Name: Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Leer intramusculaire injecties langs motorische eindplaten voor retrograde tracertransport naar ruggenmergmotorneuronen. Deze methode optimaliseert visualisatie en ondersteunt onderzoek naar neuromusculaire aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Health &amp; Medisch Centrum voor Onderzoek (NHMRC) project subsidie ​​aan RM

Alle hier beschreven experimentele procedures voldaan aan de Animal Care en de ethische commissie van UNSW Australië en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Health en Medical Research Council van Australië regels voor dierproeven. Alle procedures in dit protocol dienen te worden uitgevoerd in overeenstemming met de eis van de relevante Animal Care en de ethische commissie. 1. Acetylcholinesterase Histochemische kleuring <ol><li> Bereid de Acetylcholinesterase reactiemengsel <ol><li> Voeg 290 mg Acetylthiocholine jodide tot 200 ml 0,1 M fosfaatbuffer (PB). Meng met een magnetische roerder bij 900 rpm. </li><li> Voeg 600 mg glycine onder voortdurend roeren. </li><li> Voeg langzaam 420 mg kopersulfaat aan het reactiemengsel onder voortdurend roeren totdat het product volledig is opgelost. </li></ol></li><li> Verwijder de huid van het dier karkas (verkregen door het delen weefsel) door insnijdingenin de huid van een geperfuseerde rat of muis, grijpen de huid van de nek en voorbij de voeten trekken. Controleer of de fascia die elke spier ofwel verwijderd of aanzienlijk geperforeerd om voldoende blootstelling van de spiervezels aan de reactieoplossing waarborgen. </li><li> Dompel het lichaam of ledematen plaats in het reactiemengsel en incubeer O / N bij 4 ° C. </li><li> Was het karkas gedurende 2 min in gedestilleerd water. Opmerking: In dit stadium, de spieren vertonen een blauwkleuring en de motor eindplaten (EP) kan worden gezien als witte stippen. </li><li> Expose het karkas van een 10% ammonium sulfide oplossing voor 3-5 sec. Opmerking: de spiervezels zal snel bruin en de leden zullen waarneembare zo zwart gespikkelde stippen zijn. Wanneer de reactie te snel, en de spiervezels te donker onderscheid tussen de leden en de spiervezels gekleurd proberen met behulp lagere concentraties ammonium- sulfide-oplossing (bijvoorbeeld 5%). De reactietijd van het krijgenoptimaal contrast tussen de leden en de spiervezels verschilt van monster naar de andere. Daarom is het moeilijk de exacte belichtingstijd aan het reagens te bepalen. De reactie moet nauwlettend worden gevolgd en gestopt wanneer het contrast voldoende wordt geacht. </li><li> Was het karkas twee keer, met agitatie in gedestilleerd water en dep het karkas droog. </li><li> Foto zowel de laterale als mediale aspecten van het ledemaat, zodat de EP van alle spieren van belang worden opgevangen. </li></ol> 2. intramusculaire injecties bij de Motor End Plates <ol><li> Trek glas micropipetten met een micropipet trekker (het gebruik van gesorteerde micropipetten met zuigers wordt aanbevolen). Met behulp van een stereomicroscoop, breken de uiteinden van de micropipetten met een pincet zodat de binnendiameter van het lumen van de micropipet ongeveer 0,5 mm. </li><li> Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten die worden gebruikt vers zijn geautoclaveerd en thin het operatiegebied steriel. </li><li> Vul het micropipetten met fluor-Gold (5% in gedestilleerd water). </li><li> Braken anestheseren in het dier in een inductie kamer met isofluorane (4% in O 2). Controleer voor oprichtreflex en zorgen voor de afwezigheid voordat u deze uit de inductie kamer. Bevestig een neuskegel over de snuit van de rat en lever isofluorane (2% in O 2) voor het onderhoud van anesthesie. Knijp de tenen van het dier en zachtjes aanraken ogen van het dier om