Name: Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van Coxiella burnetii Transposon Mutants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer hoe je fluorescent getransponeerde mutanten van Coxiella burnetii genereert en hun internalisatie, replicatie en cytotoxiciteit analyseert met geautomatiseerde microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Avenir/ATIP-subsidie aan Matteo Bonazzi en een Marie Curie CIG (nr. 293731) aan Eric Martinez. De auteurs willen Dr. Robert Heinzen bedanken voor het delen van C. burnetii stammen, antilichamen en tools, Virginie Georget en Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) voor hun technische assistentie en data-analyse.

<ol><li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li>
<li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li>
<li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li>
<li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%3A+a+biological+weapon+in+your+backyard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li>
<li>Der Hoek, W. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li>
<li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.%3A+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).</li>
<li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OmpA%2C+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion%2C+by+multi-phenotypic+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013(2014).</li>
<li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li>
<li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot%2FIcm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566(2013).</li>
<li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+tiger+into+a+house+cat%3A+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii.%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii.</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li>
<li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li>
<li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot%2FIcm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li>
<li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li>
<li>Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97(2011).</li>
<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De studie host / pathogen interactions heeft bewezen een opmerkelijke methode om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten teller. Vanwege de verscheidenheid aan strategieën, door verschillende bacteriële pathogenen, de identificatie en karakterisering van bacteriële virulentiefactoren en de ontvangende signaalroutes die zijn gericht bij infecties vormen een uitdaging. Dit vraagt ​​om de ontwikkeling van nieuwe benaderingen voor de grootschalige identificatie van de belangrijkste gastheer / ziekteverwekker interactie hubs. De recente ontwikkeling van innovatieve, high-throughput en high content technieken vertegenwoordigt een waardevolle grondstof die kan worden aangepast aan de studie van intracellulaire bacteriële pathogenen 15. Hier hebben we de zoönotische bacteriële ziekteverwekker Coxiella burnetii gebruikt als model voor selectie technieken die transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays combineren ontwikkelen. ImportanTLY, laat deze screening methode de gelijktijdige monitoring van meerdere stappen van de Coxiella intracellulaire cyclus, het verstrekken van een globaal overzicht van de strategieën ontwikkeld door deze bacterie binnen te vallen, te repliceren en blijven binnen de geïnfecteerde cellen. De hier beschreven benadering is gebaseerd op twee gevestigde technieken, transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays, die met succes toegepast op de studie van bacteriële pathogenen. De combinatie van deze technieken in de context van high-throughput / high content schermen kunnen wij de effecten van een groot aantal bacteriële mutaties te beoordelen door het analyseren van een zeer groot aantal events (typisch 15.000 geïnfecteerde cellen per bacteriële mutaties worden afgebeeld en geanalyseerd). Dit levert een belangrijke statistische analyse van gebeurtenissen zoals bacteriële invasie van gastheercellen en intracellulaire replicatie, die, van nature, aan hoge variabiliteit. Het is belangrijk op te merken dat andere dan ep cellijnenithelial kan worden gebruikt voor dit type onderzoek. Echter, vlakke en grote epitheelcellen zijn optimaal voor beeldanalyse als gastheer celorganellen gemakkelijker te detecteren. Omdat de meeste geautomatiseerde microscopen automatisch kan omgaan met een groot aantal platen, er praktisch geen beperkingen aan het aantal mutanten die tegelijkertijd kunnen worden gescreend. Afhankelijk van de pathogeen, de gebruiker privilege het gebruik van een epifluorescentie of confocale microscoop. Het tijdstip van beeldacquisitie zal vooral afhangen van de gevoeligheid van de microscoop camera, het aantal verworven per putje en het aantal kanalen verworven per veld gebieden. De gebruiker kan bepalen hoe deze factoren aan te passen