Simultaan Ex vivo Functioneel testen van Two netvliezen door In vivo Elektroretinogram System
6 mei 2015
Ex vivo ERG kan worden gebruikt om elektrische activiteit van retinale cellen rechtstreeks op te nemen van geïsoleerde intacte netvliezen van dieren of mensen. We demonstreren hier hoe gebruikelijke in vivo ERG-systemen kunnen worden aangepast voor ex vivo ERG-opnamen om de elektrische activiteit van retinale cellen te ontleden.
Het algemene doel van deze procedure is om de functie van cellen van een geïsoleerde muizenretina te beoordelen met behulp van een commercieel in vivo, elektroretinogram of ERG-systeem samen met een ex vivo adapter. Dit wordt bereikt door eerst de netvliezen uit beide ogen van een muis te dissekeren. De tweede stap is om de netvliezen met de fotoreceptorzijde omhoog in een specimenhouder te monteren.
Vervolgens wordt de specimenhouder op een verwarmingsplaat in het in vivo ERG-systeem geplaatst en aangesloten op de door zwaartekracht gecontroleerde perfusie. De laatste stap is om de elektroden van de specimenhouder aan te sluiten op een versterker en de netvliezen met licht te stimuleren om ERG-responsen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt ex vivo ERG gebruikt om te laten zien hoe staaf- en kegelgemedieerde signaalroutes kunnen worden ontleed met behulp van farmacologie en gespecialiseerde lichtstimulatieprotocollen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals in vivo ERG's of enkele celopnames, is dat het een hoger signaal-ruisverhouding geeft, langere en stabielere opnames, evenals de mogelijkheid voor eenvoudige en kwantitatieve farmacologische manipulaties. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen die zijn ontworpen om retinale aandoeningen te behandelen, te screenen in primaten en menselijke donorretina's. Ten minste een dag van tevoren, wijzig de onderkant van de specimenhouder door wat zwartgrijs filterpapier op de bovenkant van de koepels te lijmen. Gebruik tweecomponenten vijf minuten epoxy langs de randen van de koepels, en indien nodig, gebruik een dissectiemicroscoop. Nadat de lijm is opgedroogd, drukt u het filterpapier plat op de koepel.
Het zal goed zijn voor ongeveer een maand opnemen. Verwijder vervolgens het papier en reinig de koepel met 70% ethanol. Bereid nu eerst de elektrode voor, vul de elektrodekkanalen met elektrodenoplossing.
Probeer luchtbellen te voorkomen. Schroef vervolgens pelletelektroden in de elektrodekkanalen. Verbind de bovenste en onderste delen van de specimenhouder met vier schroeven en vul de perfusielijnen met elektrodenoplossing.
Meet vervolgens de weerstand en spanning tussen de leidingen van de elektrodenparen. De weerstand moet onder de 100 kilo ohm en de spanning onder de 10 millivolt liggen. Als de kanalen vrij zijn van bellen en de elektroden in goede staat zijn, giet u nu 400 tot 700 milliliter perfusiemedia in een glazen fles voor de steekproefperfusie.
Giet ook 300 milliliter uit voor de dissectie en bewaar deze in een koelkast. Leg vervolgens de perfusieslang door de warmtewisselaarblok en plaats het voorverwarmde blok op de verwarmingsplaat. Sluit nu de fles af met een dop die een gasinlaat en een perfusieslanginlaat heeft.
De gasinlaat moet aan een luchtsteen worden bevestigd. Plaats de voorverwarmde fles waar de perfusiemedia op 37 graden Celsius wordt gehouden. Prime vervolgens de perfusielijnen door ze te vullen met perfusiemedia om de door de zwaartekracht aangedreven stroom in een ocus science systeem te starten.
Plaats de fles in de Faraday-kooi om ruis te minimaliseren en gebruik lange perfusie-uitgangslijnen van de specimenhouder. Positioneer deze goed onder het niveau van de specimenhouder en bescherm deze uitgangslijnen en verbind de afscherming met de aarding van de versterker via de Faraday-kooi. Om koppeling van het elektromagnetische ruis naar het ERG-signaal te voorkomen, bevestigt u de temperatuursonde aan de verwarmingsfase.
