieve diermodellen. Hiervoor werden progenitorcellen hetzij verkregen uit foetaal hersenweefsel 37 opzichte van pluripotente stamcellen 38-40 of mesenchymale 41 stamcellen werden gebruikt. In 2012 toonden we aan dat muis iNPCs kunnen proteolipide eiwit, het belangrijkste myeline eiwitcomponent na transplantatie produceren in de hersenen van myeline-deficiënte (md) 22 ratten. Door dat proof-of-principle experiment de therapeutische applicabilheid van iNPCs werd eerst bewezen en al snel bevestigd door een andere studie 32. Echter, het volledige potentieel van therapeutische gebruik van menselijke iNPCs moet nog worden onderzocht. Hier tonen we een robuuste en geïntegreerde werkwijze (i) winning van menselijke primaire cellen uit volwassen patiënten via huidbiopsie, (ii) rechtstreekse omzetting van humane fibroblasten in een neurale staat en (iii) het vermogen van iNPCs worden gedifferentieerd tot neuronale en gliale lijnen. Het gebruik van dit protocol zal helpen bij het versnellen generatie van autologe menselijke cellen voor therapeutische toepassingen.

<table><tbody><tr><td>Astrocyte media</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>pfm medical</td><td>48301</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon medchem</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>PAN&nbsp;</td><td>P10-032100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>LifeTechnologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roth</td><td>4720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG</td><td>50115</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>GFAP-antibody</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>LifeTechnologies</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>hLIF</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Seralab</td><td>GEM-700-112-P</td><td></td></tr><tr><td>Ki67-antibody</td><td>NeoMarkers</td><td>RM-9106-S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>LifeTechnologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>LifeTechnologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin-antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>LifeTechnologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>NSC freezing media</td><td>Sigma</td><td>C6295</td><td></td></tr><tr><td>Oct4-antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc9081</td><td></td></tr><tr><td>Pax6-antibody</td><td>Covance</td><td>PRB-278P</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Invivogen</td><td>inh-sb43</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td><td>&nbsp;LifeTechnologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumpyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sox1-antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3369</td><td></td></tr><tr><td>Sox2-antibody</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205725</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1-antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P-250</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Calbiochem</td><td>CAS 146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in expandable neural progenitor cellen

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) uit volwassen huid fibroblasten en de daaropvolgende differentiatie in somatische cellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties dat histocompatibiliteit barrières te omzeilen. Echter, doorlopen van een pluripotente toestand en daaropvolgende volledige differentiatie in gewenste lineages blijft een wegversperring van de klinische toepassing van iPSC technologie vanwege de geassocieerde neoplastisch potentieel en genomische instabiliteit. Onlangs hebben wij en anderen aangetoond dat somatische cellen niet alleen worden omgezet in iPSCs maar ook in verschillende soorten multipotente somatische stamcellen met gedefinieerde factoren, waardoor progressie omzeilen door de pluripotente toestand. Met name de directe omzetting van humane fibroblasten in veroorzaakte neurale stamcellen (iNPCs) kondigt de mogelijkheid van een nieuw autologe cel bron voor diverse toepassingen zoals mobiele vervanging, ziektemodelen drug discovery. We beschrijven hier de isolatie van volwassen humane primaire fibroblasten uit biopsie huid en het efficiënte directe omzetting in iNPCs door tijdige beperkte expressie van Oct4, Sox2, Klf4, alsmede c-Myc. Sox2-positieve neuro-kolonies verschijnen na 17 dagen van inductie en INPC lijnen efficiënt kunnen worden vastgesteld door monoklonale isolatie en expansie. Nauwkeurige aanpassing van virale multipliciteit van infectie en aanvulling van leukemie remmende factor tijdens de inductiefase vertegenwoordigen kritische factoren conversie rendementen tot 0,2% te bereiken. Tot nu toe kon patiëntspecifieke INPC lijnen te breiden tot meer dan 12 passages en uniform tonen morfologische en moleculaire kenmerken van neurale stam / progenitorcellen, zoals de expressie van Nestin en Sox2. De INPC lijnen kunnen worden gedifferentieerd tot neuronen en astrocyten, zoals beoordeeld door kleuring tegen TUJ1 en GFAP, respectievelijk. Tot slot melden we een robuust protocol voor de afleiding en direct omzetting van de menselijke fibroblasten in stabiel uitbreidbaar neurale stamcellen die een mobiele bron voor biomedische toepassingen zou kunnen bieden zoals autologe neurale cel vervangen en de ziekte modelleren.