aan de screening protocol te optimaliseren. Als voorbeeld, we imaged een 96-putjesplaat / hr met behulp van de onder 5.1 omstandigheden. Beeldanalyse grotendeels afhankelijk van de machine (of cluster van machines) gebruikt. We maken gebruik van een 12-kern (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM werkstation. Deze machine vereist onderlingeveer 40 min tot beelden die van de ene plaat te analyseren. Een belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwikkelen van deze assays is het opzetten van een nieuw (of het optimaliseren van bestaande) protocollen voor het manipuleren en verwerken van een groot aantal monsters mogelijk. Een kenmerkend voorbeeld is de ontwikkeling van de enkelvoudige primer kolonie-PCR benadering, waardoor we snel amplificeren sequentie en Coxiella DNA fragmenten die de plaats van invoeging van elk transposon, van zeer kleine monsters. Op basis van onze ervaring, de high-fidelity polymerase moet zorgvuldig worden geselecteerd en getest om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De enige beperking van deze benadering kan verbergen in de waarneming dat, in de meeste gevallen ongeveer 30% van de verwerkte monsters geen misbruik, hetzij als gevolg van de PCR of sequentiebepaling stappen. Echter, gezien het feit dat de isolatie van nieuwe Coxiella transposon mutanten is geen snelheidsbeperkende stap, betekent dit niet vertegenstuurde een groot probleem. Evenzo heeft het ontwikkelen van een betrouwbare bepaling om de bacteriële concentratie van mutant bestanden kwantificeren pijl op deze aanpak. Vanwege de neiging van Coxiella om te aggregeren wanneer in suspensie is het gebruik van optische dichtheid niet geldt voor de concentratie van Coxiella culturen en de enige bestaande alternatief was kwantitatieve PCR (qPCR) berekenen. Hier is het gebruik van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel aanzienlijk versneld bacteriën kwantificering. Deze benadering kan ook gebruik maken van het gebruik van stabiele cellijnen die fluorescente merkers voor verschillende intracellulaire compartimenten naargelang het pathogeen gebruikt. Een ander belangrijk aspect is de toepassing van celkweekmedium zonder fenolrood. We vonden dat deze pH indicator een natuurlijke fluorescentie verspreid over de rode en groene spectrum dat het signaal dat op de geautomatiseerde fluorescentielezer verzadigd. THij strategie hier gepresenteerde berust op willekeurige transposon mutagenese. Voor de mutanten van belang, raden wij valideren unieke omzettingen (en klonaliteit) met behulp van Southern blot en PCR amplificaties van de transposon inbrengplaats. Naast de in de sectie protocol beschreven apparatuur, teams die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de screening aanpak hier wordt gepresenteerd, zal groot voordeel in de set-up van een relationele database voor het verzamelen van gegevens, een server voor data-opslag en een werkstation voor snelle beeldanalyse. Belangrijk is dat de werkwijze die hier beschreven is geschikt voor de studie van andere intracellulaire bacteriële pathogenen verschaft een random mutagenese methode bestaat voor het pathogeen, kunnen cellijnen geïnfecteerd met het pathogeen en deze toont een specifiek fenotype tijdens infectie.

De opkomende, endemische bacterie Coxiella burnetii is verantwoordelijk voor grote uitbraken van Q-koorts, een slopende griepachtige zoönose met ernstige gezondheids- en economische impact 1. De belangrijkste reservoirs van Coxiella zijn huisdieren en vee, en er wordt geschat dat meer dan 90% van melkvee in de VS dragen C. burnetii 2. Mensen zijn toevallige hosts die geïnfecteerd zijn door inademing van besmette aerosolen. Human Q-koorts manifesteert ofwel als een acute of chronische ziekte, die fatale complicaties met een sterftecijfer bereiken van 65% 1,3 kan hebben. Met een besmettelijke dosis van 1-10 organismen, Coxiella de meest infectieuze pathogenen bekend en is onderzocht als een mogelijke biologisch wapen 4. De recente explosieve uitbraak van Q-koorts in Nederland (2007 - 2010), met cases dosis verhoogd wordt van 182 tot meer dan 2000 per jaar, is een voorbeeld van de zware virulentie van het pathogeen5. De opmerkelijke efficiëntie van Coxiella infecties is waarschijnlijk geassocieerd met resistentie tegen omgevingsstress, gecombineerd met zijn unieke aanpassing aan gastheercellen. Inderdaad, Coxiella aanwezig in het milieu in de vorm van metabolisch inactieve kleincellige varianten (SCV), die opmerkelijk resistent tegen meerdere zware omstandigheden (uitdroging, temperatuur, etc.). SCVs worden opgenomen door fagocytische cellen via α β V 3 integrinen 6 terwijl invasie van niet-fagocytische cellen wordt gemedieerd door de Coxiella adhesie / invasie OmpA 7 en een ongeïdentificeerde receptor. Na opname, Coxiella woont in nauwsluitende vacuoles, positief voor de vroege endosomale markers Rab5 en EEA1 8. Bacteriën reageren op endosomale verzuring door het omzetten naar metabolisch actief grote cel varianten (lichte