Pas nu met behulp van regelaars de oplossingsstroom aan op drie tot vijf milliliter per minuut. Ten slotte, indien nodig, introduceer auto en gas in de oplossing en pas de regelaar aan voor een gelijkmatige stroom bubbels van de luchtsteen. Begin met het uitgieten van ongeveer 200 milliliter koude perfusieoplossing in een grote petrischaal, zodat het hele onderste deel van de specimenhouder volledig kan worden ondergedompeld.
Verdoof een dier dat is grootgebracht onder een 12, 12 uur donker lichtcyclus en vervolgens donker aangepast gedurende zes tot 12 uur vóór de opnames. Alle volgende procedures moeten worden uitgevoerd onder zwak rood of infrarood licht. Plaats ze na het isoleren van elk oog in het oogmedium.
Breng vervolgens een oog over naar een klein stukje filterpapier op het papier. Grijp het met pincetten en snijd er een snede in op ongeveer hetzelfde niveau als de aura serrata van de snede. Snijd langs de aura serrata of ergens dichter bij de evenaar om het hoornvlies en de lens te verwijderen.
Verwijder vervolgens het hoornvlies en de lenseinden en breng de oogcup terug naar het koude medium. Herhaal deze procedure met het andere oog. Werk nu met een oogcup, maak een kleine incisie vanaf de bovenkant richting de oogzenuw.
Houd de schaar tussen de netvlies en sclera zodat het netvlies zo intact mogelijk blijft. Grijp vervolgens de sclera aan beide zijden van de incisie met twee pincetten en trek het weefsel uit elkaar om het netvlies los te maken. Om het netvlies te isoleren, snijd de oogzenuw door en verwijder het netvlies met een minimale hoeveelheid contact met het distale oppervlak.
Monteer nu de geïsoleerde netvliezen op de koepels van de specimenhouder. Dompel eerst het onderste deel van de specimenhouder in de petrischaal met de gedissekteerde netvliezen. Volgende slide.
De netvliesfotoreceptor of bolle kant omhoog over de koepel. Til vervolgens voorzichtig de specimenhouder op zodat het netvlies aan het filterpapier hecht. Herhaal vervolgens de procedure voor het andere netvlies.
Droog nu de houderplaat voorzichtig om crosstalk-ruis en signaaldoorvoer te voorkomen. Nadat de houder is gedroogd, schroef het bovenste deel vast en vul de perfusiekanalen met perfusieoplossing uit een spuit met behulp van een naald. Plaats de specimenhouder naast het warmtewisselaarblok.
Verbind vervolgens de ingangs- en uitgangsperfusielijnen. Voltooi de installatie door de elektroden aan te sluiten op de ERG-versterker en de stimul
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert het gebruik van ex vivo elektroretinogram (ERG) om elektrische activiteit van geïsoleerde muisretina's te registreren. De methodologie maakt het mogelijk om de signaleringspaden van staafjes en kegeltjes te ontleden via farmacologische technieken en lichtstimulatie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Retinale biologie
Achtergrond
- Electroretinografie (ERG) is een techniek die wordt gebruikt om de elektrische responsen van verschillende celtypen in het netvlies te meten.
- Ex vivo ERG maakt gedetailleerde analyse van de functie van netvliescellen buiten het levende organisme mogelijk.
- Deze methode kan inzicht verschaffen in de mechanismen van het gezichtsvermogen en netvliesziekten.
- De aanpassing van in vivo ERG-systemen voor ex vivo gebruik vergroot de experimentele flexibiliteit.
Doel van de studie
- Om de functie van retinale cellen uit geïsoleerde muisretina's te beoordelen.
- Om de aanpassing van in vivo ERG-systemen voor ex vivo registraties aan te tonen.
- Om signaleringspaden die door staafjes en kegeltjes worden gemedieerd te ontleden.
