Name: Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Ontdek de detectie van het malaria-biomarker Histidine Rich Protein-II met een fosforescerende iridium(III)-probe. Deze methode biedt robuuste luminescentiesignalen voor snelle en betrouwbare diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun voor dit werk werd verleend door de Bill en Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Ontwikkel technologieën die evaluatie van meerdere aandoeningen en pathogenen op het punt-van-zorg mogelijk maken. K.M.D. werd ondersteund door een NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. Synthese van iridium (III) Complex <ol><li> Weeg 53,6 mg (50 umol) [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 en oplossen in 5 ml methyleenchloride. Voeg deze oplossing toe aan een 50 ml Erlenmeyer kolf uitgerust met een roerstaaf. </li><li> Weeg 26,2 mg (100 umol) van AgOTf en los op in 5 ml methanol. </li><li> Voeg de opgeloste AgOTf de [Ir (ppy) 2 Cl] 2-oplossing toe en roer gedurende 1 uur. Opmerking: Een crèmekleurige slurry moeten leiden. </li><li> Na 1 uur, filtreer de suspensie door silicagel in een 25 x 95 mm dram flesje en verdampen resterende oplosmiddel met een rotatieverdamper (5-10 min). </li><li> Nadat het meeste oplosmiddel verwijderd, controleert een olieachtig geel residu blijft in de flacon. Aan dit residu, voeg 1 ml methanol opnieuw oplossen van het product en lyofiliseren 1-2 dagen om de gele vaste stof werd verkregen. </li><li> Karakteriseren Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + product (IR1) van H &lt;sup&gt; 1 NMR (in CDCl3), ESI en UV-Vis zoals eerder beschreven. 23 </li></ol> 2. Interacties van IR1 met verschillende Aminozuren <ol><li> Bereid een 2 mM oplossing van IR1 in methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex tot volledige oplossing van de vaste stof te verzekeren. </li><li> Bereid 100 pM oplossing van de volgende aminozuren en biomoleculen in HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Pipetteer 100 ul van elk aminozuur in een zwarte 96-putjesplaat. Voeg 100 ul van HBS aan de plaat om te dienen als blanco. </li><li> Voeg 2,5 gl van 2 mM IR1 oplossing aan elk monster en schud de plaat op een plaat schudder gedurende 10 min. </li><li> Na 10 min, het verwerven van de emissiespectra van de monsters onder toepassing van een 96 putjes plaatlezer (ex 365 / em 400-700). <ol><li> Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment. </li><li> Stel de nieuwe experiment een fluorescentiescan gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en een spleetbreedte van 9 nm met de optiek in de bovenste positie. </li><li> Lees de emissie 300-700 nm met een stapgrootte van 5 nm. </li><li> De gegevens voor data-analyse te exporteren. </li></ol></li><li> Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld de emissie met een UV transilluminator. </li></ol> 3. Titratie van IR1 met BNT-II <ol><li> Bereid een 1 mM voorraadoplossing van BNT-II (MW 8.233,6 g / mol) in HBS en een 2 mM oplossing van IR1 in methanol. </li><li> Uit de voorraad oplossing, voor te bereiden 1 ml van 100 uM BNT-II in HBS. Vortex de microcentrifugebuis om ervoor te zorgen het monster is gemengd. </li><li> Serieel verdunnen 100 pM BNT-II met de helft in HBS tot een eindconcentratie van 1,56 uM BNT-II. </li><li> Voeg 100 ul van elke verdunning in drievoud met HBS dienen als blanco, aan de putjes van een 96 putjesplaat. Voor elk monster, voeg 2,5 pl 2 mM IR1. </li><li> Shake de plaat gedurende 10 minuten op een bord shaker. </li><li> Na schudden lees de emissie-intensiteit bij 510 nm (excitatie bij 365 nm) onder toepassing van een 96-well plaatlezer. <ol><li> Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment. </li><li> Stel het nieuwe experiment een fluorescentie eindpunt gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en emissiegolflengte van 510 nm. Stel de sleufbreedte beide golflengten 9nm, met de optiek in de bovenste positie. </li><li> Lees de plaat en de gegevens te exporteren voor analyse. </li></ol></li><li> Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld titratie met een UV transilluminator. </li></ol> 4. Real-time kinetische analyse van de IR1 / BNT-II systeem met behulp van Biolayer Interferometry <ol><li> Voeg 200 ul kinetische buffer (KB, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,02% Tween-20) met 8 putjes in de eerste kolom van een zwarte 96-putjesplaat en plaats de plaat in de plastic sensorhouder. Zorgvuldig overdragen 8 Ni (II) NTA biosensoren naar de eerste kolom in de kunststof houder zodanig dat de