Name: Silencing van BRCA2 Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer hoe je BRCA2-expressie silenced in gekweekte menselijke cellen met siRNA-transfectie en Western blotting. Deze methode maakt efficiënte gen-silencing en detectie van hoogmoleculaire eiwitten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door FIRB-Merit-subsidies RBNE08YFN3_005 en RBNE08HWLZ_012, en het Italiaanse Ministerie van Economie en Financiën aan de CNR voor het project “FaReBio di Qualità”.

1. Bereid siRNA oplossingen <ol><li> Resuspendeer 5 nmol van roerei (Ctrl) en 5 nmol van BRCA2 siRNA gedroogde pellets in 100 ul RNase-free water (uiteindelijke siRNA concentratie: 50 pm). Dit is de siRNA voorraad en moet bij -20 ° C in 10 gl aliquots worden opgeslagen. </li><li> Neem een ​​monster van 10 ul van de siRNA voorraad en voeg 40 ul van RNase-vrij water aan de 10 uM siRNA werkende oplossing te verkrijgen. Deze verdunning moet worden bewaard bij -20 ° C tot gebruik. LET OP: Het siRNA werkende oplossing mag niet bevriezen ondergaan / ontdooien van meer dan 3 keer. </li></ol> 2. Seeding van menselijke epitheelcellen Lines <ol><li> Verwijder het groeimedium van menselijke epitheliale cellijnen groeien als monolagen cellen in weefselkweekplaten in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Was de cellen in de plaat eenmaal met RT PBS (10 ml PBS gedurende een 100 mm plaat). </li><li> Om de cellen los van de plaat,Voeg 2 ml van 0,25% trypsine / 0,53 mM EDTA-oplossing en incubeer 3-5 min afhankelijk van het celtype. </li><li> Voor het verzamelen van de losgemaakte cellen, trypsine te neutraliseren door het toevoegen van 2 ml compleet kweekmedium dat 10% foetaal runderserum. </li><li> Overdracht van de cellen om een ​​15 ml buis. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 320-330 g gedurende 3 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor. </li><li> Resuspendeer de celpellets in 5 ml antibiotica-vrij medium. </li><li> Tel de cellen onder de microscoop in een Burker kamer of met een geautomatiseerd telsysteem volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Zaad de cellen in 6-well platen tot ongeveer 80% confluent na 24 uren (0,5-1 x10 6 cellen in 2 ml medium per putje). Optimaal aantal cellen te geënt kan variëren naargelang de specifieke cellijnen en de groeisnelheid. OPMERKING: Niet antibiotica toe te voegen in het medium op dit punt, omdat antibiotica negatief zal interfereren met de efficiëntie van ovectie. Het is belangrijk dat de cellen bij lage cultuur passages (&lt;10) met hoge efficiëntie van BRCA2 siRNA transfectie bewerkstelligen. </li></ol> 3. Transfecteren cellen met siRNA <ol><li> Vierentwintig uur na het uitplaten van de cellen, tot de eerste ronde van transfectie. <ol><li> Verdun 6 pl lipide gebaseerde 10 specifieke siRNA transfectie reagens in 130 ul gereduceerd serum medium. </li><li> Verdun 3 ul 10 uM siRNA (30 pmol) in 130 pl verminderde serum medium. </li><li> Combineer de verdunde siRNA met verdunde transfectie reagens en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens de incubatie, verwijder het medium uit de cellen en voeg 2 ml vers medium voorverwarmd bij 37 ° C (zonder antibiotica). </li><li> Voeg 250 ul van de siRNA-transfectie reagens complexen aan de cellen (dit bedrag voor een enkel putje van een 6-wells plaat). </li><li> Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator bij 3776, C met 5% CO 2. </li></ol></li><li> Na 24 uur werd verder met de tweede ronde van transfectie door stap 3.1.1-3.1.5 de volgende modificatie voor stap 3.1.2: verdun 5 ul 10 uM siRNA (50 pmol) in 130 pl verminderde serum medium. <ol><li> Incubeer de cellen gedurende 1-2 dagen bij 37 ° C voorafgaand aan de analyse. OPMERKING: Twee ronden van transfecties en het gebruik van een hoge siRNA / transfectiereagens verhouding in de tweede ronde zijn essentieel om een hoge efficiëntie van BRCA2 silencing krijgen. </li></ol></li></ol> 4. Lyse cellen voor immunoblotting analyse <ol><li> Bereid verse lysisbuffer met PBS (pH 7,4) die 1% van de niet-ionogene, niet-denaturerende detergens octylfenoxypolyethoxyethanol, 5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM natriumorthovanadaat, 10 mM natriumfluoride, 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug / ml leupeptine, 10 gg / ml aprotinine. Houd het op het ijs. </li><li> Verwijder het medium uit de cellen en was ze eenmaal met koud PBS (2 ml / putje) in de plaat. Om PBS overdracht te voorkomen, volledig te verwijderen van de plaat. </li><li> Voeg 200 ul lysisbuffer aan elke well. Opmerking: Als de cellen ook worden gebruikt voor andere testen, trypsinize de cellen zoals beschreven in stap 2,1-2,6 en resuspendeer de cellen in geschikte buffer / medium afhankelijk van de toepassing te gebruiken. </li><li> Voorzichtig