In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA

Het algemene doel van deze procedure is om bacteriën te lokaliseren in in paraffine ingebedde weefsels met behulp van DIG-gelabelde 16 s ribosomale RNA, RNA, die op DNA-sondes target. Dit wordt bereikt door eerst de sonde voor te bereiden met PCR-amplificatie en DIG-labeling. De tweede stap is het voorbereiden van de weefselsneden om meer toegankelijke doelplaatsen en minder achtergrondbinding te hebben.

Vervolgens worden de voorbereide weefselsneden gehybridiseerd met de DIG-gelabelde sonde. Ten slotte wordt de gehybridiseerde sonde gedetecteerd met alkalische fosfatase, gelabelde anti-D dig antilichamen. Uiteindelijk kan deze in C twee hybridisatiemethode de aanwezigheid van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels aantonen.

Het domeinvoordeel van deze detectie ten opzichte van bestaande methoden zoals ING is dat deze methode bacteriën SHS kan detecteren binnen de context van sommige histologische structuren. Deze methode kan inzicht geven in de pathogenese, maar zal verschillende ontstekingen zoals parodontitis en R planeet. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de weefselvoorbereiding en hybride spijsverteringsstappen moeilijk te uitvoeren zijn omdat de weefselsneden gemakkelijk beschadigd raken.

Om de U bacteriën sonde te maken, gebruik een 70 basenpaar DNA-fragment als sjabloon en twee 15 basenpaar primers om de sonde via PCR te versterken. Verzamel het amplicon in buffer op een bekende concentratie. Label vervolgens de sonde met een dig DNA-labeling en detectiekit.

Meng eerst drie microgram van de sonde in 15 microliter water. Denatureer de sonde in de hitteblok gedurende 10 minuten bij 95 graden Celsius. Plaats vervolgens de gedenatureerde sonde op ijs.

Voeg vervolgens twee microliter 10 XH nucleotiden, twee microliter DN NTP's en één microliter canal enzym toe. Laat de sonde na het mengen 24 tot 48 uur incuberen bij 37 graden Celsius. Stop de reactie door het mengsel op te warmen tot 65 graden Celsius.

Meet vervolgens de DNA-concentratie van de gelabelde sonde bij 260 nanometer en pas de concentratie aan tot 100 nanogram per microliter. Gebruik de kit om de gevoeligheid van de sondes eerst te controleren op een nylonmembraan, laad één microliter van een serieel verdunde positieve controle. Sonde en DIG-gelabelde sonde.

Laat het membraan vijf minuten drogen. Eenmaal droog, dompel het membraan kort in twee XSSC en breng het vervolgens over naar een incubator van 80 graden Celsius gedurende een uur. Om de DNA na de incubatie te immobiliseren, dompel het membraan kort in maleïnezuurbuffer, breng het vervolgens over naar blokkeringsbuffer geconcentreerd met AP-geconjugeerde antilichamen bij een verdunning van één op 5.000 na een half uur.

Was het membraan in MABT. Meng vervolgens 40 microliter N-B-T-B-C-I-P in twee milliliter detectiebuffer. En na het bad, voeg dit mengsel gedurende één minuut toe aan het membraan.

Na het verwijderen van de paraffine en het rehydrateren van de weefselsneden zoals beschreven in het tekstprotocol, bereid ze voor op in C twee hybridisatie door eerst de dia's 20 minuten in 0,1 normale zoutzuur te dompelen. Na het zuurbad, spoel de dia's af met DEPC-behandeld water gedurende 30 seconden. Gebruik vervolgens een wasstift om de specimens op elke dia te omlijnen.

Voeg vervolgens 50 tot 400 microliter proteïnase K-oplossing toe aan de specimens, afhankelijk van hun grootte. Laat het enzym 30 minuten bij 37 graden Celsius werken en was de dia's vervolgens in DEPC-behandeld een XPBS gedurende één minuut. Breng de dia's nu over in 4% paraform aldehyde in DEPC-behandeld PBS gedurende 10 minuten.

Spoel het fixeermiddel af met PBS zoals eerder. Dompel vervolgens de dia's gedurende 20 minuten in 0,1 molaire triethanolaminehydrochloride bij pH acht met 0,5% azijnzuur en hydride, was de dia's af met schoon water zoals eerder. Start nu de in C twee door de dia's eerst 20 minuten in twee XSSC te dompelen.

Verdun ondertussen de gelabelde sonde tot één nanogram per microliter in hybridisatiebuffer voor een negatieve controle. Gebruik 10 keer de concentratie van niet-gelabelde sonde sonde. Denatureer vervolgens de sondes door ze gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius te verhitten, gevolgd door snel afkoelen op ijs.

Breng vervolgens dezelfde hoeveelheid sonde verdunning op elke dia aan als de proteïnase K die eerder was aangebracht. Dek vervolgens voorzichtig af en verzegel de secties met nagellak. Verhit de dia's nu gedurende 10 minuten op 90 graden Celsius op een PCR-machineblok en breng ze de volgende dag over naar een bevochtigde incubator van 45 graden Celsius voor een nacht.

Koel de dia's af bij vier graden Celsius gedurende een half uur en verwijder vervolgens voorzichtig de dekglasjes. De weefsels zijn kwetsbaar. Ten slotte voert u de dia's door een reeks SSC-buffer bij kamertemperatuur.

Was eerst de NC twee gehybridiseerde dia's gedurende vijf minuten in MABT. Breng vervolgens 50 tot 400 microliter blokkeringsoplossing in 1% tween 20 gedurende 20 minuten aan. Na de blokkeringsincubatie breng je 50 tot 400 microliter van een naar 1000 anti-D dig alkalische fosfatase antilichaam en blokkeringsoplossing aan.

Laat het 90 minuten binden bij 37 graden Celsius nadat de primaire is aangebracht. Was de dia's gedurende 10 minuten in MABT. Plaats de dia's vervolgens vijf minuten in detectiebuffer met 1% tween 20.

Breng nu 50 tot 400 microliter van één millimolair ole in detectiebufferoplossing op elke dia aan en incubeer ze gedurende vijf minuten om de endogene alkalische fosfatase te inactiveren. Voeg vervolgens 50 tot 400 microliter N-B-T-B-C-I-P toe, verdund in detectiebuffer bij één naar 10