ervoor te zorgen dat zowel het pedaal terugtrekking en het hoornvlies reflexen zijn afwezig. Opmerking: Een mengsel van ketamine en xylazil kunnen ook worden gebruikt (80 en 10 mg / kg respectievelijk, intraperitoneaal afgeleverd). Ketamine is een Schedule 8 (&quot;Controlled&quot;) drugs en de nodige protocollen in verband met de aankoop, het gebruik, de opslag en de verwijdering van het geneesmiddel moeten worden nageleefd. </li><li> Breng oogzalf om uitdroging van het oog tijdens de procedure te voorkomen. </li><li> Scheer de targeted ledematen en het gebruik gaas om het geschoren gebied afvegen met drie afwisselende scrubs van chloorhexidine en 70% alcohol. Breng het dier naar het operatiegebied. </li><li> Leg het dier op een schone onderlegger en plaats deze op de juiste wijze om een ​​goede toegang tot de gerichte spier (s) te waarborgen. </li><li> Gebruik een pincet met tooth grepen aan de huid over de geselecteerde spier til van de onderliggende spieren en een insnijding in de huid met chirurgische schaar. Zorg ervoor dat de insnijding groot genoeg om de spier (s) plaats volledig bloot. Zorg ervoor dat er een minimale verstoring van de fascia. </li><li> Gebruik de MEP foto om mentaal omzetting van de locatie en de vorm van de regio MEP op de spier (s). Opmerking: Een fijne vilt marker zou kunnen helpen om de regio MEP van de foto te reproduceren op de spier (s) van belang. </li><li> Voer meerdere injecties over de volle lengte van het gebied MEP (voor Fluor-goud, 3-4 injecties van 1-2 pi elk should voldoende). Veeg de spier (s) om eventuele lekkage te verwijderen. </li><li> Breng de twee uiteinden van de ingesneden huid dicht bij elkaar met stompe tang en sluit de wond met chirurgische clips. Infiltreren 0,1 ml bupivacaïne (0,5% in water) (of andere lokale anesthetica) langs het gehele scala van de wond. </li><li> Zet de verdoving machine uit en bewaken het dier totdat het volledig is hersteld van de anesthesie. </li><li> Wacht 14 dagen tussen toediening van intramusculaire injecties en perfusie van de dieren. </li></ol> 3. infusies <ol><li> Dien een lethale dosis pentobarbiton natriumoplossing (bijv Lethabarb; 150 mg / kg) aan de dieren door intraperitoneale injectie. <ol><li> Nauwlettend toezien op het dier tot een diep niveau van anesthesie is bereikt, zoals bevestigd door de afwezigheid van het pedaal terugtrekking en het hoornvlies reflexen. </li></ol></li><li> Plaats het dier op zijn rug op een dissectie bord geplaatst over een perfusion wastafel. </li><li> Gebruik een pincet met tooth grepen aan de huid die de onderkant van het borstbeen heffen. Maak een kleine incisie in de huid met een paar sterke chirurgische schaar direct onder het borstbeen en gebruik dan de tang om de greep van de zwaardvormig kraakbeen van het borstbeen. Houd de xiphoid kraakbeen, vergroot de insnijding aan beide zijden van de borstholte, van het borstbeen naar de oksels. </li><li> Snijd het membraan naar het hart bloot te leggen. <ol><li> Injecteer 0.ml heparine direct in de apex van het hart om bloedstolling te voorkomen. </li><li> Snijd de apex om het inbrengen van een canule toe in de linker ventrikel, en vervolgens snel klem de canule op zijn plaats met behulp van een hemostaticum. </li><li> Een incisie in het rechter atrium met een paar fijne schaar en onmiddellijk beginnen de peristaltische pomp. Perfuseren met 0,1 M PB totdat de vloeistof die uit het atrium bijna vrij van bloed en de kleur van de lever wordt lichtbruin. Vervolgens perfuseren met een oplostie van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PB) totdat het gehele lichaam van het dier verstart. </li></ol></li></ol> 4. Cervical Spinal Cord Dissection en voorbereiding voor histologie <ol><li> Leg het dier karkas op zijn buik. </li><li> Snijd