Name: In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer bacteriën lokaliseren in paraffine-ingebette weefsels met DIG-gelabelde 16S rRNA-DNA-probes. Deze methode detecteert bacteriën in histologische context voor onderzoek naar periodontitis, kanker en inflammatoire ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een subsidie ​​(2013R1A1A3005669) van de National Research Foundation Korea en een subsidie ​​(HI13C0016) van de Koreaanse Health Technology R &amp; D Project, Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn.

1. Probe Voorbereiding <ol><li> PCR-amplificatie van de probe <ol><li> Voor P. gingivalis-specifieke sonde, versterken van een 343 bp DNA-fragment van P. gingivalis 16S rRNA met PCR met gebruik van de genomische DNA van P. gingivalis en de volgende primers: 5&#39;-AAC TGC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;en 5&#39;-ACT CGT CGT TAT ATC GCC TC-3&#39; 10. Voer amplificaties met de volgende cyclusomstandigheden: 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 sec gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C 10,11. </li><li> Versterken de eubacteriële probe onder toepassing van een 70-bp DNA fragment (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;) gesynthetiseerd als een oligonucleotide en de volgende primers: 5&#39;- CTG CAG GTR GGY CMT-3&#39; en 5&#39;-AGG GTT GCG CTC GTT-3 &#39;11. Voer amplificaties met de volgende cyclus voorwaarden: 40 cycli9 bij 4 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 s, gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C 11,12. </li><li> Precipiteren van de PCR producten (≥500 pl) door toevoeging 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol (bij een 10: 1: 2 verhouding) en incubatie bij -20 ° C gedurende 2 uur. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 14.000 xg gedurende 15 min, resuspendeer de pellet in 100 ui TE-buffer, en meet de DNA-concentratie optische dichtheid bij 260 nm. </li></ol></li><li> DIG-labelen met een DIG DNA labeling en detectie kit <ol><li> Meng 3 ug van het probe met water tot een eindvolume van 15 pl. </li><li> Denatureren het DNA bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs. </li><li> Voeg 2 ui 10X hexanucleotide mix, 2 pl dNTP mix-labeling, en 1 pl Klenow enzym 15 pi van het gedenatureerde DNA. </li><li> Mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende 24 uur tot 48 uur en stop de reactie door verwarming bij 65 ° C. </li></ol></li><li> Controleer de gevoeligheid van de met DIG gemerkte probe onder toepassing van een DIG DNA labeling en detectie kit <ol><li> Handmatig laden 1 pl seriële verdunningen van de positieve controle probe in de kit en 1 ng van het met DIG gemerkte probe op nylon membraan en droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitraat, pH 7,0) en incuberen van het membraan bij 80 ° C gedurende 1 uur om het DNA te immobiliseren. </li><li> Kort geniet het membraan maleïnezuur buffer (MAB, 0,1 M maleïnezuur, 0,15 M NaCl, pH 7,5) en geïncubeerd met anti-DIG alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd antilichaam verdund (1: 5000) in 6 ml blokoplossing ontvangen in de kit bij KT gedurende 30 min. </li><li> Was het membraan met MABT (MAB met 1% Tween 20) en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, pH 9,5) op de toepassing membraan gedurende 1 min. Wanneer de gevoeligheid van de gemerkte probeniet bevredigend, herhaal stappen van 1.1.3 naar 1.3.4. </li><li> Meet de DNA concentratie van de gelabelde probe (OD260) en de concentratie aan te passen aan 100 ng gl -1. </li></ol></li><li> Controleer de specificiteit van de DIG-gelabelde probe <ol><li> Denatureren genomische DNA-monsters (25 ng 3 gl -1 per elk monster) uit verschillende bacteriële species, waaronder de bacterie waarop de specifieke probe bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs. </li><li> Handmatig laadt het gedenatureerde DNA op het nylon membraan en droog gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer en incubeer het membraan bij 80 ° C gedurende 2 uur om het DNA te immobiliseren. </li><li> Blokkeer het membraan met een blokkerende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Verdun de sonde 1 ng gl -1 in hybridisatiebuffer, denatureren de verdunde probes en toepassing op het membraan. </li><li> Incubeer het membraan bij 45 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was het membraan driemaal met 2x SSC buffer. </li><li> Kort weken het membraan in MAB. </li><li> Incubeer met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam verdund (1: 2000) in 6 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was het membraan met MABT en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer toepassing. </li><li> Indien de probe niet de verwachte specificiteit te bereiken, verhoog de hybridisatietemperatuur tot de specificiteit waargenomen. </li></ol></li></ol> 2. In Situ Hybridization Opmerking: Om het drogen van de monsters en reagentia te voorkomen, voeren alle incubaties in een vochtige kamer bekleed met natte papieren handdoeken. <ol><li> De-paraffinization en rehydratatie van weefselsecties <ol><li> Bereid 4 pm dikke coupes van in paraffine ingebedde blokken. Formaline, paraformaldehyde, en zink-gebaseerde fixatief zijn compatibel met dit protocol. </li><li> Bereid alle reagentia met DEPC-behandeld water. </li><li> Verhit objectglaasjes in een droogoven bij 60 ° C gedurende 30 min en incubeer slides bij kamertemperatuur 30 min. </li><li> Dompel glaasjes in 