Name: Simultaan Ex vivo Functioneel testen van Two netvliezen door In vivo Elektroretinogram System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer hoe u ex vivo elektroretinografie toepast om de functie van geïsoleerde muizenretina's te onderzoeken. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van staaf- en kegelsignalering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies EY019312 en EY021126 (VJK), EY002687 aan de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences aan de Universiteit van Washington, en door onderzoek ter voorkoming van Blindheid.

Alle experimentele protocollen waren in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de institutionele commissie Animal Studies aan de Universiteit van Washington. 1. Opstellen perfusie en Specimen Holder <ol><li> Bereid oplossing retina perfusie verse op de dag van het experiment. Gebruik gedestilleerd en gedemineraliseerd water. Gebruik een van de volgende drie oplossingen. <ol><li> Bereid bicarbonaat bevattende Ames &#39;oplossing (1 L): 1 fles van Ames&#39; media en 1,9 g NaHCO3, </li><li> Bereid Locke&#39;s oplossing (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCI, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinaat, 0,5 Na-glutamaat, 0,02 EDTA en 10,0 glucose, 0,1% MEM vitamines en amino zuren </li><li> Bereid HEPES-gebufferde Ringer-oplossing (in mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, 2,0 MgCl2, 1,0 CaCl2, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHbijgesteld tot 7,5 met ~ 5,8 ml van 1 M NaOH, voeg 0,72 g / l cultuurmedium Leibovitz L-15. Gebruik 20-50 uM DL-AP4 en 50-100 uM BaCl2 de fotoreceptor respons met elke perfusie media te isoleren. </li></ol></li><li> Pesticide voor elektroden 28 (in mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA en pas pH op 7,4-7,5 met NaOH. Elektrode oplossing kan worden bewaard bij kamertemperatuur voor enkele maanden. </li><li> Bereiden en testen van het monster houder. <ol><li> Lijm zwart / grijs filter papier op de top van de koepels van het monster houder onderste deel (zie figuur 1A). Spread tweecomponenten 5 minuten epoxylijm voorzichtig rond de randen van de vlakke toppen van de koepels. Indien nodig, doe het onder de dissectie microscoop. </li><li> Wacht tot de lijm bijna droog is (ongeveer 4 min) en druk op de filter papier op de koepels met behulp van een plat voorwerp. Glue filtreerpapier ten minste één dag voor het experiment. Depapieren filter kan meerdere malen worden gebruikt, maar worden vervangen na een maand opnames. Gebruik 70% ethanol aan koepels zorgvuldig reinigen van alle lijmresten voor het installeren van de vervanging van papier. </li><li> Vul de elektrode kanalen met elektrode oplossing proberen om eventuele luchtbellen te vermijden en schroef pellet elektroden omsloten met een schroefdraad adapter in de elektrode kanalen (zie figuren 1A en B). Sluit de bovenste en onderste stukken van de monsterhouder met vier schroeven en vul de perfusielijnen met electrode oplossing. </li><li> Meet de weerstand en de spanning tussen de geleiders van elk paar elektroden met een multimeter (Figuur 1B). Weerstand moet onder 100 Ωk en de spanning onder de 10 mV als de kanalen zijn bubble-vrij en de elektroden in goede omstandigheden. </li></ol></li><li> Giet 400-700 ml perfusie media in de glazen fles. Onafhankelijk andere 300 ml voor gebruik bij de ontleding van het netvlies en sscheurde het in een koelkast. Stel de perfusie buizen in de warmtewisselaar blok en plaats de voorverwarmde blok op de verwarmingsplaat (zie figuur 1D). </li><li> Sluit de fles met een dop die connecties heeft tot CO 2 / O 2 gas (indien Ames &#39;of Locke&#39;s wordt gebruikt) en perfusie buis (zie figuur 1D). Verwarm de fles met de media tot 37 ° C en het op de verwarmingsplaat of bovenop de lichtstimulatiebron eenheid waterbad op 37-39 ° C 17. <ol><li> Prime de perfusie lijnen door ze te vullen met perfusie media om de zwaartekracht gedreven stroom starten. <ol><li> In