Hier presenteren we beschrijving van een geïntegreerd proces genereren van geïnduceerde neurale progenitorcellen (iNPCs) uit humane fibroblasten die zijn verkregen door een punch biopsie van de huid in minder dan 8 weken (figuur 1) mogelijk maakt. Patient-specifeke iNPCs kan verder worden onderscheiden in neuronale en gliacellen geslachten en de haven enorm potentieel voor celvervangingstherapie en de ziekte modelleren. Infectie van de fibroblasten met Oct4-, Klf4-, Sox2- en...

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Het algemene doel van deze procedure is om de klassieke Yamanaka-iPS-methode te verkorten door direct geïnduceerde neurale progenitorcellen te genereren uit een huidbiopt van een patiënt voor therapeutische toepassingen. Dit wordt bereikt door eerst een ponsbiopt bij de patiënt af te nemen om primaire fibroblastcellen te verkrijgen die in vitro gekweekt kunnen worden. De tweede stap bestaat uit het expanderen en vervolgens infecteren van de gekweekte fibroblasten met virussen die herprogrammeringsfactoren coderen om transdifferentiatie te induceren.Vervolgens moeten de vermeende omgezetten geïnduceerde neurale progenitorcel- of INPC-kolonies zorgvuldig worden geselecteerd via visuele validatie en daarna worden geïsoleerd door handmatige picking, ongeveer 20 dagen na infectie. De laatste stap is om de IPC's monoclonaal uit te breiden in neuro-inductiemedium, met als uiteindelijk doel in vitro differentiatie; daarnaast wordt immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om aan te tonen dat de direct omgezetten IPC's van de patiënt zelf in staat zijn om te differentiëren tot zowel neuronale als gliale cellen, waardoor ze een vrijwel onbeperkte bron vormen voor biomedische toepassingen. Het voordeel van deze directe conversietechniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de Yamanaka-type afleiding van geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie, is tweeledig.De conversie van DI naar multipotente geïnduceerde neurale stamcellen, die wij INS-cellen noemen, is niet alleen aanzienlijk sneller, maar ook veiliger. Hierdoor wordt de transdifferentiatieprocedure het veel haalbaarder om patiëntspecifieke cellen voor therapeutische toepassingen te produceren, met een drastisch lager risico op tumorvorming in vergelijking met IPS-cellen. Hiermee zijn we nu in staat om twee grote hindernissen van de huidige regeneratieve geneeskunde weg te nemen.Dat is klinische veiligheid en efficiëntie. Om te beginnen met de ponsbiopsie, desinfecteert u de huid van de patiënt enstelt u de huid op de plaats waar de biopsie wordt genomen plaatselijk verdoofd met 0,5 tot 1 ml mepivacainehydrochloride intracutaan. Neem het huidbiopt af met een steriele biopsiepons van 3 mm.Spoel het biopsaat met deuterium-geoxideerde fosfaatgebufferde zoutoplossing of DPBS plus 1 µL per mL gentamycine. Verwijder het vet van het biopsaat met een scalpel en een pincet. Spoel het biopsaat vervolgens nog twee keer met de buffer voordat u het volledig aspireert.Bedek het biopsiaat met deze pasta twee en incubeer dit gedurende 16 tot 18 uur bij 4 °C. Aspireer na incubatie de pasta volledig voordat het biopsiaat twee keer met DPBS wordt gewassen. Verwijder de epidermis met een pincet en was het biopsiaat vervolgens nog twee keer met DPBS.Voeg vervolgens twee milliliter collagenase type twee toe en breng dit over naar een 15 milliliter buis. Voeg collagenase toe tot een totaal volume van vijf milliliter. Incubeer gedurende 45 minuten bij 37 °C.Centrifugeer het monster gedurende vijf minuten bij 180 ×g en gooi daarna het supernatant weg. Resuspendeer de pellet in 10 milliliters DMEM foetaal kalfserum gentamicine-medium voordat u opnieuw vijf minuten centrifugeert bij 180 ×g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 milliliters van hetzelfde medium. Draag het monster vervolgens over naar een T 25 adherent weefselkweekfles en incubeer bij 37 °C 5% CO2, waarbij het medium elke drie dagen wordt ververst gedurende ongeveer twee weken.Zodra de cellen confluent zijn rond de huiddelen, worden de cellen gesplitst met trypsin EDTA zoals beschreven in het tekstprotocol. Breid de cellen verder uit door het medium elke derde dag te verversen en te splitsen wanneer de cellen confluent zijn. Nadat mycoplasma-contaminatie is uitgesloten met standaardassays, worden de cellen voorbereid voor het directe conversie-experiment door de cellen eenmaal te wassen met DPBS, waarna het DPBS wordt geaspireerd en 2,5 milliliters trypsin EDTA wordt toegevoegd. Na het incuberen van de cellen gedurende vijf minuten bij 37 °C, 5%CO2, wordt zachtjes tegen de fles getikt om de cellen los te maken.Resuspendeer de cellen in 2,5 milliliters fibroblastmedium en breng deze over naar een buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis bij 180 ×g gedurende vijf minuten en aspireer het supernatant. Resuspendeer de cellen in één milliliter fibroblastmedium en pipetteer deze op en neer om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.Tel het aantal cellen met een telkamer voor het uitplaten. 