100% xyleen gedurende 5 min driemaal; gebruiken verse xyleen per keer. Opmerking: Doe dit-de wassende procedure in een chemische zuurkast. </li><li> Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten tweemaal met verse ethanol telkens en hydrateren specimens in serie 90%, 80% en 70% ethanol oplossing gedurende 5 minuten elk. </li><li> Dompel slides in DEPC-behandeld water gedurende 1 min en was glaasjes in DEPC-behandeld PBS (pH 7,4) gedurende 6 min. </li></ol></li><li> Voorbehandelingen van weefselsecties <ol><li> Dompel slides in 0,1 N zoutzuur gedurende 20 minuten en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec. </li><li> Teken een hydrofobe barrière rondom exemplaren met een wax pen. Opmerking: De grootte van de hydrofobe barrière afhankelijk van de grootte van specimens. Daarom is de hoeveelheden reagentia die in de volgende stappen afhankelijk van de grootte van monsters maar moeten de hy vullendrophobic barrière (50 ul voor kleine monsters en 400 ul voor grote exemplaren). </li><li> Behandel specimens met 50 tot 400 ul proteinase K (1-10 ug ml -1 in DEPC-behandeld PBS) in een droge oven bij 37 ° C gedurende 30 min en was glaasjes in DEPC-behandeld 1x PBS gedurende 1 minuut. </li><li> Geniet slides in 4% paraformaldehyde in DEPC-behandeld PBS gedurende 10 minuten, daarna wassen objectglaasjes in DEPC-behandeld PBS gedurende 1 minuut. </li><li> Geniet slides in 0,1 M triethanolamine-HCl (pH 8,0) bevattende 0,5% azijnzuuranhydride gedurende 20 min en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec. </li></ol></li><li> Hybridisatie met probe en wassen <ol><li> Dompel dia&#39;s in 2x SSC buffer gedurende 20 min. </li><li> Verdun de sonde 1 ng gl -1 in hybridisatie buffer (4 x SSC, 50% [vol / vol] formamide, 1 x Denhardt&#39;s oplossing, 10% [gewicht / volume] dextraansulfaat, 0,1% [gewicht / volume] natriumdodecylsulfaat, 0,4 mg ml -1 zalmsperma DNA). Voor negatieve controles, meng de gelabelde probe metEen 10-voudige overmaat van niet-gemerkte probe. </li><li> Denatureren de verdunde probes en 50-400 gl toegepast op weefselcoupes. Leg een deksel slip op de dia en afdichting met nagellak. </li><li> Heat slides in PCR machine bij 90 ° C gedurende 10 min en incubeer objectglaasjes in een vochtige kamer O / N bij optimale temperatuur 45 ° C of bepaald bij stap 1.4.11. </li><li> Koel de objectglaasjes bij 4 ° C gedurende 30 minuten, verwijder dekglaasjes en dompel dia op seriële SSC buffer als volgende: 4 x SSC gedurende 10 min, voorverwarmde (45 ° C) 2 x SSC gedurende 20 minuten, 2 x SSC gedurende 10 min en 0,2 x SSC gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Detectie met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam <ol><li> Was de glaasjes in MABT gedurende 5 min. </li><li> Blokkeer met 50 tot 400 ul van blokkeeroplossing met 1% Tween 20 gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 50 tot 400 gl anti-DIG-AP-antilichaam verdund in blokkerende oplossing (1: 1000) anld incuberen bij 37 ° C gedurende 90 min. </li><li> Was de glaasjes in MABT gedurende 10 min. </li> &lt;li&gt; Dompel slides detectie buffer die 1% Tween 20 gedurende 5 minuten. </li><li> Behandelen met 50 tot 400 μ van 1 mM levamisol (detectie buffer die 1% Tween 20) gedurende 5 minuten om endogene alkalische fosfatase te inactiveren. </li><li> Verdeel 50 tot 400 ul van de voorgemengde NBT / BCIP oplossing (verdund in detectiebuffer op 1: 100) op elk monster en incubeer objectglaasjes in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur totdat het ontwikkelde signaal bevredigend. </li><li> Spoel slides met gedeïoniseerd water visualisatie stoppen en 50-400 gl 0,05% [gewicht / volume] methyl green als teller beits bij 37 ° C gedurende 10 min. </li><li> Spoel de dia&#39;s met gedeïoniseerd water, uitdrogen in 100% ethanol, en onder te dompelen in xyleen. </li><li> Breng 80 ul van montage oplossing op elke dia en dek af met dekglaasjes. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
<li>Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+of+the+periodontium%3B+an+important+factor+in+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).</li>
<li>Saglie, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+bacteria+in+the+oral+epithelium+in+periodontal+disease.+II.+Immunohistochemical+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria.</a> J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).</li>
<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
<li>Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+correlative+immuno-identification+of+mononuclear+infiltrates+and+invasive+bacteria+in+diseased+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva.</a> J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Marttila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Treponema+denticola.+chymotrypsin-like+proteinase+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis.</a> J. Oral Microbiol. 6, (2014).</li>
<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier een protocol bij bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een DIG-gemerkte DNA probe is beschreven lokaliseren. De probe richt de DNA- of RNA-moleculen van bacteriële 16S rRNA-gen en het 16S rRNA-targeting probes worden ontworpen zoals deze species-specifieke of universele. De specifieke hybridisatie van het P. gingivalis -specifieke probe P. gingivalis maar niet met andere orale bacteriën werd aangetoond 10. In tegenstelling, de eubacteriële probe hybridiseerde met elke...