zwenken de plaat uniform te verdelen de lysis buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C op een rotator. </li><li> Verzamel het cellysaat in een microcentrifuge buis op ijs met behulp van een celschraper. </li><li> Centrifugeer bij 17.900 xg gedurende 25 min bij 4 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof in een nieuwe buis. </li><li> Meet de eiwitconcentratie gebruikmaking van een commercieel verkrijgbaar eiwit assay volgens de aanwijzingen van de fabrikant. </li></ol> 5. BRCA2 immunoblotting analyse <ol><li> Bereid de lopende buffer door verdunning van 50 ml van 20x Tris-acetaat SDS lopende bUffer (50 mM Tricine, 50 mM Tris Base, 0,1% SDS, pH 8,24) met 950 ml gedestilleerd water. </li><li> Bereid de sample als volgt: voeg 15 ug totaal cellysaat, 5 ul van 4x monsterbuffer bevattende lithium dodecyl sulfaat bij pH 8,4, 2 ui 10X monster reductiemiddel (0,5 M DTT) en lysis buffer tot een eindvolume van 20 ul. NB: Dit protocol maakt de ontdekking van BRCA2 in normale cellijnen ook bij gebruik van een lager bedrag van de totale eiwitten (tot 5 ug). </li><li> Denatureren monsters bij 55 ° C gedurende 10 min. LET OP: Het is cruciaal om 55 ° C te gebruiken. Aangezien BRCA2 proteïne warmtegevoelig 11, hogere denaturering temperaturen leiden consequent verlies van intacte full-length (390 kDa) BRCA2-eiwit. </li><li> Stel de elektroforetische kamer volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Plaats de monsters en 10 ul hoogmoleculair vooraf gekleurde eiwitstandaard een precasted gel (Tris-acetaat 3-8%) en uitgevoerd bij 120 V gedurende about 2 uur 12. Stop de elektroforetische run voor de 55 kDa blauwe markering laat de precasted gel. </li><li> Bereid de overdracht buffer met 50 ml van 20x overdrachtsbuffer, 100 ml 100% methanol en 850 ml water. </li><li> Activeren PVDF-membraan (poriegrootte 0,45 um) door het weken in 100% methanol gedurende 5 minuten, spoelen met gedistilleerd water en equilibreren overdrachtbuffer tenminste voor 5 min. Week de sponzen van de overdrachtsinrichting in transfer buffer bij 4 ° C tot gebruik. </li><li> Wanneer de elektroforetische run voorbij is, monteer de sandwich bij de overdracht stack in de volgende volgorde (bottom-up): drie sponsen verzadigd in de overdracht buffer, een 3MM grade papier vel verzadigd in de overdracht buffer, de gel, geactiveerde PVDF membraan, een 3MM grade papier vel verzadigd in de overdracht buffer, drie sponzen verzadigd in de overdracht buffer 13,14. Plaats de stapel in de inrichting en transporterende eiwitten bij 350 mA gedurende 4 uur bij 4 ° C of bij 180 mA gedurende de nacht bij 4 ° C. OPMERKING: Being BRCA2 een groot eiwit, is het cruciaal om de overgang te verlengen van 1 uur (zoals voorgesteld door de fabrikant en meest transferprotocollen) tot 4 uur of gedurende de nacht volledige overdracht van hoogmoleculair eiwitten garanderen. Bovendien, vanwege de lange overdrachtstijd, is het essentieel om de blotting uitgevoerd in een koude kamer bij 4 ° C om oververhitting te minimaliseren en sandwich demonteren te vergemakkelijken. Semi-droge overdracht systemen zijn niet goed voor het overbrengen van grote eiwitten. </li><li> Na overdracht, was de membraan met TBS, blokkeren gedurende 1 uur bij KT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T) met 5% magere melkpoeder en probe overnacht bij 4 ° C met 30 ul anti-BRCA2 konijnen polyklonaal antilichaam ( 200 gg / ml), verdund in 9 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder [1: 300 (v / v) verdunning]. </li><li> Was het membraan driemaal (10 minuten elk) met TBS-T, dan incubeer het filter 1 uur met 1 pl mierikswortel peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam verdund in 10 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder. Daarna was het membraan driemaal (10 minuten elk) met TBS-T. </li><li> Voer immunodetectie door ECL te BRCA2 eiwitten openbaren met verbeterde chemiluminescentie (ECL) Western Blotting Detection Reagent, volgens de instructies van de fabrikant. Visualiseer immunochemiluminescent bands op hoge resolutie ECL films. </li><li> Voer immunodetectie met een antilichaam voor een huishoud-gen, zoals β-tubuline (55 kDa), op hetzelfde filter als ladingscontrole met een monoklonaal antilichaam tegen β-tubuline verdund 1: 1000 (10 pl anti-tubuline antilichaam in 10 ml TBS-T + 5% magere melkpoeder) gedurende 1 uur bij KT. Was en incubeer secundair antilichaam zoals beschreven voor BRCA2 (5,10-5,11), behalve het gebruik van mierikswortel peroxidase-geconjugeerd anti-muizen in plaats van anti-konijn secundair antilichaam. </li><li> Verwerven van een digitaal beeld van de films onder de indruk van immunochemiluminescent bands en de band intensiteit door toegewijde beeldanalyse software analyseren (bv., ImageJ). </li></ol>