30.000 cellen per putje. Incubeer de cellen in een 24-wells plaat gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2. Stappen voor de behandeling van het virus moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskabinet met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief een chirurgisch masker om blootstelling van de slijmvliezen te voorkomen.Om de infectie uit te voeren, vervangt u eerst het bestaande celmedium door 100 µL fibroblastmedium. Resuspendeer vervolgens ontdooide aliquots van T4, KLF4, SOX2 en cmix sendi-virus in 1 mL fibroblastmedium. Voeg elk virus toe aan de cellen met een MOI van 3 en meng voorzichtig. Incubeer de cellen overnight bij 37 °C, 5% CO2. Aspireer na 24 uur het medium en voeg 500 µL neuro-inductiemedium toe. Kweek de cellen vanaf nu bij 39 °C, 5% CO2, waarbij het medium om de dag wordt ververst. Bereid op dag zes na de infectie laminine-gecoate 6-wells platen.Voeg één milliliter laminine met een concentratie van één microgram per milliliter in DPBS toe aan zes-well platen en bewaar de platen 24 uur lang bij vier graden Celsius. Splits de cellen op dag zeven na infectie met behulp van D-P-B-S-E-D-T-A zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 500 microliters D-M-E-M-F 12 toe en breng de suspensie over naar een 15 milliliter buis. Centrifugeer het monster vervolgens vijf minuten lang bij 180 ×g.Zuig het supernatant af en resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters neurale inductiemedium; zaai de cellen uit op laminine-gecoate zeswellplaten en voeg een ROCK-remmer toe tot een eindconcentratie van 10 micromolar. Kweek de cellen bij 39 °C, 5% CO2, waarbij het medium vanaf dag 14 om de dag wordt vervangen. Na infectie worden de cellen gekweekt bij 37 °C, 5% CO2; neuro-epitheliale kolonies worden rond dag 17 na infectie zichtbaar, zoals gevisualiseerd met fasecontrastmicroscopie.Ze moeten groot genoeg zijn om rond dag 20 na infectie te worden opgepikt, één dag voordat de eerste coat in een 48-well plaat met laminine wordt opgepikt, zoals beschreven in het tekstprotocol. Aspireer één dag later het laminine uit de platen en voeg 200 microliters neuro-inductiemedium toe aan de wells. Was de zes-well platen met de te plukken kolonies één keer met DPBS voordat er twee milliliters neuro-inductiemedium wordt toegevoegd.Voeg medium toe per putje van een plaat met zes putjes. Oogst de cellen mechanisch door met een dunne naald rond de kolonies te schrapen om omringende cellen te verwijderen en selecteer de kolonies met pipetpunten. Gebruik hiervoor een 200 µL pipet ingesteld op 50 µL. Draag elke kolonie over naar één putje van een laminecoate plaat met 48 putjes en maak mechanisch een enkelcellesuspensie door 10 keer op en neer te pipetteren.Voeg R kinase-remmer toe aan de cellen in een eindconcentratie van 10 micromolar. Kweek de cellen op de 48-wells plaat bij 37 graden Celsius, 5%CO2 gedurende twee dagen. Ververs het medium om de dag totdat de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken.Raadpleeg het tekstprotocol voor de expansie en cryopreservatie van de IPC's voor de differentiatie van IPC's naar een neuronale lineage-cultuur. De cellen bevinden zich op laminaat-gecoate platen. Zoals voorheen, vervang het medium door neuro-differentiatiemedium wanneer de cellen ongeveer 70% confluent zijn en blijf het medium om de dag vervangen gedurende drie weken.Splits de cellen niet tijdens de differentiatie na drie weken; de cellen moeten de neuronale marker TUJ1 tot expressie brengen om meer mature neuronen en neuronale subtypen te verkrijgen. Zet de differentiatie voort tot drie maanden voor de differentiatie van IPC's, specifiek in de richting van een gliale lijn. Vervang het medium door gliaal inductiemedium, inclusief 20 nanograms per milliliter epidermale groeifactor om differentiatie tot gliale precursorcellen te induceren.Verwijder de helft van het medium en vervang dit om de dag door vers medium gedurende ongeveer twee weken. Tijdens deze periode moeten de cellen in een verhouding van één op drie worden gesplitst in aanwezigheid van 10 micromolar R kinase-remmer wanneer na twee weken 100% confluentie is bereikt. Differentieer de cellen verder tot astrocyten door het medium te vervangen door commercieel verkrijgbaar astrocytenmedium wanneer de cellen bijna confluent zijn; door het medium elke tweede dag te blijven verversen, beginnen de cellen ongeveer zeven dagen later astrocytenmarkers tot expressie te brengen.Als de cellen 100% confluent worden tijdens het differentiatieprotocol, splits ze dan in een verhouding van één op twee. In de aanwezigheid van 10 µM RO-kinase-remmer leidde de infectie van de fibroblasten met T 4K LF four, SOX two en cmix sendi-virussen, gevolgd door kweek onder neuro-inductieve mediumcondities, tot een verandering in de morfologie van de fibroblasten en de daaropvolgende vorming van kolonies. De monoklonale cellijnen die 17 dagen na infectie waren gegenereerd, kunnen worden uitgebreid en kleuren positief voor neurale stamcelmarkers zoals SOX two, SOX one, neston en PAC six, alsofVoor de proliferatiemarker KI 67, terwijl ze de met pluripotentie geassocieerde marker T four niet tot expressie brengen.Bovendien kunnen de neurale progenitorcellen, door toevoeging van neuronale groeifactoren aan het celkweekmedium, worden gedifferentieerd tot neuronen door middel van astrocyt-differentiatie. Protocol-geïnduceerde neurale progenitorcellijnen kunnen ook worden gedifferentieerd tot gliale lijnen, beoordeeld op basis van de analyse van typische morfologische veranderingen en kleuring tegen GFAP. Door middel van deze directe conversie genereren wij multipotente geïnduceerde neurale progenitorcellen uit patiëntenfibroblasten binnen drie tot vier weken.Deze cellen kunnen voor talloze biomedische toepassingen worden gebruikt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie, diagnose en modellering van neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer en Parkinson, alsook andere neurologische aandoeningen.