bedrijfswagens) en het activeren van een Dot / Icm type 4 secretie systeem (T4SS) 9, Sterk homoloog is met die van Legionella pneumophila 10. De afscheiding van Dot / Icm effectoren laten Coxiella tot een grote, LAMP1-positieve zure compartiment met actieve lysosomale enzymen, waar bacteriën kunnen gedijen en actief te beschermen geïnfecteerde cellen van apoptose 11 genereren. Derhalve wordt de intracellulaire cyclus van Coxiella bestuurd door Dot / Icm-gemedieerde translocatie van bacteriële effectoren 12 echter de microbiële factoren betrokken bij gastheercel invasie, bacteriële replicatie en verspreiding van de infectie blijven grotendeels onbekend. De combinatie transposon mutagenese en fluorescentie gebaseerde assays ontwikkelen wij onpartijdige benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van bacteriële factoren die bij de hoofdstappen van Coxiella infecties: 1) internalisatie in gastheercellen, 2) intracellulaire replicatie, 3) cell-to-cell spread en 4) de persistentie. Tot op heden hebben we meer dan 1.000 m afgeschermdutations in 500 Coxiella coderende sequenties, die ons met ongekende inzichten in de gastheer-pathogeen interacties die Coxiella pathogenese 7 reguleren. We merken kan deze benadering worden toegepast voor de studie van andere intracellulaire pathogenen die celbiologie elementen met Coxiella delen.

<table><tbody><tr><td>Citroenzuur</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>IJzersulfaat</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Bacto Neopepton</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Casaminozuren</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrine</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI met glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 medium component</td></tr><tr><td>RPMI met glutamax, zonder fenolrood</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Voor celcultuur en infectie</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>GE healthcare</td><td>SH30071</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Trypsine EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Saponine</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>Bovien serumalbumine</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>Electroporatiecuvet 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Voor Coxiella transformatie</td></tr><tr><td>Trackmates schroefdopbuizen met doppen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barcoded schroefdop</td></tr><tr><td>96-wells microplaat met zwarte wanden en bodem</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Vlakke donkere bodem, voor dsDNA kwantificering</td></tr><tr><td>96-wells PCR microplaat</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse vrij</td></tr><tr><td>96-wells plaat, deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Voor Coxiella mutanten infecties</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Voor dsDNA kwantificering</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Voor dsDNA kwantificering</td></tr><tr><td>Phusion hoge trouw DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Voor single primer kolonie PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antilichaam</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Fluorescentie microplaatlezer Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescentie geautomatiseerde microscoop Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en multi-fenotypische high-inhoud screening van<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; transposon mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasie en kolonisatie van gastheercellen door bacteriële pathogenen afhangen van de activiteit van een groot aantal prokaryotische eiwitten, gedefinieerd als virulentiefactoren die kan ondermijnen en manipuleren belangrijkste gastheerfuncties. De studie host / pathogen interactions is daarom van groot belang om bacteriële infecties te begrijpen en alternatieve strategieën om infectieziekten bestrijden. Deze benadering vereist echter de ontwikkeling van nieuwe high-throughput assays voor de onbevooroordeelde, geautomatiseerde identificatie en karakterisering van bacteriële virulentie determinanten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het genereren van een GFP-gelabeld mutantbibliotheek door transposon mutagenese en de ontwikkeling van high content benaderingen voor de gelijktijdige identificatie van verschillende transposon-geassocieerde fenotypes. Ons werkmodel is de intracellulaire bacteriële pathogenen Coxiella burnetii, het etiologische agens van de zoönose Q-koorts, die wordt geassocieerd met SEvere uitbraken met een daaruit voortvloeiende gezondheid en economische last. De obligate intracellulaire karakter van deze pathogeen tot voor kort aanzienlijk bemoeilijkt de identificatie van bacteriële factoren betrokken bij ontvangst pathogen interactions, waardoor van Coxiella het ideale model voor de uitvoering van high-throughput / high content benaderingen.

