Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Het algemene doel van deze procedure is om zowel effector- als geheugen-T-celreacties te beoordelen met behulp van kort- en langdurige gekweekte interferon gamma L spot-assays. De beoordeling van de centrale geheugenreactie wordt bereikt door bovine perifere bloedmononucleaire cellen gedurende 13 dagen te kweken onder antigene stimulatie. De langdurige cultuur maakt het mogelijk dat effector-T-celreacties optreden en afnemen.

Interleukine twee wordt aan de culturen toegevoegd voor het onderhouden van geheugen-T-cellen. Op dag 13 worden langdurige cellen overgebracht naar L spot platen gecoat met IFN gamma capture antilichaam. De reactie van langdurige cellen op individuele mycobacteriële antigenen wordt geëvalueerd in aanwezigheid of afwezigheid van autologe antigeenpresenterende cellen.

APC's APC's worden geïsoleerd uit verse p BMC's door adhesie op dag 13. Bovendien wordt de reactie van vers geïsoleerde PBMC's onder ex vivo omstandigheden geëvalueerd als een correlate van effectorreacties. In verschillende onderzoeken is aangetoond dat de bovine langdurige gekweekte sbot-respons op mycobacteriële antigenen na vaccinatie positief correleert met de vaccin-efficiëntie.

Ook bevatten langdurige T-celculturen voornamelijk centrale geheugen-T-cellen bij zowel mensen als runderen. Om de langdurige gekweekte L spot-assay uit te voeren. 60 ml bloed wordt afgenomen van m bovis geïnfecteerde of gevaccineerde dieren via jugulaire venepunctie en PBMC's worden geïsoleerd door dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

De celad concentratie moet worden aangepast tot 4 miljoen cellen per ml. In compleet RPMI-medium begint u met het plateren van 500 microliters microbacteriële antigenen, in dit geval TB 10.4 en antigeen 85 A en het gezuiverde eiwitderivaat van em bovis-cultuur genaamd PPDB. Voeg vervolgens 500 microliters PBMC toe die geïsoleerd is van elk dier met vier replica's per dier.

Let op dat alle wellen gestimuleerd moeten worden. Controles zoals geen stimulatie of mitogenen zijn niet nodig in deze stap. Bewaar de plaat bij 39 Celsius, de normale temperatuur van runderen, gedurende 13 dagen. Op dag drie en zeven, gooit u 500 microliters van elk wel weg door voorzichtig te pipetten om de celaag aan de bodem van de wellen niet te verstoren.

Ververs het volume met compleet PMI dat IL Twee bevat. Plaats de plaat in de incubator. Op dag 10, gooit u 750 microliters van het supernatant van elk wel weg en ververst u met compleet RPMI zonder IL twee. Op dag 12, pipet en gooit u één ml supernatant van elk wel weg en ververst u met compleet RPMI zonder IL twee. Bereid ook de L spot-plaat voor om gecoat te worden met IFN Gamma capture antilichaam. Pipet eerst 15 microliters van 35% alcohol in elk wel met behulp van een multikanaals pipetter. Deze stap verhoogt de spotdefinitie.

Was de wellen zes keer met 300 microliters PBS. Voeg 100 microliters van het capture antilichaam toe bij acht microgram per ml in PBS. Pipetten moet voorzichtig worden gedaan tijdens alle procedures, zonder dat de pipettentips de membraan aan de bodem van de wellen raken of beschadigen. Plaats de plaat in een plastic zak en bewaar deze bij vier Celsius overnacht.

Op dag 13, neemt u 60 ml bloed af door jugulaire venapunctie van dezelfde dieren die op de eerste dag zijn bemonsterd. Isoleer de PBMC en pas de concentratie aan tot 2 miljoen cellen per ml. Label de L spot-plaat goed voor elke set monsters.

Langdurige cellen plus APC's, langdurige cellen zonder APC's en ex vivo cellen. Gooi het capture antilichaam van de Ellis spot-plaat weg, was de wellen met 300 microliters PBS met tween. Herhaal zes keer, gooi het wasvloeistof weg en pipet.

50 microliters van vers geïsoleerde p BMC's in de wellen toegewezen voor langdurige cellen. Plus APC's. Blokkeer andere wellen van de L spot-plaat met 200 microliters per well van compleet RPMI. Om de fenotypre van cellen te evalueren door middel van flowcytometrie parallel met de L spot-assay-plaat.

50 microliters van vers geïsoleerde cellen in een goed gelabelde ronde bodem 96 well-plaat. Dit is een aanvullende assay die wordt uitgevoerd in combinatie met de gele spot-assay om het fenotype van reagerende cellen te bepalen. Bewaar de platen gedurende 90 minuten bij 39 Celsius in een 5%CO2 incubator, waardoor antigeenpresenterende cellen kunnen hechten.

Incubeer ook 200 ml compleet RPMI om het op te warmen tijdens deze 90 minuten incubatiestap. Verzamel de langdurig gekweekte cellen van de 24 well-plaat. Combineer de quad-duplicaten van elk dier in een enkele 15 ml conische buis.

Centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 400 Gs. Gooi het supernatant weg door de buis om te keren, los het celaagje en voeg vijf ml PBS toe. Herstel het pelaatje voorzichtig indien nodig. Was de cellen twee keer en pas vervolgens de celad concentratie aan tot 200.000 cellen per ml. Na de 90 minuten incubatie, neemt u de LPO-plaat en het compleet RPMI uit de incubator.

Plaats de LPO-plaat gedurende 30 seconden op een plaatshaker. Verwijder vervolgens niet-aderente cellen door de plaat om te keren, pipet 150 microliters per well van warm compleet RPMI. Schud de plaat en gooi het wasvloeistof weg.

Herhaal drie keer, gooi zoveel mogelijk vloeistof weg en voeg honderd microliters per well van elk antigeen toe in de geschikte wellen met adherente APC's. Pipet vervolgens 100 microliters per well van langdurig gekweekte celsuspensie. 200.000 cellen per ML in de wellen gelabeld als langdurige cellen plus APC's.

Zorg ervoor dat de langdurige cellen die in deze stap worden toegevoegd, van hetzelfde dier zijn als de APC's die al in de wellen aanwezig zijn. Meng geen APC's en langdurig gekweekte cellen van verschillende dieren. Pipet ook 100 microliters per well van langdurig gekweekte celsuspensie bij een concentratie van 200.0