Bacteriën spelen een rol in de etiologie van diverse orale aandoeningen zoals periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis en osteomyelitis. Om de rol van bacteriën in de pathogenese van de ziekte te begrijpen en het effect van behandeling te controleren, lokalisatie van bacteriën in het weefsel van belang. De aanwezigheid van bacteriën in gingivale weefsel van patiënten met periodontitis is aangetoond met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie 1,2, immunohistochemie en immunofluorescentie middel van bacteriën antilichamen 3-7 en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 8 met een fluorescentie- gelabelde oligonucleotideprobe gericht op 16S rRNA. Toch zijn deze methoden niet op grote schaal gebruikt vanwege technische beperking of moeilijkheden. Vergeleken met antilichamen, probes gericht 16S rRNA zijn gemakkelijk te produceren en het bereiken species-specificiteit. FISH heeft bewezen een uitstekend hulpmiddel voor de visualisatie van bact zijneria in hun natuurlijke omgevingen zoals plaque biofilm. De toepassing van FISH weefselmonsters is beperkt door autofluorescentie van verschillende weefselcomponenten. Bijvoorbeeld, de sterke autofluorescentie van rode bloedcellen vaak belemmert de toepassing van fluorescentietechnieken ontstoken weefsel wanneer zij omvatten bloeden 9. Om binnen de ontstoken tandvleesweefsels bacteriën lokaliseren derhalve een in situ hybridisatie onder toepassing van een digoxigenine (DIG) -gemerkte DNA-probe is ontwikkeld en succesvol toegepast 10,11. Hier een gedetailleerd protocol voor de lokalisatie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp P. gingivalis-specifieke en universele eubacteriële probes beschreven. Het is met name gericht op standaardisatie van de werkwijze, zodat vergelijkbare resultaten kunnen worden weergegeven in andere laboratoria. Dit protocol maakt lokalisatie van bacteriën in hun histologische context en de results zijn zeer reproduceerbaar. De beschreven protocol kan worden gebruikt om bacteriën te lokaliseren hetzij een species-specifieke of universele wijze in verschillende weefsels. De universele probe is met name nuttig voor detecteren van bacteriën in polymicrobiële ziekten en een potentiële rol bacteriën bestuderen ziekten waarbij de rol van specifieke bacteriën niet bekend.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuur-anhydride</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50% Dextran sulfaat oplossing</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt&rsquo;s oplossing</td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNA label- en detectiekit</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; Pen</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Maleïnezuur</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Methylgroen</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Zalmaksperma-DNA-oplossing</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research organics</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte dna-digoxine probe targeting 16s rrna