Na isolatie van transposon mutanten enkele primer kolonie-PCR is een robuuste, high-throughput werkwijze voor de plaats van transposon insertie zijn voor elke mutant. Deze aanpak haalt uit een typische geneste PCR-protocol maar hier één primer hybridiseert specifiek en / of niet-specifiek aan het matrijs-DNA afhankelijk van de stringentie van de annealing temperatuur (figuur 1A). De typische PCR producten uit meerdere DNA-fragmenten, waarvan de meeste specifieke (Figuur 1B). Het gebruik van een andere sequentie primer die direct stroomopwaarts van het transposon ITR en stroomafwaarts van de sequentie die door de amplificatie primer hybridiseert verschaft specificiteit voor de sequentiestap (figuur 1C). Geautomatiseerde software voor sequentieanalyse lijnt de verkregen sequenties de Coxiella genoom die de juiste ligging van transposon inserties (figuur 1C). Alle transposon inserties kan dan annotated de Coxiella genoom (figuur 1D). Elke Coxiella mutant geïsoleerd en geamplificeerd in axenisch ACCM-2 medium voordat hetzij opslag of screening. Figuur 2 toont een voorbeeld van 38 transposon mutanten in 16 dot / icm Coxiella genen (Figuur 2A). Om de levensvatbaarheid van Coxiella mutanten te beoordelen, wordt axenic groeicurven verkregen door bemonstering bacterieculturen gedurende 7 dagen na inoculatie en toepassen van de bacteriële concentratie assay 1,5 (Figurie 2B) beschreven. Versterkte mutanten worden vervolgens geïncubeerd met epitheelcellen in drievoud 96-well platen gedurende 7 dagen. Alle Coxiella mutanten gegenereerd worden GFP-gelabeld, intracellulaire groeicurven worden verkregen door meting van de fluorescentie-intensiteit van GFP per put, elke 24 uur, en het uitzetten van de gemeten waarden als functie van de tijd (Figuur 2C). Intracellulair groeicurven bieden kwantitatieve analyse van de fenotypen geassocieerd met elke transposon insertie in het genoom Coxiella. Om kwalitatieve informatie toe te voegen ongeveer hetzelfde transposon mutanten, hebben we gekozen voor geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Zeven dagen na infectie platen gefixeerd, verwerkt voor immunofluorescentie zoals beschreven in 4 en toepassing van een geautomatiseerde, epifluorescentiemicroscoop zoals beschreven in 5. Geautomatiseerde beeldanalyse software zoals CellProfiler (Broad Institute, geanalyseerd <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verwerkt de verkregen kanalen onafhankelijk en segmenten geïdentificeerd objecten vergelijkende analyse (Figuur 3). Dit maakt de identificatie en morfologische karakterisering van gastheer celkernen, cel contouren, lysosomen en Coxiella kolonies (Figuur 3 bovenste panelen). Correleren Coxiella kolonies met cellen en lysosomen kan de identificatiop en specifieke morfologische analyse van Coxiella bevattende vacuolen (die LAMP1 positief, Figuur 3 linksonder paneel). Correleren Coxiella kolonies met gastheercel contouren maakt de identificatie en specifieke morfologische analyse van geïnfecteerde cellen (figuur 3 onderaan in het midden paneel). Tenslotte worden de 4 kanalen samengevoegd ter illustratie en kwaliteitscontrole (figuur 3 rechterbenedenhoek). De gegevens verkregen uit geautomatiseerde beeldanalyse kunnen tegen elkaar worden uitgezet om &quot;multi-fenotypische puntgrafieken&quot; te verkrijgen. Als voorbeeld, in figuur 4A de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het aantal kolonies per cel (Figuur 4A), teneinde mutaties die intracellulaire replicatie van Coxiella (replicatie fenotype) en / of van invloed identificeren de capaciteit van de bacteriën om gastheercellen binnenvallen (internabiliseren fenotype). Statistische analyse werd gebruikt om de regio&#39;s in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Mutanten werden waargenomen bij 3 hoofdclusters: mutaties die resulteren in een gebrekkige intracellulaire groei van Coxiella werden gegroepeerd in de meest linkse gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, roze en rode stippen); mutaties die Coxiella internalisatie in cellen beïnvloed werden gegroepeerd in het onderste gedeelte van de grafiek (Figuur 4A, licht en donker blauwe stippen) en tenslotte, groene stippen in de meest rechtse gebied van het perceel corresponderen met mutaties resulteren in niet-significante fenotypen ( Z-score&gt; -2). Belangrijk mutanten die niet te repliceren, maar