<ol><li>Thorslund, T., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2%3A+a+universal+recombinase+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA2: a universal recombinase regulator.</a> Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).</li>
<li>Yoshida, K., Miki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+BRCA1+and+BRCA2+as+regulators+of+DNA+repair%2C+transcription%2C+and+cell+cycle+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage.</a> Cancer Sci. 95, 866-871 (2004).</li>
<li>Martin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2+in+breast-ovarian+families+from+a+breast+cancer+risk+evaluation+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Germline mutations in BRCA1 and BRCA2 in breast-ovarian families from a breast cancer risk evaluation clinic.</a> J Clin Oncol. 19, 2247-2253 (2001).</li>
<li>Castro, E., Eeles, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+BRCA1+and+BRCA2+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">The role of BRCA1 and BRCA2 in prostate cancer.</a> Asian J Androl. 14, 409-414 (2012).</li>
<li>Vencken, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+and+outcome+of+BRCA1-+and+BRCA2-associated+ovarian+cancer+patients+after+first-line+chemotherapy+compared+with+sporadic+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity and outcome of BRCA1- and BRCA2-associated ovarian cancer patients after first-line chemotherapy compared with sporadic ovarian cancer patients.</a> Ann Oncol. 22, 1346-1352 (2011).</li>
<li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434, 917-921 (2005).</li>
<li>Arbini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+depletion+sensitizes+cancer+cells+to+PARP+inhibitors+by+translational+and+post-translational+repression+of+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA depletion sensitizes cancer cells to PARP inhibitors by translational and post-translational repression of BRCA2.</a> Oncogenesis. 2, e82(2013).</li>
<li>Yang, F., Guo, X., Yang, G., Rosen, D. G., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AURKA+and+BRCA2+expression+highly+correlate+with+prognosis+of+endometrioid+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">AURKA and BRCA2 expression highly correlate with prognosis of endometrioid ovarian carcinoma.</a> Mod Pathol. 24, 836-845 (2011).</li>
<li>Guaragnella, N., Marra, E., Galli, A., Moro, L., Giannattasio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+BRCA2+decreases+anoikis+and+its+heterologous+expression+sensitizes+yeast+cells+to+acetic+acid-induced+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Silencing of BRCA2 decreases anoikis and its heterologous expression sensitizes yeast cells to acetic acid-induced programmed cell death.</a> Apoptosis. 19, 1330-1341 (2014).</li>
<li>Mahato, R. I., Rolland, A., Tomlinson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-based+gene+delivery+systems%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-based gene delivery systems: pharmaceutical perspectives.</a> Pharm Res. 14, 853-859 (1997).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA2%3A+temperature+sensitivity+of+detection+and+cell-cycle+regulated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA2: temperature sensitivity of detection and cell-cycle regulated expression.</a> Oncogene. 17, 2377-2381 (1998).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. ' <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Western+blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Hunter, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+hypoxia+and+homologous+recombination+repair+dysfunction+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of hypoxia and homologous recombination repair dysfunction in triple-negative breast cancer.</a> Mol Cancer Ther. , (2014).</li>
<li>Drew, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+AG014699+in+human+cancers+with+mutated+or+methylated+BRCA1+or+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor AG014699 in human cancers with mutated or methylated BRCA1 or BRCA2.</a> J Natl Cancer Inst. 103, 334-346 (2011).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28ADP-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434, 913-917 (2005).</li>
<li>Ihnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+the+poly%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+rucaparib+for+the+treatment+of+sporadic+human+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of the poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor rucaparib for the treatment of sporadic human ovarian cancer.</a> Mol Cancer Ther. 12, 1002-1015 (2013).</li>
<li>Jeong, J. H., Jo, A., Park, P., Lee, H., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca2+Deficiency+Leads+to+T+Cell+Loss+and+Immune+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Brca2 Deficiency Leads to T Cell Loss and Immune Dysfunction.</a> Mol Cells. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Door kiemlijn mutaties van het BRCA2-gen leiden tot een verhoogd risico van verschillende soorten kanker, zoals vrouwelijke en mannelijke borstkanker, eierstokkanker, prostaatkanker, pancreaskanker, melanoom en 3,4, een aantal studies ondernomen om de biologische functie begrijpen van het BRCA2-eiwit. De meeste van deze onderzoeken zijn genetisch bepaalde vooral door technische problemen bij het analyseren van een grote eiwitachtige BRCA2. De hier beschreven methode voor geluiddemping en analyseren B...