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

De aanwezigheid van bacteriën in het zakepitheel en onderliggende bindweefsel in gingivale biopsieën van patiënten met parodontitis is gemeld met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie, immunohistochemie of immunofluorescentie met behulp van bacteriespecifieke antilichamen, en fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met behulp van een fluorescentie-gelabelde oligonucleïde sonde. Niettemin worden deze methoden niet veel gebruikt vanwege technische beperkingen of moeilijkheden. Hier is een methode geïntroduceerd om bacteriën in paraffine-ingebedde weefsels te lokaliseren met behulp van DIG-gelabelde DNA-sondes. De paraffine-ingebedde weefsels zijn de meest voorkomende vorm van biopsieweefsels die beschikbaar zijn in pathologiebanken. Bacteriën kunnen worden gedetecteerd op een soortspecifieke of universele manier. Bacteriële signalen worden gedetecteerd als discrete vormen (coccus, staaf, fusiforme en harige vorm) van bacteriën of verspreide vormen. De techniek maakt het mogelijk om andere histologische informatie te verkrijgen: de epithelia, bindweefsel, inflammatoire infiltraties en bloedvaten worden goed onderscheiden. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van bacteriën in verschillende ziekten te bestuderen, zoals parodontitis, kanker en inflammatoire immuunziekten.

Figuur 1 toont dot blotting van DIG-gelabelde probes vergeleken met de positieve controle probe in de kit om de gevoeligheid te bepalen. De 343 bp P. gingivalis-specifieke probe is 25 maal gevoeliger dan 70 bp eubacteriële probe. Figuur 2 toont in situ-hybridisatie van gingivale weefsel van patiënten met chronische periodontitis voor detectie van P. gingivalis en eubacteria. De bacteriële signalen getoond in violet, werden gedetecteerd binnen het epitheel, de ...

Hier is een methode beschreven om bacteriën in paraffine-ingebedde weefsels te lokaliseren met behulp van DIG-gelabelde 16S rRNA-targeterende DNA-sondes. Dit protocol kan worden toegepast om de rol van bacteriën in verschillende ziekten zoals parodontitis, kankers en inflammatoire immuunziekten te bestuderen.