nog kunnen gastheercellen binnendringen, worden gedetecteerd na 7 dagen na infectie als enkele bacterie of kleine kolonies, naast celkernen (Figuur 4C, tweede paneel) systeem. Vandaar dat de grootte van Coxiella &quot;colonies &quot;aanzienlijk worden beïnvloed maar het aantal geïnfecteerde cellen wordt niet beïnvloed in vergelijking met WT Coxiella geïnfecteerde cellen. Integendeel, mutaties die het vermogen van Coxiella gastheercellen binnendringen beïnvloeden resulteren in een afname in het aantal kolonies / cel. Is dit aantal ver onder 1, betekent dit dat, gemiddeld, is er een afname van het aantal geïnfecteerde cellen. Als alternatief kan de gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies tegen het aantal gastheercellen dat infectie (figuur 4B), wordt uitgezet mutaties die cytotoxiciteit voor Coxiella (cytotoxische fenotype) verlenen identificeren. Zoals hierboven, werd een statistische analyse gebruikt om de regio&#39;s in de resulterende puntgrafiek overeenkomt met milde (-4 &lt;Z-score ≤ -2) en ernstige (Z-score ≤ -4) fenotypes definiëren. Het meest afgeschermde mutaties hadden geen significant effect celoverleving, ongeacht bacteriële replicatie in gastheercellen (Figuur 3B groene stippen). 37 mutaties mild aangetaste gastheercel overleving (figuur 3B, licht rode stippen), en 7 mutaties waren bijzonder schadelijk voor het hosten van de cel overleving (figuur 3B, donker rode stippen). Let op: er parameters verkregen door geautomatiseerde beeldanalyse procedure kan worden gebruikt om andere overzichten afleiden Volgens experimentele behoeften. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figuur 1:. Sequentiebepaling en annotatie van Coxiella transposon mutanten (A) Single kolonie PCR primer wordt gebruikt om DNA fragmenten die de plaats van transposon insertie amplificeren. Een amplificatieprimer (Amp) wordt gebruikt als een specifieke en niet-specifieke primer, afhankelijk van de stringentie van de hybridisatie temperatuur. (B) Typisch resultaat van enkele primer kolonie PCR. Elke reactiOp produceert een aantal fragmenten van variabele grootte, waarvan sommige het transposon insertie site; anderen worden willekeurig geamplificeerd als bijproducten van de lage stringentie PCR-cyclus. (C) Het gebruik van een primer sequentie (Seq) dat hybridiseert met het transposon functie kan de volgorde van de fragmenten van belang. (D) Sequentieanalyse software laat de automatische annotatie van transposon toevoegingen op het bacteriële genoom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figuur 2:. Axenische en intracellulaire groei van Coxiella transposon mutanten (A) In de pilot scherm, hebben we geïsoleerd, gesequenced en gescreend 38 transposon mutanten kern 16 genes van de Coxiella dot / icm secretie systeem (aangegeven in rood). (B) Teneinde de levensvatbaarheid van elk transposon mutant te beoordelen, de groei van elk isolaat in axenische kweekmedium wordt gevolgd gedurende 8 dagen onder toepassing van een fluorescent gelabeld DNA intercalatiemiddel. (C) Elke mutant wordt vervolgens gebruikt om epitheelcellen te infecteren. Omdat de transposon bezit een GFP cassette, wordt de intracellulaire groei van bacteriën dan 7 dagen van de infectie gecontroleerd door de variaties van GFP fluorescentie geassocieerd met Coxiella replicatie, met behulp van een microplaat reader. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figuur 3: Geautomatiseerde beeldanalyse van Coxiella infecties Een auto.Gekoppelde epifluorescentie microscoop wordt gebruikt om de afbeelding 21 posities per putje van 96 triplo-putjes. Het beeld analyse software segmenten objecten in elke verworven kanalen voor kwantificering en analyse. In alle gevallen worden de voorwerpen rand van de beelden raken uitgesloten. (A) De Hoechst kanaal wordt gebruikt om gastheercellen te identificeren kernen (omcirkeld in groen). (B) Deze worden gebruikt als zaden gastheercel contouren in het Cy3 kanaal te identificeren (de positie van de kernen wordt omcirkeld in blauw, cel contouren zijn in het groen). (C) De Cy5 kanaal wordt gebruikt om LAMP1-positieve compartimenten te identificeren (omcirkeld in groen); alleen de objecten opgenomen in de eerder geïdentificeerde cel contouren (in het rood) worden bewaard voor beeldanalyse. (D) De GFP-kanaal wordt gebruikt om Coxiella kolonies te identificeren (omcirkeld in