De BRCA2 (borstkanker vatbaarheid gen-2) gen codeert voor een tumor suppressor eiwit dat een cruciale rol bij het ​​herstel van DNA dubbelstrengige breuken door het reguleren van de functie van het recombinase enzym Rad51 1 speelt. BRCA2 is ook betrokken bij de modulatie van transcriptie en celcycluscontrole 2. Kiemlijn mutaties in het BRCA2-gen induceren een autosomaal dominant vatbaarheid voor borst- en eierstokkanker bij vrouwen en prostaatkanker bij mannen, en aanleg voor andere kankersoorten 3,4. Ondanks het verhoogde risico van kanker, BRCA2 mutaties die tegengaan of verminderen BRCA2 functie kankercellen gevoeliger voor chemotherapeutische middelen die DNA-beschadiging veroorzaken 5-7 maken. Sporadische kankers vertonen een lage BRCA2 mutaties (&lt;3%) terwijl een lager niveau van BRCA2-eiwit werden bij sommige types kanker gedetecteerd, wat suggereert dat BRCA2-eiwitkan tijdens het ontstaan ​​van tumoren worden verloren in sporadische kankers via niet-mutatie-afhankelijke mechanismen 7,8. Het is dus belangrijk om BRCA2 functies begrijpen in de context van kankerbiologie en in andere biologische instellingen. Een krachtig hulpmiddel gebruikt om nieuwe functies van een gen in zoogdiercellen te identificeren om de expressie te onderdrukken. Als voorbeeld is silencing BRCA2-expressie in verschillende normale epitheelcellen recentelijk geleid tot de identificatie van een nieuwe functie van BRCA2 als regulator van anoikis weerstand, een belangrijke stap in het verkrijgen van kankercel invasieve en metastatische vermogen 9. Gene silencing kan worden bereikt door in de cellen of kleine interfererende (si) RNA of short hairpin (sh) RNA-moleculen gericht op de specifiek gen. De hoge potentie van siRNA en het gebruiksgemak maken het de preferentiële tool voor zwijgen experimenten gericht op het verwerven van nieuwe inzichten in biologische processen kritische eennd om nieuwe therapeutische targets te identificeren. Evenwel efficiënte knockdown van genexpressie niet gemakkelijk bereikbaar voor alle genen en kunnen zeer variabel zijn, afhankelijk van het celtype. Aangezien een afname in de intracellulaire eiwitgehalten het meest relevant fenotype onderzocht, is het cruciaal om gen-silencing kwantificeren immunoblotting analyse van het genproduct. Hiermee verband het BRCA2-eiwit vormt een extra uitdaging: wordt een groot eiwit (ongeveer 390 kDa), geen technische moeilijkheden aanwezig voor conventionele biochemische analyse, inclusief immunoblotting. Wij rapporteren hier een protocol geoptimaliseerd voor efficiënte silencing van BRCA2 in menselijke epitheliale cellijnen en voor een snelle en succesvolle opsporing van BRCA2-eiwit knockdown door immunoblotting analyse.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp;D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagent&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium voor transfectieprocedure</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel voor eiwitelektroforese</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample buffer&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagens voor eiwitelektroforese</td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing agent (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagens voor eiwitelektroforese</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagens voor eiwitelektroforese</td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Voorgekleurde marker voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Apparatuur voor eiwitelektroforese/overdracht</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagens voor Western blotting</td></tr><tr><td>PVDF membraan</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagens voor Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagens voor Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 konijn polyklonaal antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 verdunning</td></tr><tr><td>Beta-tubulin monoklonaal antilichaam</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Skimmolkpoeder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagens voor Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagens voor Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemiluminescentie systeem</td></tr><tr><td>PNT1A cellen</td><td>SIGMA Aldrich (voor ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A menselijk, normaal prostaatepitheel geïmmortaliseerd met SV40</td></tr><tr><td>Nthy cellen</td><td>SIGMA Aldrich (voor ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Cellijn menselijk, schildklier folliculaire epitheliale cellen</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit voor celproliferatie-assays</td></tr></tbody></table>