In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Het algemene doel van deze procedure is om bacteriën in paraffine-ingebed weefsel te lokaliseren met behulp van DIG-gelabelde DNA-probes die gericht zijn op 16 s ribosomaal RNA. Dit wordt bereikt door eerst de probe voor te bereiden via PCR-amplificatie en DIG-labeling. De tweede stap bestaat uit het voorbereiden van de weefselsneden om meer toegankelijke targetlocaties te creëren en aspecifieke achtergrondbinding te verminderen.Vervolgens worden de geprepareerde weefselcoupes gehybridiseerd met de dig-gelabelde probe. Ten slotte wordt de gehybridiseerde probe gedetecteerd met alkalische fosfatase-gelabelde anti-D dig-antilichamen. Uiteindelijk kan deze in-situ hybridisatiemethode de aanwezigheid van bacteriën in paraffine-ingebedde weefsels aantonen.Het domeinvoordeel van deze detectie ten opzichte van bestaande methoden zoals ING is dat deze methode bacteriële SHS kan detecteren binnen de context van bepaalde histologische structuren. Deze methode kan inzicht bieden in de pathogenese, maar ook bij diverse ontstekingen zoals parodontitis en R planet. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor weefselpreparatie en hybride digestie lastig uit te voeren zijn omdat de weefselcoupes gemakkelijk beschadigd raken.Om de U-bacterieprobe te maken, wordt een DNA-fragment van 70 basenparen als template gebruikt en twee primers van 15 basenparen om de probe via PCR te amplificeren. Verzamel het amplicon in buffer bij een bekende concentratie. Label de probe vervolgens met een dig DNA-labeling- en detectiekit.Meng eerst drie µg van de probe in 15 µL water. Denatureer de probe in het warmteblok gedurende 10 minuten bij 95 °C. Plaats de gedenatureerde probe vervolgens op ijs.Voeg vervolgens twee microliters 10 XH nucleotiden, twee microliters DN NTPs en één microliter canal-enzym toe. Laat de probe, zodra dit is gemengd, 24 tot 48 uur incuberen bij 37 °C. Stop de reactie door het mengsel te verhitten tot 65 °C.Meet vervolgens de DNA-concentratie van de gelabelde probe bij 260 nanometer en stel de concentratie bij naar 100 nanogram per microliter. Controleer met behulp van de kit eerst de sensitiviteit van de probes door één microliter van de serieel verdunde positieve controle op een nylon membraan te laden. Probe en dig-gelabelde probe.Laat het membraan vijf minuten drogen. Dip het membraan na het drogen kort in twee XSSC en plaats het vervolgens een uur in een incubator op 80 °C. Om het DNA na de incubatie te immobiliseren, wordt het membraan kort geweekt in maleïnezuurbuffer, waarna het na een half uur wordt overgebracht naar blokkeringsbuffer waarin AP-geconjugeerde antilichamen zijn geconcentreerd in een verdunning van 1:5.000.Was het membraan in MABT. Meng vervolgens 40 µL N-B-T-B-C-I-P met twee milliliter detectiebuffer. Voeg na het bad dit mengsel gedurende één minuut toe aan het membraan.Nadat de paraffine is verwijderd en de weefselsneden zijn gerehydrateerd zoals beschreven in het tekstprotocol, worden deze voorbereid voor in situ hybridisatie. Dompel de objectglazen eerst gedurende 20 minuten onder in 0,1 normaal zoutzuur. Was de objectglazen na het zuurbad 30 seconden af met DEPC-behandeld water. Omtrek vervolgens de monsters op elk objectglas met een waspen.Voeg vervolgens, afhankelijk van de grootte van de monsters, 50 tot 400 µL proteinase K-oplossing toe aan de specimens. Laat het enzym 30 minuten inwerken bij 37 °C en was de coupes vervolgens gedurende één minuut in DEPC-behandelde 1x PBS. Breng de coupes nu voor 10 minuten over naar 4% paraformaldehyde in DEPC-behandelde PBS.Spoel het fixeermiddel af met PBS zoals eerder beschreven. Laat de coupes vervolgens 20 minuten weken in 0,1 molar triethanolaminehydrochloride bij pH 8 met 0,5% azijnzuur en hydride; spoel de coupes daarna af met schoon water zoals eerder beschreven. Begin nu met C twee door de coupes eerst 20 minuten te