groen). (E) Correleren Coxiella kolonies met LAMP1-positieve compartimenten maakt de identificatie van Coxiella </em&gt; Bevattende vacuolen (CCV); alleen de objecten opgenomen in de eerder geïdentificeerde cel contouren (in het groen) worden bewaard voor beeldanalyse. (F) Correleren Coxiella kolonies met mobiele contouren maakt de identificatie van geïnfecteerde cellen (pseudocolored). (G) beelden die in de 4 fluorescentie kanalen (corresponderend met Coxiella kolonies (groen) talrijke celkernen (blauw), de gastheercel plasmamembraan (grijs), LAMP1-positief compartimenten (red)) worden samengevoegd en gebruikt voor illustratie en kwaliteit control. Schaal bars 10 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figuur 4: Grootschalige identificatie van Coxiella factoren betrokken bij gastheer / ziekteverwekker interactionen. (A) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies uitgezet tegen het relatieve aantal kolonies per cel replicatie en internalisatie fenotypen van belang te identificeren. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score&gt; -2 (niet significant). Roze en licht blauwe stippen vertegenwoordigen replicatie en internalisatie fenotypes respectievelijk met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode en donker blauwe stippen vertegenwoordigen fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). (B) De gemiddelde oppervlakte (in um 2) van Coxiella kolonies werd uitgezet tegen het aantal cellen (geïnfecteerd en niet geïnfecteerd) die 7 dagen na infectie overleefden het schatten van de cytotoxische werking voortvloeiende uit transposon inserties. Groene stippen vertegenwoordigen fenotypes die afwijken van WT Coxiella door een Z-score&gt; -2 (niet significant). Roze stippen vertegenwoordigen cytotoxische phenotypes met een Z-score tussen -2 en -4 (mild fenotypes). Rode stippen vertegenwoordigen cytotoxische fenotypes met een Z-score ≤ -4 (sterke fenotypes). Pijlen geven mutanten blijkt uit de overeenkomstige kleine letter C. (C) Representatieve beelden van replicatie, internalisatie en cytotoxische fenotypes. In alle gevallen gastheercel kernen in rood, Coxiella kolonies in groen. Schaal bars 50 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Coxiella burnetii is een obligaat intracellulaire Gram-negatieve bacterie die verantwoordelijk is voor de zoönose Q-koorts. Hier beschrijven we werkwijzen voor het genereren van Coxiella fluorescent transposon mutanten en de geautomatiseerde identificatie en analyse van de verkregen internalisatie, replicatie en cytotoxische fenotypes.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Het algemene doel van deze procedure is om op grote schaal de COE-factoren te identificeren die betrokken zijn bij de belangrijkste stappen van de infectiecyclus, inclusief de toegang tot gastheercellen, de generatie van een bacteriële replicatieniche en persistentie. Dit wordt bereikt door eerst een GF PT co-mutantbibliotheek te genereren via transposon-mutagenese.Vervolgens worden de gastcellen geïnfecteerd met elke geïsoleerde mutant. Daarna wordt de intracellulaire replicatie van elke mutant in real-time gevolgd met een microplate-lezer om de mutaties te identificeren die het meest nadelig zijn voor de Coxiella-infectie. Ten slotte worden de Coxiella-geïnfecteerde cellen geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde microscopie.Uiteindelijk maakt geautomatiseerde beeldanalyse de morfologische karakterisering van elk verkregen fenotype mogelijk om elk gemuteerd gen te associëren met een vermeende functie in de infectiecyclus van Coxiella. Deze methode kan helpen bij het aanpakken van kernproblemen op het gebied van gastheer-pathogeen-interacties, zoals de grootschalige identificatie van de essentiële genen van een bepaald pathogeen die nodig zijn om te interageren met de gehele cel en diens moleculaire machinerie naar eigen voordeel te kapen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het uitplaten en isoleren van COE-kolonies moeilijk te realiseren is.Inderdaad, COE vormt zeer kleine kolonies die zorgvuldig moeten worden geëxtraheerd uit zacht ACCM twee aro. Deze methode kan inzicht bieden in coccal lab-infecties. Het kan ook worden toegepast op andere intracellulaire pathogene bacteriën, zoals salmonella, burel, mycobacterium, enzovoort.Na het transformeren van competente Coxiella met