LKC systeem Plaats de fles op de top van de stimulator unit 17 significante zwaartekracht stroming die vervolgens wordt aangepast door flow-rate regelaars zonder te worden beïnvloed door het verlagen niveau van de perfusievloeistof in de fles gedurende het experiment geven. </li><li> In Ocuscience systeem, plaats de perfusion fles binnen de kooi van Faraday om ruis lange perfusie output lijnen van het monster houder te minimaliseren en plaats (zie stap 2.8) ver onder het niveau van het monster houder (en perfusie fles) om zwaartekracht aandrijving van de oplossing te verhogen. Shield deze output lijnen en sluit de afscherming aan de grond van de versterker om de koppeling van de elektromagnetische ruis naar de ERG signaal te voorkomen. </li></ol></li></ol></li><li> Stel de perfusie tot 3-5 ml / min met behulp van debiet toezichthouders. Sluit 5% CO 2/95% O 2 gas uit een cilinder met de juiste regulator en stel het debiet gestage borrelen van de media in de fles te verzekeren door middel van een lucht steen. </li></ol> 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Monteer schoon en scherpe dissectie instrumenten, waaronder rechte bladen microscissors, één of twee 45 o pincet, scheermesje en een rechthoekig stuk filterpapier. </li><li> Giet ongeveer 200 ml koud Japanse productesie oplossing in een grote petrischaal zodat het gehele onderste gedeelte van de monsterhouder (inclusief domes) worden ondergedompeld in de oplossing. Deze stap wordt belangrijk bij de montage van de netvliezen van de koepels (zie stap 2.6). Hoewel sommige oplossingen zijn ontworpen met carbogeen (5% CO2 / 95% O2) verzadigd, is dit niet essentieel voor de dissectie doeleinden en is niet uitgevoerd in de hier beschreven experimenten. </li><li> Voor een typisch experiment, houden van dieren in 12/12 uur donker / licht en donker-cyclus aanpassen hen voor 6-12 uur voor de opnames. Euthanaseren van de dieren door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie onder gedimd rood licht en alles doen wat de volgende procedures onder gedimd rood of IR-licht (gebruik bijvoorbeeld, rood filter in de voorkant van de microscoop lichtbron). <ol><li> Trek de ogen uit met behulp van een pincet en leg ze in de media. Plaats één oog in een tijd op een klein stukje papier (bijvoorbeeld sommige reguliere filter papier) en zolit benadering om het niveau van ora serrata terwijl het oog met een pincet (dit is buiten de oplossing klaar here). </li></ol></li><li> Snijd langs de ora serrata (of dichter bij de evenaar van het oog) met microscissors en verwijder het hoornvlies en de lens. Plaats het oog beker in de koude media in de grote petrischaal en herhaal dezelfde procedure met het andere oog. </li><li> Snijd een kleine incisie van de bovenkant van de oogschelp naar de oogzenuw door hem de schaar tussen de retina en sclera om de retina zo intact mogelijk. Pak de sclera aan beide zijden van de incisie door twee pincet en trek de pincet uit elkaar aan het netvlies los. <ol><li> Snijd de oogzenuw en probeer de retina te isoleren met een minimum hoeveelheid fysiek contact met het distale oppervlak. RPE wordt meestal automatisch los van het netvlies tijdens de dissectie proces. Het is belangrijker om mechanische verstoringen van de retina dan het voeren voorkomenontleding snel, meestal netvliezen worden ten minste 30 min in de oplossing geïncubeerd zonder aanzienlijk responseigenschappen. </li></ol></li><li> Monteer de netvliezen van de koepels van het monster houder (figuur 1C). Dompel het onderste gedeelte van de monsterhouder in de petrischaal met ontleed netvliezen. Schuif het netvlies, fotoreceptor kant (het convexe oppervlak van de geïsoleerde retina) omhoog, boven de koepel en til het monster houder, zodat het netvlies hecht op het filter papier. Herhaal de procedure voor de andere netvlies. </li><li> Droog de houder plaat zorgvuldig om elektrische overspraak tussen de netvliezen evenals ruis en signaal rangeren voorkomen. Specimen houder O-ringen