silencing van<em&gt; brca2</em&gt; naar novel-brca2 geregeld biologische functies identificeer in gekweekte menselijke cellen

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing van het tumor suppressor eiwit BRCA2 en de detectie met conventionele biochemische analyses vormen een grote technische uitdaging vanwege de grote omvang van de menselijke BRCA2-eiwit (ongeveer 390 kDa). Wij rapporteren modificaties standaard siRNA transfectie en immunoblotting protocollen menselijke BRCA2 zwijgen te detecteren endogene BRCA2-eiwit, respectievelijk in humane epitheliale cellijnen. Belangrijke stappen zijn een hoge siRNA om transfectiereagens verhouding en twee daaropvolgende rondes van siRNA transfectie binnen hetzelfde experiment. Met behulp van deze en andere wijzigingen van het standaardprotocol we steeds meer bereiken dan 70% onderdrukking van het menselijke BRCA2-gen zoals beoordeeld door immunoblotting-analyse met anti-BRCA2 antilichamen. Bovendien denaturatie van de cellysaten bij 55 ° C in plaats van de gebruikelijke 70-100 ° C en andere technische optimalisaties van de immunoblotting procedure waarmee de aanwezigheid van intact eiwit BRCA2 zelfs when zeer kleine hoeveelheden uitgangsmateriaal zijn of als BRCA2 proteïne expressieniveaus zeer laag. Efficiënte silencing van BRCA2 in humane cellen een waardevolle strategie BRCA2 functies verstoren in cellen met intacte BRCA2, waaronder tumorcellen, om het moleculaire netwerk en celfuncties die beïnvloed kunnen worden door pathogene BRCA2 mutaties in tumoren te onderzoeken. Aanpassing van dit protocol voor efficiënte silencing en analyse van de andere &#39;grote&#39; eiwitten zoals BRCA2 moet gemakkelijk haalbaar zijn.