de huid op middenlijn van het lichaam met een scalpel en reflecteren van de basis van de schedel op het niveau van de iliacale bot. </li><li> Knip en weerspiegelen de paravertebrale spieren aan de dorsale zijde van de wervelkolom bloot. </li><li> Identificeer de benige processus spinosus van Atlas, de tweede cervicale segment (dwz, C2), en verwijder het met een paar van chirurgische rongeurs of tang om de overeenkomstige onderliggende dorsale wortel te vinden. <ol><li> Identificeer de juiste C2 wortel door te kleuren met een permanente markeerstift. </li><li> Verwijder de volgende ruggenwervels een voor een en markeer de juiste dorsale wortels met wisselende kleuren (bijvoorbeeld, C2, C4, C6, C8 en te kleuren groen en C3, C5, C7, T1 kan worden colORed in het blauw). </li></ol></li><li> Gebruik een chirurgische naald (bijvoorbeeld 30 G gauge naald) om voorzichtig doorboren de dura die het ondereinde van de ruggenmerg. Met de schuine kant van de naald omhoog, til de dura weg van het snoer, terwijl het verplaatsen van de naald rostraal een langssleuf maken. <ol><li> Weerspiegelen de dura. </li></ol></li><li> Snijd het ruggenmerg transversaal in één- of twee-segment blokken met een nieuw scalpel. <ol><li> Laat het ruggemerg segmenten in situ en voor elk blok, voorzichtig een kleine referentiemarkering aan de linkerkant van elk blok met de scalpel halverwege tussen twee aangrenzende wortels. Zorg ervoor dat de referentiemarkering diep genoeg door het weefsel zichtbaar vanuit het ventrale aspect van de blokken. Maak de referentiemarkering een hoek van ongeveer 45 °, wijzend ofwel anterieur of posterieur ten opzichte Anatomie, om te helpen bij de oriëntatie van het weefselsegment volgende dissectie. </li></ol></li><li> Verzamel de individuele blokken op kleine, duidelijk gemarkeerd flessen met een oplossing van paraformaldehyde (4% in 0,1 M PB) en verlaat bij KT O / N. </li><li> Breng de blokken op schone, duidelijk gemarkeerd flessen met een oplossing van sucrose (30% in 0,1 M PB) en bewaar bij 4 ° C gedurende ten minste twee dagen. </li><li> Plaats de segmenten in cryo-mallen en bedekt ze met het weefsel bevriezen medium. Voor longitudinale histologische preparaat, oriënteren de blokken met de dorsale zijde naar boven en met de referentiemarkering op het blok in de cryo-matrijzen oriënteren. </li><li> Bevries de cryo-schimmels bij -20 ° C en gesneden met een cryostaat in 50 urn dikke secties. Opmerking: De secties kunnen direct worden aangebracht op adhesie objectglaasjes en laat drogen O / N. Alternatief kunnen de delen drijven in 48-well platen gevuld met 0,1 M PB en vervolgens gemonteerd met de referentiemarkering op de weefselcoupes op de glijbaan oriënteren. </li></ol> 5. lumbale spinale Cord Dissection en voorbereiding voor histologie <ol><li> Leg het dier karkas op zijn rug. </li><li> Voer een middellijn incisie langs de buik van het dier en verwijder de ingewanden. Ontleden de spieren van de buikwand naar het ventrale aspect van de wervelkolom bloot. </li><li> Zoek de korte staart meest rib en de aangrenzende T13 wervel waar de T13 ventrale wortel verlaat het bot. <ol><li> Achtereenvolgens verwijder één voor één de twee of drie wervels rostraal T13 (dwz, T12, T11 en, indien nodig, T10) met fijne chirurgische rongeurs aan de T13 ventrale wortel volgen totdat de punt van binnenkomst in het ventrale aspect van de ventrale snoer en markeren met een permanente markeerstift. </li><li> Vanaf dit punt, herhaal dezelfde procedure om de locatie van de ventrale wortel toegangspunten voor L1, L2, L3, L4, L5, L6 en S1 identificeren, kleuren ze met wisselende kleuren. </li></ol></li><li> Volg dezelfde procedure zoals beschreven in hoofdstuk 4,5-4,10 voor lumbar ruggenmerg dissectie. </li></ol>