rond het bodemdeel koepels aan oplossing lekkage tussen de onderste en bovenste delen van de houder te voorkomen, alsmede de elektrische isolatie van de fotoreceptor en ganglioncellen zijden van de afzonderlijke netvliezen helpen. Bevestig het bovenste deel van de houder met de vier schroeven (zie Figuur 1B) en vul de perfusie kanalen met perfusievloeistof via een spuit en een naald. </li><li> Transfer het monster houder naast de warmtewisselaar blok en sluit de input en output perfusie lijnen naar het monster houder (figuur 1D). Sluit de elektroden aan de ERG versterker (bovenste elektroden aan te sluiten op de grond / minus pin in de versterker) en bevestig de stimulator / control unit op het monster houder met behulp van een adapter of schuif de verwarming pad in de stimulator unit afhankelijk van welke in vivo ERG kan worden gebruikt. </li></ol> 3. Opnamen <ol><li> De versterker en de stimulus-instellingen te configureren met behulp van de software van de in vivo systeem. Stel de verwerving frequentie op een waarde tussen 1 en 10 kHz en laagdoorlaatfilter met 300 Hz. Heeft high-pass filter niet gebruiken. Gebruik 60 Hz (of 50 Hz in Europa) notch filter indien nodig. </li><li> Record basislijn zonder licht stimulatie en with dim stimulatie (bijv., groen licht van -35 dB of 0,3 mCd sm -2) om te testen op een goede elektrische verbinding tussen de elektroden en retina monster. Wacht 10-20 minuten voor het verzamelen van gegevens te beginnen, zodat het netvlies temperatuur en functie te bereiken van een stabiele toestand. <ol><li> Kies Stimulusparameters volgens een specifieke experiment en beginnen met het verzamelen van gegevens. Bijvoorbeeld, gebruiken groene licht van -40 tot 0 dB of van 0,1 tot 1.000 mCd sm -2 voor een scotopische reactie familie. Gebruik ongeveer 2 tot 3 log-eenheden helderder knippert in fotopische opnames waar de staven moeten worden onderdrukt door achtergrondlicht (3-30 Cdm -2) of een sonde flitser (ongeveer 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, zie figuur 3). </li><li> Vergeet echter niet dat de exacte lichtintensiteit waarden enigszins afhankelijk van uw systeem kalibratie en experimentele omstandigheden zou kunnen zijn. Als vuistregel schaal intensiteiten door 5-10-voudig in vergelijking met in vivo </em&gt; opnames bij gebruik van groene licht 17. Een zwarte deksel met openingen boven de retina (in het commerciële adapter) zijn gebruikt om lichtverstrooiing te verminderen in de monsterhouder en homogeen en gelijke stimulatie van beide netvliezen vergemakkelijken door de Ganzfeld gebied van de commerciële in vivo systemen. OPMERKING: Bij opnames van donker aangepaste netvlies, de intensiteiten van de test flitsen in een typisch experiment bleek slechts een verwaarloosbaar deel van het pigment, zodat het ontbreken van RPE aangedreven regeneratie niet een probleem. Bovendien, het is eerder aangetoond dat kegel pigment regeneratie nog steeds kan plaatsvinden in de geïsoleerde netvlies via de Müller cel visuele cyclus 20. </li></ol></li><li> Zoals proeven duren typisch 30 minuten tot enkele uren, bewaken basislijnafwijking, geluidsniveau en stabiliteit reactie tijdens het experiment veranderingen in deze technische problemen kunnen wijzen. OPMERKING: Verhoogde ruis of afnamed respons amplitudes kunnen luchtbellen in de perfusie of elektrode kanalen, te lage of hoge temperaturen, oplossing lekken / morsen of verplaatsing van het netvlies vermelden. </li></ol> 4. Reiniging <ol><li> Maak het monster houder van de perfusie lijnen, open het en spoel de netvliezen van de filter papier. Verwijder de elektroden en spoel ze met gedistilleerd water (niet gebruiken ethanol). Reinig het monster houder (met inbegrip van de perfusie kanalen) met ethanol en / of gedestilleerd water. Flush perfusieslang zorgvuldig met&gt; 70% ethanol. </li><li> Spoel de perfusie fles met gedistilleerd water (geen schoonmaakmiddelen gebruiken). Ethanol kan ook worden gebruikt om de fles te reinigen. </li></ol>