Alvorens biologische / biochemische assay voor het effect van BRCA2 silencing op celfuncties onderzoeken de eerste stap is om de specificiteit van de silencing bevestigen via een vervormd siRNA (niet-gerichte siRNA) zij aan zij met BRCA2 siRNA (figuur 1A ). Het is belangrijk om een tweede ronde van siRNA transfectie uitgevoerd met een hoge siRNA / transfectie gekozen om een hoge efficiëntie van BRCA2 silencing krijgen. Inderdaad, die uitsluitend een ronde siRNA transfectie of een lager...

Genstilzwijging door siRNA vertegenwoordigt een handige experimentele strategie om BRCA2-afhankelijke biologische functies te analyseren met directe implicaties om de kankerbiologie beter te begrijpen. Een methode om BRCA2 efficiënt te stilzwijgen, samen met de experimentele procedure om veranderingen in BRCA2-eiwitexpressie te detecteren en te kwantificeren door immunoblotting in humane cellijnen, wordt gepresenteerd.

Silencing van<em&gt; BRCA2</em&gt; Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van B RCA twee te onderdrukken door middel van transfectie met SIR A. Dit wordt bereikt door eerst de SIR a transfectiereagenscomplexen voor te bereiden. Vervolgens wordt een eerste ronde van transfectie uitgevoerd door de complexen druppelsgewijs toe te voegen aan een monolaag cellen met een confluentie van 80%. Daarna wordt een tweede ronde van SIR a transfectie uitgevoerd met een hogere verhouding tussen SIR A en het transfectiereagens.Ten slotte worden de cellagen gewassen met ijskoud PBS en worden de cellen gelyseerd bij 4 °C met een detergentgebaseerde lysisbuffer. Uiteindelijk wordt Western blotting-analyse gebruikt om de silencing van B RCA A twee op eiwitniveau aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het zowel efficiënte gensilencing als optimale detectie van eiwitten met een hoog molecuulgewicht, zoals de tumorsuppressor B RCA twee, mogelijk maakt. Om te beginnen: nadat de menselijke epitheliale cellagen zijn gekweekt bij 37 °C en 5% koolstofdioxide in een bevochtigde kamer, verwijdert u het groeimedium en gebruikt u PBS op kamertemperatuur om de cellen te wassen.Voeg twee milliliter 0,25%trypsine 0,53 millimol EDTA-oplossing toe om de cellen van de plaat los te maken en incubeer deze drie tot vijf minuten, afhankelijk van het celtype. Neutraliseer de trypsine door twee milliliter volledig groeimedium met 10%FBS toe te voegen voordat de cellen naar een 15 milliliter buis worden overgebracht. Plaats de buizen in een swing-out rotor en centrifugeer bij 320 tot 330 Gs en vier graden Celsius gedurende drie minuten.Gebruik vijf milliliter antibioticumvrij medium om de pellets te resuspenderen voordat de cellen worden geteld met een Bürker-telkamer of een geautomatiseerd telsysteem. Verdeel vervolgens ongeveer 0,5 tot 1 × 10⁶ cellen in twee milliliter antibioticumvrij medium over elke put van zes-puts platen en incubeer gedurende 24 uur tot een confluentie van 80%. Ga na de incubatie over tot een eerste ronde van transfectie door zes microliter lipide-gebaseerd siRNA-specifiek transfectiereagens te verdunnen in 130 microliter medium met verlaagd serumgehalte.Verdun drie µL van 10 µM S irna in 130 µL reduced serum medium. Meng de verdunde irna met een verdund transfectiereagens en incubeer dit gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder tijdens de incubatie het medium van de cellen en voeg twee mL vers medium zonder antibiotica toe.Voorverwarm op 37 °C. Voeg vervolgens 250 µL van de siRNA-transfectiereagenscomplexen toe aan elke put met cellen in een plaat met zes putjes. Incubeer de cellen daarna in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.Verdun na 24 uur vijf µL van 10 µM irna in 130 µL gereduceerd serummedium en ga over tot een tweede ronde van transfectie, zoals zojuist gedemonstreerd. De hoge concentratie sarna in de tweede ronde is essentieel om een hoge efficiëntie van B rca te verkrijgen. A two silencing.Incubeer de cellen gedurende één tot twee dagen bij 37 °C vóór de analyse om het cellysaat voor immunoblotting-analyse voor te bereiden. Bereid verse lysisbuffer volgens het hier getoonde recept. Verwijder het medium van de cellen en voeg twee milliliter ijskoude PBS per well toe om de cellen te wassen.Verwijder vervolgens het PBS volledig uit de plaat en voeg 200 µL ijskoud lysisbuffer toe aan elke well. Roteer de plaat voorzichtig om de lysisbuffer gelijkmatig te verdelen en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende 15 minuten. Gebruik daarna