Gebruikte methoden
- Isolatie van retinae uit muizenoogen.
- Montage van retinae in een monsterhouder voor stimulatie.
- Aansluiting op een warmteplaat en een zwaartekrachtgestuurd perfusiesysteem.
- Aansluiting van elektroden op een versterker voor lichtstimulatie en responsregistratie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van ERG-responsen van geïsoleerde retina's.
- Demonstratie van farmacologische dissectie van signaleringspaden.
- Validatie van de ex vivo ERG-methode voor het bestuderen van de retinalecelfunctie.
- Inzichten in door staafjes en kegeltjes gemedieerde signaleringsmechanismen.
Conclusies
- Ex vivo ERG is een waardevol instrument voor het bestuderen van de retinale fysiologie.
- De methode maakt een gedetailleerde analyse van cellulaire responsen op stimuli mogelijk.
- De aanpassing van in vivo systemen voor ex vivo gebruik breidt de onderzoeksmogelijkheden uit.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Gelijktijdige ex vivo functionele tests van twee retina's met gebruik van een in vivo ERG-systeem maken een high-throughput, kwantitatieve beoordeling van de retinaalcelfunctie en farmacologische respons mogelijk. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen in de vroege fase van de ontdekking van oftalmologische geneesmiddelen door een directe evaluatie van de werkzaamheid en veiligheid van verbindingen op intact retinaal weefsel mogelijk te maken. De methode ondersteunt mechanische risicoreductie en portfolio-triage voor therapieën die gericht zijn op retinaale aandoeningen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe bevraging van de signaleringspaden van staafjes en kegeltjes in intact retinaal weefsel mogelijk.
- Faciliteert functionele validatie van targets via farmacologische dissectie van ERG-componenten.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door specifieke celtype-responsen op kandidaatverbindingen te isoleren.
- Levert kwantitatieve gegevens voor voorspellend vertrouwen in target-engagement.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde ex vivo retina-systemen voor voor workflows voor compoundscreening.
- Levert reproduceerbare ERG-outputs met een hoge signaal-ruisverhouding voor assay-standaardisatie.
- Maakt parallel testen van twee retina's mogelijk, wat de doorvoer en datarobuustheid verhoogt.
- Ondersteunt betrouwbare evaluatie van drugseffectiviteit en veiligheid in ziekterelateerd weefsel.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische testen uit met de relevantie voor menselijke ziekten door het gebruik van donorretina's mogelijk te maken.
- Handhaaft continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie met kwantitatieve functionele read-outs.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van de directe weefselrespons.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers via ERG-golfvormanalyse.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische validatie door een schaalbaar, kwantitatief platform te bieden voor functionele tests van retinaal weefsel. Het is integreerbaar in workflows, van targetvalidatie tot leadidentificatie en preklinische beoordeling van de werkzaamheid.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways via farmacologische manipulatie en lichtstimulatieprotocollen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve ERG-outputs die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen en assay-ontwikkeling.
- Analytics: Biedt meetbare ERG-golfvormen en componentisolatie voor comparatieve analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Maakt afstemming met menselijke ziektemodellen mogelijk door gebruik te maken van donorretina's wanneer deze beschikbaar zijn.
- Enterprise Reuse: Benut commerciële in vivo ERG-systemen voor ex vivo toepassingen, waardoor het nut van de infrastructuur wordt gemaximaliseerd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de ontdekking van retinale geneesmiddelen.
- Operationele waarde: Standardiseert functionele testen met schaalbare, reproduceerbare protocollen en een doorvoer van dubbele monsters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door vroege functionele risicoreductie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van oftalmologische kandidaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in retinadissectie, elektrofysiologie en farmacologische manipulatie.
- Vereist een commercieel in vivo ERG-systeem met op maat gemaakte monsterhouders en een perfusie-opstelling.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan diverse diermodellen en menselijk donormateriaal mits het protocol wordt geoptimaliseerd.
- De signaalkwaliteit is afhankelijk van de perfusiestabiliteit, ruisafscherming en de behandeling van het weefsel.