<ol><li>Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).</li>
<li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).</li>
<li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li>
<li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li>
<li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li>
<li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina%3A+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li>
<li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium%3A+origin+of+the+electroretinogram+c-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li>
<li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bovine+arterially-perfused+eye%3A+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP%2C+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+%28Rana+temporaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li>
<li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li>
<li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+adaptation+in+toad+rods%3A+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li>
<li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li>
<li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
<li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li>
<li>Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+%28glial%29+cells+in+the+toad+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li>
<li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration%3A+retinal+tissue+as+a+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li>
<li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse%3A+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li>
<li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+protocols+alter+phototransduction%3A+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li>
<li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors%3A+adaptation%2C+noise%2C+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li>
<li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina%3A+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li>
<li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li>
<li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li>
</ol>

Washington University in St. Louis heeft een licentieovereenkomst met Xenotec, Inc. en kan een royalty van de verkoop van de ex vivo adapter ontvangen.

<html> We tonen hier de kritische stappen voor het verkrijgen van hoge kwaliteit ex vivo ERG opnames tegelijkertijd van twee geïsoleerde muis netvliezen met behulp van in vivo ERG systeemcomponenten samen met een ex vivo ERG adapter. In deze studie perfusie we zowel netvliezen van het dier met dezelfde oplossing (ofwel Ames, Locke&#39;s of Ringer), maar het is ook mogelijk om elke retina perfuseren met een andere oplossing bijvoorbeeld voor dopingcontroledoeleinden. De belangrijkste st...

Elektroretinogram (ERG) is een gevestigde techniek die kan worden gebruikt om de elektrische activiteit van het netvlies veroorzaakt door licht te nemen. De ERG signaal ontstaat vooral bij spanningsveranderingen veroorzaakt door radiale stroming (langs de as van fotoreceptoren en bipolaire cellen) stroomt in de resistieve extracellulaire ruimte van de retina. De eerste ERG signaal werd in 1865 opgenomen door Holmgren van het oppervlak van een fish eye 1. Einthoven Jolly 1908 en 2 verdeelden de ERG reactie op het ontstaan ​​van licht in drie verschillende golven, a- genoemd, b- en c-golven, die nu bekend zijn voornamelijk de activiteit van fotoreceptoren geven, ON bipolaire cellen en pigmentepitheel cellen, respectievelijk 3-8. ERG kunnen worden opgenomen van de ogen van verdoofde dieren of mensen (in vivo), van geïsoleerde oogwater 9, over geïsoleerde intacte retina (ex vivo) 3,10-15 of over specifieke retina lagen met micro-elektroden (plaatselijkeERG) 4,16. Daarvan in vivo ERG is momenteel de meest gebruikte methode om retinale functie bepalen. Het is een niet-invasieve techniek die kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden of voor de progressie van retinale ziekten bij dieren of patiënten te volgen. In vivo ERG opnames produceren complexe signaal met meer overlappende componenten, vaak besmet met oculaire fysiologische ruis (bijvoorbeeld ademhaling en hartactiviteit). Plaatselijke ERG kan worden gebruikt om het signaal over specifieke lagen van het netvlies te nemen, maar het is het meest ingrijpende en heeft de laagste signaal-ruisverhouding (SNR) in vergelijking met de andere ERG opname configuraties. Lokale ERG is ook technisch veeleisend en vereist dure apparatuur (bijvoorbeeld, microscoop en micromanipulators). Transretinal ERG van de intacte, geïsoleerde netvlies (ex vivo ERG) biedt een compromis tussen in vivo en lokale ERG methodes waardoor stabiele en high SNR opnames uit intacte netvliezen van dieren of mensen 17. Recent is deze werkwijze met succes gebruikt om staafjes en kegeltjes fotoreceptor functie bij zoogdieren, primaten en menselijke retina 18-20 bestuderen. Bovendien door het ontbreken van pigment epitheel bij de ex vivo netvlies, de positieve c-golfcomponent van de ERG signaal is verwijderd en een prominente negatieve langzame PIII component wordt geopenbaard in het ex vivo opnames. De trage PIII component is aangetoond afkomstig uit de activiteiten van Müller glia cellen in de retina 21-23. Aldus kan ex vivo ERG methode ook worden gebruikt om Müller cellen te bestuderen in het intacte retina. Verscheidene studies hebben ook aangetoond dat ex vivo ERG opnames kunnen worden gebruikt om de concentratie van farmacologische middelen meten rond de retina 24 en test de veiligheid en de werkzaamheid van geneesmiddelen 25-27. Meerdere commerciële in vivo systemen zijn beschikbaar enin vele laboratoria, die niet noodzakelijkerwijs uitgebreide elektrofysiologie achtergrond. Daarentegen zijn ex vivo apparaten beschikbaar tot voor kort 17 en daardoor slechts zeer weinig laboratoria momenteel maken van deze krachtige techniek. Het zou gunstig zijn voor ex vivo ERG opnamen beschikbaar om meer laboratoria maken om onze kennis over het netvlies fysiologie en pathologie te bevorderen, en om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor verblindende ziekten. We tonen hier een eenvoudige en betaalbare ex vivo ERG apparaat 17 en hoe het kan worden gebruikt in combinatie met diverse commercieel verkrijgbaar in vivo ERG systemen staaf- en-cone-gemedieerde signalering opnemen (a- en b-golven) en de functie van Müller cellen (langzaam PIII) uit intacte wild-type muis netvliezen.