een celscraper.Verzamel het cellysaat in een microcentrifugebuis op ijs, centrifugeer bij 17.900 Gs en vier graden Celsius gedurende 25 minuten en verzamel het supernatant voor de immunobloting-analyse. Bereid de loopbuffer voor door 50 milliliter 20 x tris-acetaat SDS-loopbuffer te verdunnen met 950 milliliter gedestilleerd water. Bereid het monster als volgt.Voeg 15 µg totaal cellysaat toe. Voeg vijf µL van een vier x monsterbuffer met lithium-SDS pH 8,4, 2 µL van 0,5 M DTT en lysbuffer toe tot een totaalvolume van 20 µL. Denatureer de monsters gedurende 10 minuten bij 55 °C.Het is essentieel om deze temperatuur te gebruiken, aangezien b RCA two proteïne thermosensitief is. Stel vervolgens de elektroforesekamer in volgens de instructies van de fabrikant. Laad daarna de monsters in 10 µL van een eiwitstandaard voor herkleuring van hoog moleculair gewicht op een precast gel en laat deze ongeveer twee uur lopen bij 120 volt.Bereid ondertussen de transferbuffer voor met 50 milliliters 20 x transferbuffer, 100 milliliters 100%methanol en 850 milliliters water. Activeer het PVDF-membraan door het vijf minuten te laten weken in 100%methanol. Spoel af met gedestilleerd water en laat het minstens vijf minuten equilibreren in transferbuffer.Week de sponzen van het transferapparaat in transferbuffer bij vier degree Celsius tot aan gebruik. Stop de run voordat de 55 kilodalton blauwe marker de precast gel verlaat en stel de sandwich samen, beginnend met drie in transferbuffer geweekte sponzen. Plaats vervolgens één drie mm papier verzadigd met transferbuffer.Voeg vervolgens de gel toe, daarna het geactiveerde PVDF-membraan, gevolgd door één in buffer geweekt 3M-grade papier en tot slot drie geweekte sponzen. Plaats de stapel in het apparaat en transfer de eiwitten bij 350 milliamps gedurende vier uur bij vier graden Celsius of bij 180 milliamps bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Was na de transfer het membraan met TBS en blokkeer dit gedurende één uur met TBST en 5% vetarme melkpoeder.Vervang vervolgens de buffer door negen milliliter TBST-melkbuffer met 30 microliters anti BCA2 konijnen polyklonaal antilichaam en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Na het drie keer wassen van het membraan met TBST gedurende telkens 10 minuten, wordt het filter gedurende één uur geïncubeerd met één microliter met mierikswortelperoxidase geconjugeerd anti-konijnen secundair antilichaam, verdund in 10 milliliter TBST-melkbuffer. Na het drie keer wassen van het membraan wordt KEMMA luminescentie-immunodetectie uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.Visualiseer de banden op ECL-films met een hoge resolutie om de specificiteit van de B rca. A silencing te bevestigen. Een scrambled irna werd naast de B RCA two irna gebruikt zoals hier getoond; zoals eerder vermeld, is het belangrijk om een tweede ronde van irna-transfectie uit te voeren met een hoge irna-transfectieverhouding om een hoge efficiëntie van B RCA A silencing te bereiken.De resultaten hier tonen het verschil in knockdown-efficiëntie tussen het gebruik van een lage en een hoge siRNA-transfectieverhouding, afhankelijk van het celtype. De optimale minimale tijd om het hoogste niveau van gen-silencing te bereiken kan variëren na de tweede ronde van siRNA-transfectie; zoals in deze figuur wordt getoond, is 24 uur voldoende voor NTHY-schildkliercellen, maar is tot 48 uur nodig voor een efficiënte B RCA A twee knockdown in PNT one A prostaatcellen. b RCA twee silencing is vrij stabiel tot dag zeven na de tweede ronde van transfectie. Zoals eerder vermeld, resulteert het denatureren van de cellysaten bij een temperatuur boven 55 °C in een verlies tot 50% van het B RCA A twee eiwit.In dit experiment werd de gevoeligheid van B RCA A twee gesilencete PNT een A cellen voor de PARP-remmer rucaparib onderzocht na een behandeling van 24 uur met het geneesmiddel. Er werd een tijdsafhankelijke afname van de celproliferatie waargenomen in B RCA twee gedepleteerde PNT een A cellen vergeleken met de controles. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe lange proteïne-coderende genen kunnen worden gesilenced met een CRNA en hoe hun proteïneproduct efficiënt kan worden gedetecteerd via een geoptimaliseerde immuno-blocking procedure naast BRC twee.Deze methode kan worden toegepast op veel andere problematische grote eiwitten, in het bijzonder wanneer deze in zeer lage concentraties in de cellen worden tot expressie gebracht.