<ol><li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li>
<li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li>
<li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li>
<li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li>
<li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li>
<li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11(2011).</li>
<li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li>
<li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1%2F2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li>
<li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li>
<li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li>
<li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li>
<li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li>
<li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li>
<li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li>
<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Alternative+energy+for+neuronal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li>
<li>Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li>
<li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb%3A+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li>
<li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58(2013).</li>
<li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons%3A+an+approach+to+maximize+retrograde+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li>
<li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li>
<li>Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755(2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Intramusculaire targeting en daaropvolgende retrograde overbrengen van therapeutische transgenen in het overeenkomstige α motoneuronen voor de experimentele behandeling van neuromusculaire aandoening geen nieuwe strategie. Zo heeft deze levering methode gebruikt om neuromusculaire degeneratie vertraging in verschillende stadia van de progressie van ALS SOD1 muizen en ratten 1,9-12 en in muizen met SMA 13. Ofschoon veelbelovend, is de effectiviteit van deze gentherapie scenario beperkt. In dit verba...

Het verlies van de controle van vrijwillige bewegingen als gevolg van neurologische aandoeningen zoals motorneuron ziekte en spinal- en Duchenne musculaire atrofie is een invaliderende aandoening die hoge en langdurige gevolgen voor het dagelijks leven van aangetaste individuen heeft. In de afgelopen tien jaar heeft onderzoek gericht om te stoppen of op zijn minst vertraging van de schadelijke effecten van deze neuromusculaire ziekten een prioriteit voor veel artsen en wetenschappers over de hele wereld. In dit verband heeft de recente generatie diermodellen deze neuromusculaire aandoeningen nabootsen die nodig was om fundamenteel inzicht in de fysiologische mechanismen verantwoordelijk voor de ontwikkeling en progressie van deze voorwaarden zijn 1-13. Behandeling van deze neuromusculaire aandoening heeft directe toegang tot het ruggenmerg en kan door ruggenmerg injecties 14,15. Recente ontwikkelingen in gentherapie zijn ook gericht op de dwarsgestreepte spieren van de bovenste enonderste ledematen shuttle therapeutische genen tot de overeenkomstige α motorische neuronen die zich in de ventrale hoorn van het ruggenmerg 1,9-13. Echter, deze keer veelbelovende strategie niet aan de uitkomst van deze neurologische aandoeningen te verbeteren. Hoewel het worden besloten dat deze slechte resultaten kan zijn, althans gedeeltelijk, te wijten aan de lage doeltreffendheid van deze beschermende genen, kan men de lage werkzaamheid van deze genafgifte te passen niet uit. End motor platen (EP) zijn gespecialiseerde gebieden van het skelet myofibrillen die worden ingesprongen door de axon terminals van grote perifere motorische vezels afkomstig uit α ​​motorische neuronen. Samen vormen de perifere zenuw vezel uiteinden en EP vormen de neuromusculaire junctie, dat wil zeggen de plaats waar synaptische impulsen worden veroorzaakt door de anterograde afgifte van de neurotransmitter, acetylcholine. Belangrijk is dat de relatie tussen perifere zenuwvezels en de leden van het EP is bi-direcnele, hoewel de verschillende motoren zijn verantwoordelijk voor het transport van moleculen en organellen richting en weg van het neuron somata 16-18. In het licht van deze anatomische overwegingen, Europarlementsleden lijken om de doelstellingen van de keuze voor de levering en daaropvolgende retrograde transport van genetisch materiaal naar de overeenkomstige motorische neuronen. In dit verband is het niet verrassend dat het succes van motor neuron transductie sterk afhankelijk van de afstand tussen de intramusculaire injectie van virale vectoren en spier EP 19-20. Verrassenderwijs echter, de exacte locatie van het MEP zones op de myofibrillen van het laboratorium rat en muis, de twee species gekozen model neuromusculaire ziekten beschikbaar waren tot voor kort. We hebben uitgebreide kaart van de omgeving MEP enkele voorpoot spieren in de rat en de muis 21-22 geproduceerd. Recenter hebben we aangetoond details van de organisatie van het MEP rEgion voor meerdere spieren van de muis achterbeen 23 en we zijn momenteel het analyseren van de kenmerken van de leden van het EP op het achterbeen rat. In onze handen, intramusculaire injecties van retrograde tracers gericht op het gehele MEP zones in deze spieren leidde tot meer gelabelde motorneuronen die van meer ruggenmergsegmenten dan eerder gerapporteerd. Hier presenteren we het protocol dat is ontwikkeld in de afgelopen jaren om de locatie van de EP op het buitenoppervlak en over de hoogte van het achterbeen onthullen en voorpoot spieren in zowel de muis en de rat.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>Verdund tot 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Micropipetten 1-10 &micro;l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>begeleid met plunjer</td></tr><tr><td>Acetylthiocholine Jodide</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Koper(II) Sulfaat Watervrij</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextraan, Tetramethylrhodamine en biotin</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Verdund in gedistilleerd water</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isofluraan inhalatie damp</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wond Clips</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Euthanasie Injectie</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td>LETHA450</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Oplossing</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus glazen platen</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Sulfide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Verdund tot 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Verdund tot 0.25%</td></tr></tbody></table>