onderdompelen in 2X SSC.Verdun ondertussen de gelabelde probe tot één nanogram per microliter in hybridisatiebuffer voor een negatieve controle. Gebruik 10 keer de concentratie van de niet-gelabelde probe. Denatureer vervolgens de probes door ze 10 minuten lang te verhitten op 90 °C, gevolgd door een snelle afkoeling op ijs.Breng vervolgens op elke slide hetzelfde volume probe-verdunning aan als de eerder toegepaste proteinase K. Dek de coupes daarna voorzichtig af met een dekglas en seal deze met nagellak. Verhit de slides vervolgens op een PCR-machineblok bij 90 °C gedurende 10 minuten en plaats ze daarna tot de volgende dag in een bevochtigde incubator bij 45 °C overnacht.Koel de objectglazen een half uur lang af bij 4 °C en verwijder vervolgens voorzichtig de dekglasjes. De weefsels zijn fragiel. Breng de objectglazen tot slot door een reeks SSC-buffers bij kamertemperatuur.Was eerst de twee gehybridiseerde NC-dia's gedurende vijf minuten in MABT. Breng vervolgens 50 tot 400 µL blokkeringsoplossing in 1% Tween 20 aan gedurende 20 minuten. Breng na de blokkeringsincubatie 50 tot 400 µL van een 1:1000 verdunning van anti-D dig alkalische fosfatase-antilichaam en blokkeringsoplossing aan.Laat het 90 minuten binden bij 37 °C nadat het primaire antilichaam is aangebracht. Was de coupes 10 minuten in MABT. Plaats de coupes vervolgens vijf minuten in detectiebuffer met 1% tween 20.Breng nu 50 tot 400 µL van een 1 mM ole-oplossing in detectiebuffer aan op elke slide en incubeer deze gedurende vijf minuten om de endogene alkalische fosfatase te inactiveren. Voeg vervolgens 50 tot 400 µL N-B-T-B-C-I-P, verdund in detectiebuffer in een verhouding van 1:100, toe aan elke slide en laat de slides, afhankelijk van de ervaring, gedurende twee tot drie uur incuberen in een bevochtigde kamer.Spoel de objectglaasjes af met DI-water, breng vervolgens methylgreen aan in een concentratie van 0,05% gewicht/volume en laat de tegenkleuring 10 minuten inwerken op het weefsel bij 37 °C. Was de objectglaasjes opnieuw met DI-water en dehydrateer ze vervolgens met 100% ethanol, gevolgd door een dompeling in xyleen.Breng tot slot 80 µL monteermedium aan en plaats het dekglas. De objectglazen werden na de probes digitaal gelabeld. Hun gevoeligheid werd vergeleken met de verdunning van de positieve controleprobe.De 43 basepaar p. gingivalis-specifieke probe was 25 keer gevoeliger dan de ontwikkelde 70 basepaar bacteriële probe. De twee probes werden vervolgens bij hoge vergroting toegepast op tandvleesweefsel van patiënten met chronische periodontitis. De verschillende vormen van bacteriën waren herkenbaar met behulp van de bacteriële probe.Terwijl de p gingivalis-specifieke probe alleen staafvormige bacteriën detecteerde, werd de tight junction-verstorende chemische stof DSS aangebracht op het gingivale slijmvlies van muizen. Weefselmonsters van deze muizen werden gebruikt om de probes in een andere context te vergelijken. Hier was de U-bacterieprobe in staat om de bacteriën te detecteren die de andere probe niet kon detecteren.Vervolgens werd de U-bacteriesonde getest op het vermogen om andere bacteriën te detecteren in coupes van longweefsel met tumoren. Bacteriën werden zowel buiten als binnen de tumor aangetroffen. Bij het onderzoeken van weefsels van patiënten met oraal lichen planus, een ziekte van onbekende etiologie, detecteerde de bacteriesonde bacteriële signalen binnen de cellen van het epitheel en de lamina propria waar inflammatoire infiltratie werd waargenomen.Sinds de ontwikkeling heeft deze techniek onderzoekers op het gebied van infectieziekten geholpen om de bacteriële invasie in weefsels bij zowel mensen als dieren te onderzoeken na deze procedure. Andere methoden, zoals immunochemische detectie en groei van celmarkers, kunnen worden ingezet om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welk type cellen de bacteriën binnen de weefsels huisvesten.