silencing-brca2-to-identify-novel-brca2-regulated-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.

Profilering van oestrogeen-gereguleerde MicroRNA in borstkankercellen

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Hier wordt real-time monitoring van het metabolisme van tumorcellen, gecombineerd met een in vivo kippenembryo chorio-allantoïsche membraan (CAM) model van metastase, gebruikt om nieuwe anti-kanker doelen/middelen te evalueren op hun vermogen om tumorcellen te sensitiviseren voor DNA-beschadigende chemotherapeutica.

Het evalueren van de effectiviteit van Cancer Drug Overgevoeligheid<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Mensen met BRCA1-mutaties hebben een hoger risico op het ontwikkelen van kanker, wat een nauwkeurige evaluatie van de functie van BRCA1-varianten garandeert. Hierin beschreven we een protocol voor functionele beoordeling van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditors die gerichte C:G naar T:A-conversie in levende cellen mogelijk maken.

Functionele beoordeling van BRCA1-varianten met CRISPR-gemedieerde basiseditors

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR's) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR's terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Deze studie presenteert een dubbel CRISPRi-systeem gericht op lange niet-coderende RNA's in melanoomcellen. Het maakt combinatorische genknockdown en synthetische letale screening mogelijk, waarbij kankerspecifieke lncRNA-interacties worden geïdentificeerd voor mogelijke therapeutische strategieën.

Dubbele CRISPR-interferentiestrategie voor het richten op synthetische dodelijke interacties tussen niet-coderende RNA's in kankercellen

Leer hoe je BRCA2-expressie silenced in gekweekte menselijke cellen met siRNA-transfectie en Western blotting. Deze methode maakt efficiënte gen-silencing en detectie van hoogmoleculaire eiwitten mogelijk.

Silencing van

Meer video's verkennen