Silencing van

Het algemene doel van deze procedure is om de expressie van B RCA twee te onderdrukken door middel van transfectie met SIR A. Dit wordt bereikt door eerst de SIR a transfectiereagenscomplexen voor te bereiden. Vervolgens wordt een eerste ronde van transfectie uitgevoerd door de complexen druppelsgewijs toe te voegen aan een monolaag cellen met een confluentie van 80%. Daarna wordt een tweede ronde van SIR a transfectie uitgevoerd met een hogere verhouding tussen SIR A en het transfectiereagens.

Ten slotte worden de cellagen gewassen met ijskoud PBS en worden de cellen gelyseerd bij 4 °C met een detergentgebaseerde lysisbuffer. Uiteindelijk wordt Western blotting-analyse gebruikt om de silencing van B RCA A twee op eiwitniveau aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het zowel efficiënte gensilencing als optimale detectie van eiwitten met een hoog molecuulgewicht, zoals de tumorsuppressor B RCA twee, mogelijk maakt. Om te beginnen: nadat de menselijke epitheliale cellagen zijn gekweekt bij 37 °C en 5% koolstofdioxide in een bevochtigde kamer, verwijdert u het groeimedium en gebruikt u PBS op kamertemperatuur om de cellen te wassen.

Voeg twee milliliter 0,25%trypsine 0,53 millimol EDTA-oplossing toe om de cellen van de plaat los te maken en incubeer deze drie tot vijf minuten, afhankelijk van het celtype. Neutraliseer de trypsine door twee milliliter volledig groeimedium met 10%FBS toe te voegen voordat de cellen naar een 15 milliliter buis worden overgebracht. Plaats de buizen in een swing-out rotor en centrifugeer bij 320 tot 330 Gs en vier graden Celsius gedurende drie minuten.

Gebruik vijf milliliter antibioticumvrij medium om de pellets te resuspenderen voordat de cellen worden geteld met een Bürker-telkamer of een geautomatiseerd telsysteem. Verdeel vervolgens ongeveer 0,5 tot 1 × 10⁶ cellen in twee milliliter antibioticumvrij medium over elke put van zes-puts platen en incubeer gedurende 24 uur tot een confluentie van 80%. Ga na de incubatie over tot een eerste ronde van transfectie door zes microliter lipide-gebaseerd siRNA-specifiek transfectiereagens te verdunnen in 130 microliter medium met verlaagd serumgehalte.

Verdun drie µL van 10 µM S irna in 130 µL reduced serum medium. Meng de verdunde irna met een verdund transfectiereagens en incubeer dit gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder tijdens de incubatie het medium van de cellen en voeg twee mL vers medium zonder antibiotica toe.

Voorverwarm op 37 °C. Voeg vervolgens 250 µL van de siRNA-transfectiereagenscomplexen toe aan elke put met cellen in een plaat met zes putjes. Incubeer de cellen daarna in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.

Verdun na 24 uur vijf µL van 10 µM irna in 130 µL gereduceerd serummedium en ga over tot een tweede ronde van transfectie, zoals zojuist gedemonstreerd. De hoge concentratie sarna in de tweede ronde is essentieel om een hoge efficiëntie van B rca te verkrijgen. A two silencing.

Incubeer de cellen gedurende één tot twee dagen bij 37 °C vóór de analyse om het cellysaat voor immunoblotting-analyse voor te bereiden. Bereid verse lysisbuffer volgens het hier getoonde recept. Verwijder het medium van de cellen en voeg twee milliliter ijskoude PBS per well toe om de cellen te wassen.

Verwijder vervolgens het PBS volledig uit de plaat en voeg 200 µL ijskoud lysisbuffer toe aan elke well. Roteer de plaat voorzichtig om de lysisbuffer gelijkmatig te verdelen en incubeer op een rotator bij 4 °C gedurende 15 minuten. Gebruik daarna een celscraper.

Verzamel het cellysaat in een microcentrifugebuis op ijs, centrifugeer bij 17.900 Gs en vier graden Celsius gedurende 25 minuten en verzamel het supernatant voor de immunobloting-analyse. Bereid de loopbuffer voor door 50 milliliter 20 x tris-acetaat SDS-loopbuffer te verdunnen met 950 milliliter gedestilleerd water. Bereid het monster als volgt.