transposon- en transposase-coatingplasmiden volgens het tekstprotocol, bereidt u voor het isoleren van individuele mutanten de onderste agarlaag door in een microbiologische veiligheidskabinet (MSC) 10 milliliter gesmolten 0,5% agar te mengen met 10 milliliter twee X accm, twee. Voeg direct de juiste antibiotica toe, giet het mengsel in een Petrischaal en laat het 30 minuten onafgedekt afkoelen, waarna het 20 minuten aan de lucht wordt gedroogd. Om de bovenste agarlaag te bereiden, mengt u 1,25 milliliter twee x accm twee met 0,75 milliliter water in een polystyreenbuis van 15 milliliter. Voeg de juiste antibiotica toe en incubeer bij 37 °C.Voeg vervolgens 1 tot 100 µL bacteriële cultuur toe en vortex vijf seconden. Voeg daarna 0,5 mL gesmolten aros-mengsel toe en giet dit onmiddellijk over de onderste aros-laag. Laat de plaat 20 minuten afkoelen.Plaats het deksel erop en incubeer bij 4 °C gedurende 20 minuten om de stolling te bevorderen. Verwijder vervolgens het deksel en laat de plaat 20 minuten aan de lucht drogen voordat deze wordt overgebracht naar een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide en 2,5% zuurstof voor zes tot zeven dagen. Zodra kolonies detecteerbaar zijn, kunnen deze worden verzameld door het uiteinde van een pipetteertip van 1 mL af te knippen en deze te gebruiken om plugs met enkele kolonies te isoleren.Breng deze vervolgens over naar de wells van een 24-well plaat die 1,5 milliliters accm two bevat. Nadat een standaardcurve is opgesteld volgens het tekstprotocol, wordt elke bacteriële suspensie gekwantificeerd door vijf microliters 10% Triton X 100 per well te dispenseren. Voeg in een 96-well microplaat met zwarte wanden en bodem 50 microliters van de bacteriële suspensies toe aan elke well en incubeer deze 10 minuten op een plaatshaker.Verdun bij kamertemperatuur de reagent voor de kwantificering van dubbelstrengs DNA één op 200 met XTE-buffer en voeg 55 µL van de verdunde reagent toe aan elk monster. Meng deze goed in een 96-wells microplaat met een plaatshaker vóór incubatie in het donker bij kamertemperatuur gedurende twee tot vijf minuten, en meet vervolgens de fluorescentie van de monsters met een fluorescentie microplaatlezer en filters voor standaard fluoresceïnegolflengten. Om de plot van de bacteriële DNA-concentratie te verkrijgen, worden de fluorescentiemetingen vergeleken met de eerder bereide standaardcurve; deel de DNA-concentratie door de massa van het Coxiella-genoom om de bacteriële concentratie te bepalen.Druk de resultaten uit in genoomequivalenten per milliliter nadat single primer kolonie-PCR en DNA-sequencing zijn uitgevoerd volgens het tekstprotocol. Laad met behulp van sequence-analysesoftware het volledige geannoteerde genoom van Coxiella Burnett I 4 93 NM one met de align-to-reference-functie, laad en align de sequentieresultaten met blast N en bepaal de plaats van transpositie. Nadat een Vero-celсусpensie van 10^5 cellen per milliliter in RPMI-medium is bereid volgens het tekstprotocol, worden 100 µL van de suspensie in elke well van een zwarte 96-wells plaat met een vlakke, transparante bodem gedoseerd; centrifugeer de plaat 5 minuten bij 400 ×g en kamertemperatuur en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.Laat de volgende dag 96-wells platen met de Coxiella-mutanten op kamertemperatuur staan en verdun 150 µL bacteriële suspensies in 300 µL RPMI zonder fenolrood en FBS in een deep-well 96-wells plaat. Verwijder vervolgens het medium van de Vero-cellen en breng 100 µL verdunde Coxiella-mutanten per well aan. Gebruik well A1 als negatieve controle en wells A2 en A3 als positieve controles. Centrifugeer de plaat met een aerosol-dichte centrifugeplaatnhouder bij 400 ×g en kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na incubatie van de plaat bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 gedurende twee uur, wordt het bacteriebevattende medium vervangen door 100 µL vers compleet RPMI-medium per well. Gebruik een fluorescentie-microplate reader met filters voor fluoresceïne.Meet de GFP-fluorescentie dagelijks gedurende zeven dagen. Verwijder op de zevende dag na infectie het medium uit de plaat en vervang dit door 50 µL per well vers compleet medium met een 1:1000 verdunning van een celpermeabele fluorescente kleurstof. Incubeer de cellen gedurende 30 tot 60 minuten. Vervang na de incubatie het medium