derivation-adult-human-fibroblasts-their-direct-conversion-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een protocol voor de inductie van neuroblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke neurale voorouders en neuronale celtypes in het ontwikkelen van CNS voor neurale reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

This video demonstrates a technique for isolating induced neural progenitor cells (iNPCs) derived from adult human fibroblasts. It outlines the steps involved in isolating the iNPC colonies and culturing them in laminin-coated multi-well plate wells in the presence of suitable culture media that facilitate the continued proliferation and expansion of the iNPC population.

Isolating Induced Neural Progenitor Cell Colonies Derived From Adult Human Fibroblasts

This video demonstrates the process for differentiating induced neural progenitor cells (iNPCs) into neurons and astrocytes using specialized media.

Differentiating Induced Neural Progenitor Cells into Astrocytes

The video demonstrates the generation of neurons from adult human dermal fibroblasts (aHDFs). The aHDFs are reprogrammed using a lentiviral vector carrying genes for neuronal transcription factors and short hairpin RNAs (shRNAs). The shRNAs inhibit the expression of a neuronal transcriptional repressor, and the neuronal transcription factors activate genes to differentiate aHDFs into neurons. These reprogrammed aHDFs are cultured in an early and a late neuronal conversion medium to generate...

Generating Neurons by Reprogramming Human Dermal Fibroblast Cells

Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Ontdek een directe conversiemethode om fibroblasten om te zetten in neurale voorlopercellen met behulp van virale transductie. Deze techniek versnelt de generatie van patiëntspecifieke cellen voor therapeutische toepassingen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Meer video's verkennen