<table><tbody><tr><td>In vivo ERG system</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo ERG system</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex vivo adapter</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp;idCategory=27">Kan eventueel elk merk gebruiken</a></td></tr><tr><td>IR emitter</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Night Vision Scopes</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Militair product.</td></tr><tr><td>Red filter</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>Kan worden gebruikt in plaats van IR-systeem</td></tr><tr><td>Red head light</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont tweezers #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kan eventueel elk merk gebruiken</a></td></tr><tr><td>pH meter and electrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kan eventueel elk merk gebruiken</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kan eventueel elk merk gebruiken</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1,0 M oplossing</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1,0 M oplossing</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>Succinic acid disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>Leibovitz culture medium L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Kan eventueel elk merk gebruiken</td></tr><tr><td>MEM vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

simultaan<em&gt; ex vivo</em&gt; functioneel testen van two netvliezen door<em&gt; in vivo</em&gt; elektroretinogram system

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Een in vivo elektroretinogram (ERG) signaal bestaat uit verschillende overlappende componenten die afkomstig zijn van verschillende typen retinale cellen, evenals ruis van extra-retinale bronnen. Ex vivo ERG biedt een efficiënte methode om de functie van retinale cellen direct te onderzoeken vanuit een intact geïsoleerd netvlies van dieren of donorogen. Bovendien kan ex vivo ERG worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid van potentiële therapeutische middelen op netvliesweefsel van dieren of mensen te testen. We laten hier zien hoe commercieel beschikbare in vivo ERG-systemen kunnen worden gebruikt om ex vivo ERG-opnames uit geïsoleerde muizennetvliezen uit te voeren. We combineren de lichtstimulatie-, elektronische en verwarmingseenheden van een standaard in vivo systeem met een op maat ontworpen specimenhouder, zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem en elektromagnetische ruisbescherming om laag-ruis ex vivo ERG-signalen gelijktijdig van twee netvliezen op te nemen met de acquisitiesoftware die is opgenomen in commerciële in vivo systemen. Verder laten we zien hoe deze methode in combinatie met farmacologische behandelingen kan worden gebruikt die specifieke ERG-componenten verwijderen om de functie van bepaalde retinale celtypen te onderzoeken.

