Ontwerp en constructie van kunstmatige extracellulaire matrix (AECM) Eiwitten uit Escherichia coli Voor Skin Tissue Engineering
11 juni 2015
Recombinante technologieën hebben materiaalontwerpers in staat gesteld om nieuwe kunstmatige eiwitten te creëren met aangepaste functionaliteit voor toepassingen in weefselengineering. Bijvoorbeeld, kunstmatige extracellulaire matrix-eiwitten kunnen worden ontworpen om structurele en biologische domeinen te bevatten die zijn afgeleid van natuurlijke ECM's. Hier beschrijven we de constructie en zuivering van aECM-eiwitten die elastine-achtige herhalingen bevatten.
Het algemene doel van deze procedure is om de stappen te demonstreren die betrokken zijn bij de constructie en productie van kunstmatige ECM-eiwitten of A ECM die elastine-achtige herhalingen bevatten. Dit wordt bereikt door eerst recombinante genen te construeren die coderen voor de A ECM-eiwitten. Vervolgens worden de recombinante genen in bacteriële gastheren ingebracht.
Op dit punt worden de recombinante eiwitten in de bacteriële gastheren tot expressie gebracht en vervolgens geoogst na eiwitextractie door cellyse. De laatste stap is het zuiveren van de eiwitten met behulp van inverse transitiecycli of ITC, die de unieke faseovergangsgedrag van elastine exploiteert. Zoals polypeptiden.
Centrifugeringscycli worden uitgevoerd bij vier graden Celsius en 37 graden Celsius. Uiteindelijk worden gelelektroforese en western blot-technieken gebruikt om de recombinante eiwitten te identificeren en hun zuiverheid te bepalen. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals affiniteitskolommen, is dat we grote hoeveelheden eiwitten relatief goedkoop kunnen extraheren.
Begin deze procedure met alle ligamentontwerp zoals beschreven in het tekstprotocol. Zodra de oligomeren zijn verkregen, worden alle DNA-oligomeren aangelegd om de gewenste gensequentie te verkrijgen. Los eerst DNA-oligonucleotiden op in DNA-oligobuffer tot een eindconcentratie van één microgram per microliter.
Voeg vier microliters van elk all-ligament toe aan 32 microliters DNA en knielende buffer om een totaal 40 microliter mengsel te bereiken. Kook vervolgens een beker water op een hotplate en dompel het mengsel vijf minuten onder. Bij 95 graden Celsius verwijdert u de beker en koelt u de hele setup geleidelijk af in een styrofoam doos overnacht, de oligomeren zijn nu geknield en klaar voor digestie.
Voeg de overeenkomstige restrictie-enzymen toe om de al-oligomeren en gastheervectoren afzonderlijk te verteren zoals beschreven in het tekstprotocol Vertering gedurende drie tot vier uur bij 37 graden Celsius. Na het draaien van de verteringsproducten op een agarosegel en het zuiveren van het DNA, combineer de gen van belang sequentieel door de verteerde DNA-invoegsel in de plasmidevector te liggen met T vier ligase. Gebruik het recept in het tekstprotocol, incubeer de ligatiemengsel bij kamertemperatuur gedurende twee uur.
Transformeer vervolgens de cellen met behulp van warmteschok door Ali. Pipetteer 50 microliters van competente cellen in schone, voorgekoelde microcentrifugebuizen. Pipetteer vijf microliters van de ligatiemengsel in de cellen en pipet gedurende zachtjes omhoog en omlaag om te mengen.
Laat het mengsel 20 minuten op ijs staan. Dompel vervolgens de microcentrifugebuis met de cellenmix in een waterbad van 42 graden Celsius gedurende twee minuten en keer terug naar ijs gedurende twee minuten. Voeg 500 microliters SOC-medium toe aan de microcentrifugebuis en incubeer gedurende één uur bij 37 graden Celsius met schudden.
Na incubatie, verspreid 50 tot 500 microliters van de cellenligatiemix op een twee keer YT-augerplaat met ampicilline die voorverwarmd is tot kamertemperatuur. Incubeer de platen met de bodem naar boven bij 37 graden Celsius overnacht. De volgende dag, pluk DNA-kolonieën van de augerplaat met schone pipettentips.