Voeg 15 µg totaal cellysaat toe. Voeg vijf µL van een vier x monsterbuffer met lithium-SDS pH 8,4, 2 µL van 0,5 M DTT en lysbuffer toe tot een totaalvolume van 20 µL. Denatureer de monsters gedurende 10 minuten bij 55 °C.

Het is essentieel om deze temperatuur te gebruiken, aangezien b RCA two proteïne thermosensitief is. Stel vervolgens de elektroforesekamer in volgens de instructies van de fabrikant. Laad daarna de monsters in 10 µL van een eiwitstandaard voor herkleuring van hoog moleculair gewicht op een precast gel en laat deze ongeveer twee uur lopen bij 120 volt.

Bereid ondertussen de transferbuffer voor met 50 milliliters 20 x transferbuffer, 100 milliliters 100%methanol en 850 milliliters water. Activeer het PVDF-membraan door het vijf minuten te laten weken in 100%methanol. Spoel af met gedestilleerd water en laat het minstens vijf minuten equilibreren in transferbuffer.

Week de sponzen van het transferapparaat in transferbuffer bij vier degree Celsius tot aan gebruik. Stop de run voordat de 55 kilodalton blauwe marker de precast gel verlaat en stel de sandwich samen, beginnend met drie in transferbuffer geweekte sponzen. Plaats vervolgens één drie mm papier verzadigd met transferbuffer.

Voeg vervolgens de gel toe, daarna het geactiveerde PVDF-membraan, gevolgd door één in buffer geweekt 3M-grade papier en tot slot drie geweekte sponzen. Plaats de stapel in het apparaat en transfer de eiwitten bij 350 milliamps gedurende vier uur bij vier graden Celsius of bij 180 milliamps bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Was na de transfer het membraan met TBS en blokkeer dit gedurende één uur met TBST en 5% vetarme melkpoeder.

Vervang vervolgens de buffer door negen milliliter TBST-melkbuffer met 30 microliters anti BCA2 konijnen polyklonaal antilichaam en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Na het drie keer wassen van het membraan met TBST gedurende telkens 10 minuten, wordt het filter gedurende één uur geïncubeerd met één microliter met mierikswortelperoxidase geconjugeerd anti-konijnen secundair antilichaam, verdund in 10 milliliter TBST-melkbuffer. Na het drie keer wassen van het membraan wordt KEMMA luminescentie-immunodetectie uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.

Visualiseer de banden op ECL-films met een hoge resolutie om de specificiteit van de B rca. A silencing te bevestigen. Een scrambled irna werd naast de B RCA two irna gebruikt zoals hier getoond; zoals eerder vermeld, is het belangrijk om een tweede ronde van irna-transfectie uit te voeren met een hoge irna-transfectieverhouding om een hoge efficiëntie van B RCA A silencing te bereiken.

De resultaten hier tonen het verschil in knockdown-efficiëntie tussen het gebruik van een lage en een hoge siRNA-transfectieverhouding, afhankelijk van het celtype. De optimale minimale tijd om het hoogste niveau van gen-silencing te bereiken kan variëren na de tweede ronde van siRNA-transfectie; zoals in deze figuur wordt getoond, is 24 uur voldoende voor NTHY-schildkliercellen, maar is tot 48 uur nodig voor een efficiënte B RCA A twee knockdown in PNT one A prostaatcellen. b RCA twee silencing is vrij stabiel tot dag zeven na de tweede ronde van transfectie. Zoals eerder vermeld, resulteert het denatureren van de cellysaten bij een temperatuur boven 55 °C in een verlies tot 50% van het B RCA A twee eiwit.

In dit experiment werd de gevoeligheid van B RCA A twee gesilencete PNT een A cellen voor de PARP-remmer rucaparib onderzocht na een behandeling van 24 uur met het geneesmiddel. Er werd een tijdsafhankelijke afname van de celproliferatie waargenomen in B RCA twee gedepleteerde PNT een A cellen vergeleken met de controles. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe lange proteïne-coderende genen kunnen worden gesilenced met een CRNA en hoe hun proteïneproduct efficiënt kan worden gedetecteerd via een geoptimaliseerde immuno-blocking procedure naast BRC twee.

Deze methode kan worden toegepast op veel andere problematische grote eiwitten, in het bijzonder wanneer deze in zeer lage concentraties in de cellen worden tot expressie gebracht.