in-situ-detection-bacteria-within-paraffin-embedded-tissues-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben onlangs melding gemaakt van een nieuwe benadering voor het genereren van fluorogene DNAzyme probes die kan worden toegepast op het opzetten van een eenvoudige, "mix-and-lezen" TL-test voor bacteriële detectie. Deze speciale DNA probes katalyseren de splitsing van een chromofoor gemodificeerde DNA-RNA chimère substraat in aanwezigheid van ruwe extracellulaire mengsel (CEM) door een bepaald bacterie, waardoor vertaling bacteriële detectie in fluorescentiesignaal generatie. In dit...

Detectie van bacteriën met behulp van fluorogene DNAzymes

Source: Choi, Y. S., et al. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the in situ detection of bacteria in mouse gingival tissue sections using digoxin-labeled DNA probes targeting bacterial DNA. The section is incubated with the probe. Alkaline phosphatase-conjugated antibodies specific to digoxin are added. Endogenous phosphatases are inactivated, and a colored precipitate is...

In Situ Detection of Bacteria in Mouse Gingival Tissue Sections

This video demonstrates the visualization of bacteria in deparaffinized bladder tissue from a urinary tract-infected patient. Fluorescently-labeled probe hybridized with bacterial 16s ribosomal RNAs reveals the tissue-associated bacteria and their distribution, providing valuable spatial insights into their density within the sample.

Visualization of Bacteria in Bladder Biopsy Sections via Fluorescence In Situ Hybridization

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Het doel van deze video wijzen voor geautomatiseerde DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) referentiestandaard cellijnen en digitale druppeltje PCR (ddPCR) analyse zeldzame mutaties te detecteren in een klinische setting voeren. Detecteren van mutaties in FFPE monsters toont de klinische bruikbaarheid van ddPCR in FFPE monsters.

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

Het doel van dit protocol is voor het uitvoeren van in situ hybridisatie op volwassen koraal monsters die zijn ingesloten in paraffine en gesegmenteerd in glas dia's. Dit is een kwalitatieve methode gebruikt voor het visualiseren van de ruimtelijke uitdrukking van een sonde van de anti-zin RNA in paraffine-ingebedde weefsels.

In Situ Hybridisatie technieken voor paraffine-ingebedde volwassen koraal monsters

Dit protocol is voor de onbevooroordeelde detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in patiënten biopsieën door 16s rRNA in situ hybridisatie en confocale microscopie.

Detectie van weefsel-Resident bacteriën in blaas biopsies door 16S rRNA fluorescentie in situ hybridisatie

Dit gestroomlijnde protocol beschrijft een workflow om bacteriën in complexe weefselmonsters te detecteren en in beeld te brengen, van het fixeren van het weefsel tot het kleuren van microben met fluorescerende in situ hybridisatie.

Visualisatie van darmmicrobiota-gastheerinteracties via fluorescentie in situ hybridisatie, lectinekleuring en beeldvorming

Intestinale microben, waaronder extracellulaire bacteriën en intracellulaire pathogenen zoals het Orsay-virus en microsporidia (schimmels), worden vaak geassocieerd met wilde Caenorhabditis-nematoden . Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van microben die C. elegans-nematoden koloniseren en / of infecteren, en voor het meten van de pathogenenbelasting na gecontroleerde infecties in het laboratorium.

RNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om microbiële kolonisatie en infectie in caenorhabditis elegans darmen te visualiseren

Dit protocol biedt een reproduceerbare methode om genamplificatie te visualiseren in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters.

Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie

Leer bacteriën lokaliseren in paraffine-ingebette weefsels met DIG-gelabelde 16S rRNA-DNA-probes. Deze methode detecteert bacteriën in histologische context voor onderzoek naar periodontitis, kanker en inflammatoire ziekten.

In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA (Video) | JoVE Journal

In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA

Meer video's verkennen