door 50 µL per well van 4% PFA in PBS en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de buffer met PFA en was de wells drie keer met PBS. Voeg na het verwijderen van de laatste wasbeurt 50 µL blokkeringsoplossing toe aan elke well en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.Vervang vervolgens de blokkeringsoplossing door 40 µL per well van een verse blokkeringsoplossing met een verdunning van 1:500 van anti-LAMP1-antilichaam. Na incubatie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur wordt de oplossing verwijderd en worden de wells vijf keer gewassen met een plaatwasser door 100 µL PBS per well toe te voegen. Voeg daarna 40 µL per well blokkeringsoplossing toe die het juiste fluorescerende secundaire antilichaam en hooked 3 3 2 5 8 bevat bij 5 µg/mL.Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de monsters vijf keer en laat de laatste PBS-wasbeurt in de wells achter om uitdroging te voorkomen. Gebruik voor de beeldacquisitie een geautomatiseerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20 x objectief en kanalen van 3 4 88 5 55 en zes 15 nanometer.Neem 21 onafhankelijke beeldvelden per put om minimaal 5 000 cellen per monster af te beelden. Pas autofocus toe met het kanaal van de gastcelkernen als referentie. Gebruik tot slot geautomatiseerde beeldanalyse om een aantal relevante kenmerken uit de verkregen beelden te extrapoleren.Deze figuur illustreert 38 transposonmutanten in 16 point ICM Coxe L bij Genes; groeicurves die de levensvatbaarheid van de mutanten beoordelen worden hier getoond. Intracellulaire groeicurves voor Coxiella-mutanten die zijn geïncubeerd met epitheelcellen bieden een kwantitatieve analyse van de fenotypen die geassocieerd zijn met transposoninserties in het Coxiella-genoom. In deze figuur werd geautomatiseerde beeldacquisitie uitgevoerd om gastheercelkernen, celcontouren, lysosomen en Coxiella-kolonies te identificeren en te karakteriseren.Door Coxiella-kolonies te correleren met cellen en lysosomen kan de morfologische analyse van Coxiella-bevattende vacuolen worden uitgevoerd. Het correleren van Coxiella-kolonies met de contouren van de gastheercel maakt de morfologische analyse van geïnfecteerde cellen mogelijk. Ten slotte worden de vier kanalen samengevoegd.De gemiddelde oppervlakte van Coxiella-kolonies is uitgezet tegen het aantal kolonies per cel om mutaties te identificeren die de intracellulaire replicatie van Coxiella en/of het vermogen van bacteriën om gastheercellen binnen te dringen, beïnvloeden. Mutanten werden waargenomen in drie clusters: mutaties die de intracellulaire groei van Coxiella beïnvloedden, mutaties die de internalisatie van Coxiella in cellen beïnvloedden en niet-significante fenotypes. Hier is de gemiddelde oppervlakte van Coxiella-kolonies uitgezet tegen het aantal gastheercellen dat de infectie overleefde, om mutaties te identificeren die na ontwikkeling cytotoxiciteit verlenen aan Coxiella.Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van bacteriële infecties om gastheer-pathogeeninteracties op grote schaal te onderzoeken, en identificeerde doelwitten in de gastheer en bij bacteriën voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën om infectieziekten te bestrijden.

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking...

High-throughput screening &#39;en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

This video demonstrates a method for assessing the intracellular growth of GFP-tagged Coxiella mutants within cultured epithelial cells. The mutant phenotype is visualized using immunostaining and epifluorescence microscopy, allowing the study of the effect of the mutation on intracellular growth.

Assessment of Intracellular Growth of Coxiella Mutants within Eukaryotic Cells

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Hier presenteren we protocollen voor beginnende onderzoekers om te starten fenotypering voor het farmacologisch belangrijke bacteriële genus Streptomyces.

Visuele en microscopische evaluatie van Streptomyces Developmental mutanten

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Leer hoe je fluorescent getransponeerde mutanten van Coxiella burnetii genereert en hun internalisatie, replicatie en cytotoxiciteit analyseert met geautomatiseerde microscopie.

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van

Meer video's verkennen