We namen flash antwoorden van donker aangepaste wild-type (WT) C57BL / 6 muis netvliezen door de testprotocollen hierboven beschreven en in figuur 1 met verschillende standaard perfusie-oplossingen (figuur 2). De respons curven en kinetiek betreffende de gevoeligheid van staaf fotoreceptoren, vergelijkbaar in Ames en Locke&#39;s media (figuur 2A en B). Anderzijds, onder HEPES-gebufferde Ringer-oplossing (zonder bicarbonaat of 5% CO2 / 95% <su...

Ex vivo ERG kan worden gebruikt om elektrische activiteit van retinale cellen rechtstreeks op te nemen van geïsoleerde intacte netvliezen van dieren of mensen. We demonstreren hier hoe gebruikelijke in vivo ERG-systemen kunnen worden aangepast voor ex vivo ERG-opnamen om de elektrische activiteit van retinale cellen te ontleden.

Simultaan<em&gt; Ex vivo</em&gt; Functioneel testen van Two netvliezen door<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van cellen uit een geïsoleerde muisretina te beoordelen met behulp van een commercieel in vivo elektroretinogram- of ERG-systeem in combinatie met een ex vivo adapter. Dit wordt bereikt door eerst de retina's uit beide ogen van een muis te dissekeren. De tweede stap is om de retina's met de zijde van de fotoreceptoren naar boven in een monsterhouder te plaatsen.Vervolgens wordt de monsterhouder op een warmteplaat in het in vivo ERG-systeem geplaatst en aangesloten op de zwaartekrachtgestuurde perfusie. De laatste stap is het aansluiten van de elektroden van de monsterhouder op een versterker en het stimuleren van de retina's met licht om ERG-responsen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt ex vivo ERG gebruikt om aan te tonen hoe door staafjes en kegeltjes gemedieerde signaleringspaden kunnen worden ontleed met behulp van farmacologie en gespecialiseerde lichtstimulatieprotocollen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals in vivo, ERG's of single-cell registraties, is dat deze een hogere signaal-ruisverhouding, langere en stabielere registraties biedt, evenals de mogelijkheid voor eenvoudige en kwantitatieve farmacologische manipulaties. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid te screenen van geneesmiddelen die zijn ontworpen voor de behandeling van retinale aandoeningen in retinae van primaten en menselijke donoren. Pas minstens één dag van tevoren het onderste gedeelte van de specimenhouder aan door zwart-grijs filterpapier op de bovenkant van de koepels te lijmen. Gebruik een twee-componenten vijf-minuten epoxy langs de randen van de koepels en gebruik indien nodig een dissectiemicroscoop. Nadat de lijm is gedroogd, wordt het filterpapier plat tegen de koepel gedrukt.Dit zal ongeveer een maand lang bruikbaar zijn voor registraties. Verwijder daarna het papier en reinig de koepel met 70% ethanol. Om de elektrode voor te bereiden, vult u eerst de elektrodekanalen met elektrodeoplossing.Probeer het introduceren van luchtbellen te voorkomen. Schroef vervolgens de pellet-elektroden in de elektrodekanalen. Verbind de boven- en onderdelen van de monsterhouder met vier schroeven en vul de perfusielijnen met elektrodensolution.Meet vervolgens de weerstand en het voltage tussen de aansluitingen van de elektrodeparen. De weerstand moet lager zijn dan 100 kilo ohm en het voltage lager dan 10 millivolt. Als de kanalen beluchttingsvrij zijn en de elektroden in goede staat verkeren, schenk dan 400 tot 700 milliliter perfusiemedium in een glazen fles voor de perfusie van het monster.Giet daarnaast 300 milliliters af voor de dissectie en bewaar dit in een koelkast. Leid vervolgens de perfusieslangen door het warmtewisselaarblok en plaats het voorverwarmde blok op de warmteplaat. Sluit de fles nu af met een dop die is voorzien van een gasinlaat en een inlaat voor de perfusieslangen.De gasinlaat moet worden verbonden met een bruissteen. Plaats de voorverwarmde fles waarin het perfusiemedium op 37 °C wordt gehouden. Ontlucht vervolgens de perfusielijnen door ze te vullen met perfusiemedium om de door zwaartekracht aangedreven stroom in een ocus science-systeem te starten.Plaats de fles in de kooi van Faraday om ruis te minimaliseren en gebruik lange perfusie-uitvoerleidingen vanaf de monsterhouder. Positioneer deze uitvoerleidingen ruim onder het niveau van de monsterhouder en de perfusiefles, scherm deze leidingen af en verbind het scherm via de kooi van Faraday met de aarde van de versterker. Om koppeling van elektromagnetische ruis aan het ERG-signaal te voorkomen, bevestigt u de temperatuursensor aan de verwarmingstafel.Pas nu met