intramusculaire injecties langs de motor end plates: een minimaal invasieve benadering van shuttle tracers rechtstreeks in motor neuronen

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Ziekten van de integriteit van het ruggenmerg motorneuronen behoren tot de meest slopende neurologische aandoeningen. In de afgelopen decennia is de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van deze neuromusculaire stoornissen gegeven wetenschappers met verschillende therapeutische&#39;s ter vertragen of omkeren van de progressie van deze aandoeningen. Door gebruik te maken van de retrograde machinerie van neuronen, één van deze benaderingen is om skeletspieren om shuttle therapeutische genen te richten op overeenkomstige ruggenmerg motorneuronen. Maar zodra veelbelovend is het succes van dergelijke gentherapie benadering belemmerd door het sub-optimale aantal getransduceerde motorneuronen zij tot dusver getoond verkregen. Motorzijde platen (EP) zijn zeer gespecialiseerde gebieden op de skeletmusculatuur die in direct contact synaptische het ruggenmerg α motorische neuronen. In dit verband is het belangrijk op te merken dat, tot nu toe, de inspanningen om retrogradelyoverdracht van genen in motorische neuronen plaats tegen de locatie van het gebied MEP in de beoogde spieren. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol 1) om de exacte locatie van de EP-leden op het oppervlak van de skeletspieren te onthullen en 2) om deze informatie gebruiken om te begeleiden de intramusculaire levering en daaropvolgende optimale retrograde transport van retrograde tracers in motorische neuronen. We hopen de resultaten van deze tracing experimenten in verdere studies te gebruiken in het onderzoek naar retrograde transport van therapeutische genen aan het ruggenmerg motorische neuronen door de doelgerichtheid van Europarlementsleden.

Acetylcholinesterase histochemische kleuring onthult de locatie van de motor eindplaten over de breedte van de spieren. Figuur 1 illustreert de resultaten van dergelijke kleuring uitgevoerd op gehele rat voorpoot. Voorgesteld wordt om de concentratie van de ammonium sulfide oplossing optimaliseren (bijv., 5-7% in plaats van 10%) en de tijd het monster ondergedompeld in de oplossing, indien de niet-specifieke achtergrondkleuring op de spiervezels te overmatig. Figuur 2 illustree...

De werkzaamheid van intramusculaire opname en retrograad transport van moleculen naar corresponderende motorische neuronen hangt af van de locatie van de injectieplaatsen ten opzichte van de motorische eindplaten (MEP's). Hier beschrijven we hoe je MEP's op skeletspieren kunt lokaliseren om het retrograad transport van tracers naar motorische neuronen te optimaliseren.

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de efficiëntie van het retrograde transport van neuroanatomische tracers naar motorneuronen in het ruggenmerg te verhogen na intramusculaire injectie. Dit wordt bereikt door een histochemische acetylcholinesterase-reactie te initiëren in een nagebootst weefsel van belang om de locatie van de motorische eindplaten in de musculatuur van het dier te identificeren. In de tweede stap worden intramusculaire injecties van de retrograde tracer uitgevoerd over de gehele breedte van het gebied van de motorische eindplaat.De dieren worden vervolgens gedurende 14 dagen gehouden om het transport van de tracer naar het ruggenmerg mogelijk te maken in de betreffende spieren. Motorneuronen die uiteindelijk de volledige lengte van de motorische eindplaatregio targeten, leveren meer gelabelde motorneuronen op die zich over meerdere segmenten van het ruggenmerg van het knaagdier uitstrekken wanneer deze met fluorescentiemicroscopie worden gevisualiseerd. De implicaties van deze studie reiken tot de ontwikkeling van therapieën voor neuromusculaire disfunctie, waaronder ruggenmergletsel en amyotrofische laterale sclerose.Aangezien dit een minimaal inv

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel tonen we een methode om glazen capillaire naalden te maken met een 50-um lumen. Deze techniek vermindert de schade aan de hersenen, minimaliseert passieve diffusie van geneesmiddelen en maakt een nauwkeurige targeting naar de knaagdieren hersenen.