Laat de kolonieën groeien in vijf milliliter twee keer YT-medium met ampicilline overnacht bij 37 graden Celsius met schudden de volgende dag. Gebruik een plasmide-isolatiekit volgens het protocol van de fabrikant om de DNA-plasmiden voor elke kolonie te extraheren.
Elueer de DNA met 50 microliters water na transformatie van het recombinante plasmide in de bacteriële expressiegastheer zoals beschreven in het tekstprotocol. Haal een kolonie van de getransformeerde augerplaat op met een pipettetip en inoculeer 10 milliliter steriele, geweldige bouillon of TB-medium dat zowel ampicilline als chlooramfenicol antibiotica bevat in een testbuis.
Incubeer deze startercultuur bij 37 graden Celsius overnacht met schudden bij 225 RPM. Breng vervolgens 10 milliliter van de startercultuur over in één liter vers en sterieel TB-medium. Aangevuld met dezelfde antibiotica in een drie liter erlin Meyer-kolf.
Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius met schudden bij 225 RPM gedurende twee tot drie uur. Observeer de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nanometer of OD 600 om te bevestigen dat deze 0,6 tot 0,8 heeft bereikt door één milliliter cultuur in een lege Q vet te pipetten voor aflezing. Induceer vervolgens de cultuur met IPTG tot een eindconcentratie van één millimolair en incubeer bij 37 graden Celsius met schudden bij 225 RPM nog eens vier uur.
Oogst de cellen door de cultuur over te brengen naar één liter centrifugeflessen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg, weeg de cellenpellets en suspendeer in 10 buffer bij 0,5 gram per milliliter. Vries de gesuspendeerde cellencultuur overnacht bij min 80 graden Celsius in.
De volgende dag ontdooi de bevroren cellencultuur in een waterbad bij kamertemperatuur of op ijs. Voeg deoxy ribonuclease één ribonuclease a en fenylmethylsulfonylfluoride toe aan de cellen. Homogeniseer de oplossing tijdens het ontdooien met langzaam roeren.
Nadat alle gesuspendeerde cellen zijn ontdooid, pas de oplossing zorgvuldig aan op pH 9,0 om de eiwitsolubiliteit in water te verhogen door zes N natriumhydroxide druppelsgewijs toe te voegen met roeren op ijs om een homogene consistentie te bereiken. Licentie de cellen vervolgens door ultrasone disruptie gedurende 20 minuten op ijs, met behulp van een twee millimeter diameter platte tip en een vijf seconden puls.
Centrifugeer de cellenoplossing gedurende 30 minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius. Breng de supernatant over naar een schone, lege fles en bewaar bij vier graden Celsius voor latere zuivering. Resuspendeer ondertussen de cellenpellet opnieuw met 10 buffer en bewaar 20 microliters van het cellenlysaat.
Voor SDS-pagina karakterisering, bevries de gesuspendeerde cellenpellet opnieuw bij min 80 grade
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft de constructie en zuivering van kunstmatige extracellulaire matrix (aECM)-eiwitten die elastine-achtige herhalingen bevatten. Het proces maakt gebruik van recombinante technologieën om op maat gemaakte eiwitten te creëren voor toepassingen in tissue engineering.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Biotechnologie
- Tissue Engineering
- Eiwitengineering
Achtergrond
- Recombinante technologieën maken het ontwerp van nieuwe eiwitten mogelijk.
- Artificiële ECM-eiwitten kunnen natuurlijke extracellulaire matrices nabootsen.
- Elastine-achtige repeats verlenen unieke eigenschappen aan deze eiwitten.
- Toepassingen omvatten tissue engineering en regeneratieve geneeskunde.
Doel van de studie
- Om de stappen bij de constructie van aECM-eiwitten te demonstreren.
- Om het gebruik van elastine-achtige repeats in eiwitontwerp te belichten.
- Om een methode te bieden voor het zuiveren van deze eiwitten voor onderzoek en toepassing.
Gebruikte methoden
- Constructie van recombinante genen die aECM-eiwitten coderen.
- Insertie van recombinante genen in bacteriële gastheren.
- Expressie van recombinante eiwitten in bacteriële culturen.
- Zuivering van eiwitten met behulp van inverse transition cycling (ITC).
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle constructie van aECM-eiwitten met elastine-achtige repeats.
- Effectieve expressie en oogsten van recombinante eiwitten.
- Zuivering bereikt via ITC, waarbij uniek fasegedrag werd aangetoond.