behulp van regelaars de vloeistofstroom aan naar drie tot vijf milliliters per minuut. Voeg ten slotte, indien nodig, CO₂ en O₂ toe aan de oplossing en stel de regulator zo in dat er een constante stroom bellen uit de luchtsteen komt. Begin met het schenken van ongeveer 200 milliliters koude perfusie-oplossing in een grote Petrischaal, zodat het gehele onderste deel van de specimenhouder volledig kan worden ondergedompeld.Euthanaseer een dier dat is gekweekt onder een licht-donkercyclus van 12, 12 uur en dat vervolgens zes tot 12 uur lang aan het donker is aangepast voorafgaand aan de opnames. Alle volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder zwak rood of infrarood licht. Plaats de ogen in het oogmedium na het isoleren van elk oog.Breng vervolgens één oog over naar een klein stukje filterpapier op het papier. Pak het vast met een pincet en maak er een insnijding in op ongeveer dezelfde hoogte als de aura serrata vanaf de sleuf. Snijd langs de aura serrata of ergens dichter bij de equator om het hoornvlies en de lens te verwijderen.Verwijder vervolgens het hoornvlies en de uiteinden van de lens en plaats de oogcup terug in het koude medium. Herhaal dezelfde procedure met het andere oog. Maak nu, terwijl u met een oogcup werkt, een kleine incisie vanaf de bovenkant richting de nervus opticus.Houd de schaar tussen het netvlies en de sclera, zodat het netvlies zo intact mogelijk blijft. Pak vervolgens de sclera aan beide zijden van de incisie vast met twee pincetten en trek het weefsel uit elkaar om het netvlies los te maken. Om het netvlies te isoleren, knipt u de oogzenuw door en verwijdert u het netvlies met een minimaal contact met het distale oppervlak.Monteer nu de geïsoleerde retina's op de koepels van de monsterhouder. Dompel eerst het onderste deel van de monsterhouder onder in de petrischaal met de gedissecteerde retina's. Volgende dia.Plaats de retina-fotoreceptor met de convexe zijde naar boven over de koepel. Til vervolgens voorzichtig de monsterhouder op, zodat de retina aan het filterpapier hecht. Herhaal deze procedure vervolgens voor de andere retina.Droog de houderplaat nu zorgvuldig af om crosstalk-ruis en signaalkortsluiting te voorkomen. Schroef na het drogen van de houder het bovenste gedeelte vast en vul de perfusiekanalen met perfusie-oplossing vanuit een spuit met behulp van een naald. Plaats de monsterhouder naast het warmtewisselingsblok.Sluit vervolgens de inlaat- en uitlaatlijnen van de perfusie aan. Voltooi de opstelling door de elektroden aan de ERG-versterker te koppelen en de bedieningseenheid van de stimulator aan de specimenhouder te bevestigen. Gebruik een adapter. Om grote en reproduceerbare responsen te verkrijgen, is het belangrijk om de retina's zorgvuldig te dissekeren en te monteren, en om vóór het verzamelen van gegevens een stabiele en beluchtingsvrije perfusie boven de retina's te handhaven.Wacht 10 tot 20 minuten zodat de temperatuur en functie van de retina stabiliseren. Flitsresponsen werden geregistreerd bij donkergeadapteerde wild-type C 57 black six retina's met behulp van verschillende standaard perfusie-oplossingen. De responsgolfvormen en kinetiek leken vergelijkbaar in ames-medium en in locks-medium. De gevoeligheid van staafje-fotoreceptoren was eveneens vergelijkbaar.Aan de andere kant waren de amplitudes in Heaps gebufferde Ringer-oplossing zonder bicarbonaat of carbogeen-respons significant kleiner. De stabiliteit van de BWA was in Heaps Ringer vaak ook aangetast. Het toevoegen van 40 µM APB verwijderde de positieve B-golf effectief.Dit onthulde een grote, langzame negatieve golf die is toegeschreven aan de activiteit van Müllercellen, welke werd opgeheven door de toevoeging van 100 micromol barium. Deze component onthult de fotoreceptorrespons van het ex vivo ERG-signaal. Deze methode kan worden gecombineerd met andere instrumenten zoals farmacologie en genetica om vragen te beantwoorden over de moleculaire mechanismen van retinale signalering en blindmakende ziekten in zoogdierretina's, inclusief die van de mens.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De ontwikkeling van de multifocale electroretinogram (mfERG) is een belangrijke vooruitgang in de diagnostiek en de karakterisering van retinopathie. Multifocale electroretinograms zijn een rekenkundig gemiddelde van een aanpassing van een b-golf. Software programma's kunnen ontlenen ERG uit meer dan honderd netvlies in een paar minuten per oog. Scotomen en retinale disfunctie kan worden in kaart gebracht en gekwantificeerd.