Targeting van Deep Brain Structuren met micro-injecties voor de levering van drugs, virale vectoren, of Cell Transplantaties

Neurale voorloper transplantatie is een veelbelovende strategie voor de bescherming en / of vervangen van verloren / disfunctionele cervicale diafragma motorische neuronen in het ruggenmerg letsel (SCI) en de motor neuron ziekte, amyotrofe laterale sclerose (ALS). Wij bieden een protocol voor de cel levering aan cervicale ruggenmerg ventrale hoorn in knaagdiermodellen van ALS en SCI.

Intraspinale Cel Transplantatie voor Targeting Cervicale ventrale hoorn van Amyotrofische Lateraal Sclerose en traumatisch ruggenmergletsel

Wij bieden een praktische gids voor het leveren van...

Revealing Neurale Circuit Topografie in Multi-Color

Source: Mohan, R., et al. Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the targeted delivery of a fluorescent neuronal tracer into motor neurons via intramuscular injection at the motor end plates (MEPs). It outlines the steps involved in preparing the rat, injecting the tracer, and assessing labeled motor neurons for neurotherapeutic potential.

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates to Shuttle Tracers Directly into Rat Motor Neurons

Transsynaptisch traceren is een krachtig hulpmiddel geworden voor het analyseren van centrale efferente regulatie van perifere doelwitten via multi-synaptische circuits. Hier presenteren we een protocol dat gebruik maakt van het transsynaptische pseudorabiësvirus om een functionele hersencircuit te identificeren en lokaliseren, gevolgd door klassieke tract tracing-technieken om specifieke verbindingen in het circuit tussen geïdentificeerde groepen neuronen te valideren.

Transsynaptische Tracing van Perifere Targets met pseudorabiësvirus Gevolgd door Cholera toxine en Gebiotinyleerde Dextran Amines Double Labeling

Dit rapport beschrijft een eenvoudige en snelle techniek van intrathecale naaldpunctuur voor een gelokaliseerde transfectie van siRNA in de lumbale ruggenmerg muis onder kortdurende lichte verdoving.

In Vivo SiRNA Transfection en Gene Neerhalen in Spinal Cord via Rapid invasieve lumbale Intrathecale injecties in Muizen

Om hersenreorganisatie onder pathologische omstandigheden te bestuderen, gebruikten we miniosmotische pompen voor directe eiwitbezorging in de hersenen, waarbij we de bloed-hersenbarrière omzeilden. Trajecttracers worden vervolgens geïnjecteerd om veranderingen in hersenconnectiviteit onder invloed van het eiwit te bestuderen.

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.

Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Dit artikel beschrijft intrathecale toedieningsmethoden voor op het CNS gerichte therapieën bij volwassen muizen, met de nadruk op protocolprecisie en het mogelijk maken van herhaalde injectie. Het bevat bevindingen uit een validatiestudie waarbij antisense-oligonucleotiden de expressie van mutant SOD1 verminderden in SOD1-ALS-modelmuizen, wat het nut van deze aanpak ondersteunt in preklinisch onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Lumbale intrathecale injectie van SOD1-ASO's voor precieze CNS-targeting en voorspellende effectiviteit bij menselijke SOD1-G93A ALS-muizen

Leer intramusculaire injecties langs motorische eindplaten voor retrograde tracertransport naar ruggenmergmotorneuronen. Deze methode optimaliseert visualisatie en ondersteunt onderzoek naar neuromusculaire aandoeningen.

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen (Video) | JoVE Journal

Intramusculaire injecties Langs de Motor End Plates: een minimaal invasieve benadering van Shuttle Tracers Rechtstreeks in Motor Neuronen

Meer video's verkennen