- Potentiële toepassingen in tissue engineering gevalideerd.
Conclusies
- De studie beschrijft een betrouwbare methode voor het produceren van aECM-eiwitten.
- Elastine-achtige herhalingen verbeteren de functionaliteit van kunstmatige eiwitten.
- De bevindingen dragen bij aan vorderingen in weefseltechnologische technologieën.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Artificiële extracellulaire matrix (aECM)-proteïnen met elastine-achtige herhalingen maken de reproduceerbare en schaalbare productie mogelijk van instelbare biomaterialen voor huidweefselengineering. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door gedefinieerde substraten te bieden die de hechting en propagatie van keratinocyten bevorderen, waardoor de biologische variabiliteit in assays in vroege stadia wordt verminderd. De methode verhoogt het predictieve vertrouwen in preklinische modellen door gestandaardiseerde, recombinante proteïnen te leveren met instelbare mechanische en biologische eigenschappen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar integrine-gemedieerde celadhesiemechanismen mogelijk met behulp van gedefinieerde bindingsdomeinen voor fibronectine, laminine-5 en collageen IV.
- Operationele waarde: Levert recombinante eiwitten met een consistente batch-to-batch kwaliteit voor betrouwbare studies naar target engagement.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de bijdragen van de extracellulaire matrix aan de vorming van huidweefsel te isoleren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde substraten voor kwantitatieve beoordeling van keratinocytproliferatie en -adhesie in high-throughput formats.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van inverse transition cycling (ITC) voor schaalbare, tag-vrije zuivering met een opbrengst van 60–120 mg/L aan >90% zuivere aECM-eiwitten.
- Assay-gereedheid: Maakt reproduceerbare coating van kweekoppervlakken mogelijk met instelbare extracellulaire mimetische eigenschappen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van targetvalidatie in de ontdekkingsfase naar preklinische huidmodellen via gedefinieerde, mensrelevante extracellulaire signalen.
- Ziekterelevant systeem: Ondersteunt de evaluatie van wondgenezing en epidermale regeneratie in biotechnologisch vervaardigde huidconstructen.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Vermindert het risico op falen in latere stadia door matrix-afhankelijke cellulaire responsen in een vroeg stadium te valideren.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie door het leveren van instelbare, recombinant geproduceerde extracellulaire matrices.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van interacties tussen de extracellulaire matrix en integrine bij huidpathofysiologie.
- Screening: Levert assay-klare substraten met een gestandaardiseerde presentatie van celadhesieve liganden voor het screenen van verbindingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen mogelijk via SDS-PAGE, Western blot en opbrengstkwantificering om expressie- en purificatiecondities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculair ontwerp met uitkomsten op weefselniveau via keratinocyten-propagatieassays op aECM-gecoate oppervlakken.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een platformtechnologie voor het genereren van aangepaste aECM-proteïnen voor meerdere weefseldoelen via domeinruiling.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in target-validatie door de variabiliteit van de extracellulaire matrix in celgebaseerde assays te verminderen.
- Operationele waarde: Maakt kosteneffectieve grootschalige productie mogelijk via bacteriële expressie en temperatuurafhankelijke zuivering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door mechanistisch inzicht te bieden in matrixafhankelijke weefselvorming.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor huidregeneratie op basis van gedefinieerde extracellulaire activiteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, bacteriële eiwitexpressie en inverse transitiecycli.
- Afhankelijk van toegang tot centrifuges die 40.000 Gs kunnen bereiken en temperatuurgecontroleerde schudincubatoren.
- Vereist standaardisatie van lysis-, zuiverings- en dialyseprotocollen over productiebatches heen.
- Aanpassing aan andere weefseltypen kan domeinuitwisseling vereisen, waarbij de functionaliteit van de elastine-achtige herhalingen behouden blijft.
- De zuiveringsefficiëntie is afhankelijk van nauwkeurige temperatuurcycli tussen 4°C en 37°C om gebruik te maken van elastine-fasetransities.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Cloning of Recombinant Plasmids Encoding for aECM Proteins
3:59
Bacterial Expression of aECM Proteins
5:35
Lysis of Bacterial Cultures
7:04
Purification of aECM Proteins Using Inverse Transition Cycling
8:42
Results: Analysis of aECM Proteins
10:05
Conclusion