Multifocale Electroretinograms

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

This video demonstrates how to record electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) in a conscious rat. The rat, with surgically implanted electrodes, is first dark-adapted. After applying dilating drops, the animal is placed in a restrainer and positioned in a Ganzfeld bowl. The ERG and VEP signals are then recorded.

Recording of Electroretinogram and Visual Evoked Potential in a Rat

Het elektroretinogram (ERG) is een elektrisch potentiaal dat door de retina wordt gegenereerd als reactie op licht. Dit artikel beschrijft hoe de ERG kan worden gebruikt om de retinale functie te beoordelen, bij in het donker aangepaste ratten, en hoe het kan worden gebruikt om een neuroprotectieve interventie te evalueren, in dit geval afstandsischemisch preconditioning.

Met behulp van de electroretinogram om Function beoordelen in het knaagdier Retina en de beschermende effecten van Remote Limb Ischemische preconditionering

Dit protocol beschrijft gelijktijdige meting van elektroretinogram en visueel geëvokte potentialen bij geanesthetiseerde ratten.

Gelijktijdig opnemen van Electroretinografie en Visual evoked potentials in verdoofde ratten

Hier presenteren we een methode voor het opnemen van licht-opgeroepen elektrische reacties van het retinale pigment epitheel (RPE) in muizen met behulp van een techniek bekend als DC-ERGs voor het eerst beschreven door Marmorstein, Peachey, en collega's in de vroege jaren 2000.

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

Vasthouden aan internationale normen en het handhaven van retinale donkere aanpassing zijn van cruciaal belang om geldige full-field elektroretinogram reacties te verwerven in de diagnose en het beheer van erfelijke netvliesziekten. Een praktisch protocol met behulp van een draagbare donkere kamer is voorzien om full-field elektroretinogram te verkrijgen voor zuigelingen en kinderen onder sedatie of algemene anesthesie in de operatiekamer instelling.

Electroretinogram-opname voor zuigelingen en kinderen onder narcose om optimale donkere aanpassing en internationale normen te bereiken

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Modificatie van bestaande multi-elektrode array of patch clamp apparatuur maakt het ex vivo elektroretinogram breder toegankelijk. Verbeterde methoden om ex vivo lichtresponsen te registreren en te onderhouden vergemakkelijken de studie van fotoreceptor en ON-bipolaire celfunctie in het gezonde netvlies, diermodellen van oogziekten en menselijke donorvliezen.

Optimalisatie van de instellingen en voorwaarden voor ex vivo elektroretinogram om de retinafunctie in kleine en grote ogen te bestuderen

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

Leer hoe u ex vivo elektroretinografie toepast om de functie van geïsoleerde muizenretina's te onderzoeken. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van staaf- en kegelsignalering mogelijk.

Simultaan

Meer video's verkennen