uiteinden opgehangen in de putjes van buffer. Plaats de plastic houder aan de linkerkant van de interferometrie instrument. </li><li> Bereid een 2 ml van een 0,5 uM oplossing van BNT-II KB. </li><li> Bereid 500 pi van een 10 pM oplossing van IR1 in KB, en serieel verdund met de helft omlaag naar 0,156 uM in KB. </li><li> Een nieuwe zwarte 96 puts plaat, een pipet 200 pi KB alle 8 wells in kolom A en C. </li><li> In dezelfde plaat Pipetteer 200 ul van 0,5 uM BNT-II-oplossing aan de putjes in kolom B. </li><li> Pipetteer 200 ul van elke verdunning van IR1 in kolom D, te beginnen met KB als blanco in een goed D1. Voeg de verdunningen, zodat de putten toenemen IR1 concentratie door de kolom. </li><li> Plaats deze plaat het instrument aan de rechterkant van de plaat met de vooraf bevochtiging sensors. </li><li> In de biolayer interferometrie software, het opzetten van een basis Kinetic experiment door het definiëren van de plaat, test, en de sensor tips. <ol><li> Om de plaat te definiëren, selecteert u een kolom op het scherm, klik met de rechtermuisknop en kies de juiste definitie van de putten. Selecteer &quot;Buffer&quot; voor de kolommen A en C, &quot;Load&quot; voor kolom B, en &quot;Monster&quot; voor kolom D. </li><li> Definieer de test in het volgende tabblad door toevoeging van de volgende stappen (Klik op &quot;Add&quot;): Evenwicht (Custom), 60 sec; Laden, 120 sec; Baseline, 60 sec; Association, 120 sec; en dissociatie, 300 sec. Selecteer de Equilibration stap en dubbelklik op kolom A. Repeat voor Laden (kolom B), Baseline (kolom C), Vereniging (kolom D) en dissociatie (kolom C). Selecteer de Ni (II) NTA sensors. </li><li> Ga naar het volgende tabblad en bevestigen dat de sensoren in kolom A van de houder plastic sensor. </li><li> Bevestig het experiment correct is geschetst, plaatst u een bestandsnaam, ervoor te zorgen dat &quot;vertraging experiment &#39;is aangevinkt, en druk op&quot; Go &quot;. Noot: Door de geautomatiseerde aard van het instrument, nadat de kinetische experiment wordt beschreven, de stappen plaatsvinden zoals geprogrammeerd. </li></ol></li><li> Zodra de kinetische run voltooid is, verwerkt de gegevens in het ontvangen verwerkingssoftware. <ol><li> Dubbelklik op de map met de bestandsnaam van belang in het onderste gedeelte van het paneel aan de linkerkant. Vervolgens dubbelklikt u op de bijbehorende map onder &quot;Kinetics&quot; in het bovenste gedeelte van het paneel. Ga naar het tabblad Processing. </li><li> Vink het vakje Aftrekken aan de linkerkant om de sensor selectie scherm te openen. Klik met de rechtermuisknop op zowel A4 en verander het goed op Reference Well. </li><li> Vink het vakje naast de Y-as uitlijnen, en zorgen voor de geselecteerde stap is Baseline. Geef de tijd bereik te zijn van de laatste vijf seconden van de basislijn (ongeveer 55-60 sec). </li><li> Vink het vakje voor Inter-stap Correction en selecteer Align dissociatie. Zorg ervoor dat de doos Savitzky-Golay Filtering wordt gecontroleerd en druk op de &quot;Process data! ̶1; </li><li> Ga naar het tabblad Analyse. Zorg dat &quot;Association en dissociatie&quot; is de selectie stappen te analyseren en dat het model 1: 1. Selecteer een lokale, Full fit en druk op &quot;Fit Curves!&quot; </li><li> Markeer alle bochten in de tabel en klik met de rechtermuisknop om alle bochten ingesteld op één kleur. Vervolgens selecteert u een Global (Full) fit, gegroepeerd op kleur en Rmax Unlinked door Sensor. Druk op &quot;Fit Curves!&quot; Aan de mondiale kinetiek gegevens te verkrijgen. </li></ol></li></ol> 5. On-kraal Detectie van BNT-II en rcHRP-II met IR1 <ol><li> Bereid 1 ml van een 1 uM oplossing van BNT-II en rcHRP-II in HBS met Tween (HBST, HBS met 0,025% Tween 20). </li><li> In serie verdunde elk eiwit met de helft in HBST tot een eindconcentratie van 15,6 nM. </li><li> Pipetteer 100 ul van elke verdunning in drievoud in een witte 96-wells plaat met verdunningen in de volgorde van de laagste naar de hoogste concentratie in een kolom. </li><li> Pipetteer 10 ul van 50 um Ni (II) NTA magnetische agarose deeltjes in elke verdunning ook. <ol><li> Vortex de microcentrifugebuis met de magnetische deeltjes na elke pipetteren te zorgen voor de deeltjes gesuspendeerd blijven. </li></ol></li><li> Plaats de plaat op een plaat schudder gedurende 15 minuten de monsters te incuberen met de deeltjes. </li><li> Na deze incubatieperiode, plaatst u de plaat op een 96-wells plaat magneet en wacht 30 seconden voor de deeltjes te trekken uit de oplossing. </li><li> Met behulp van een multichannel pipet, trek de oorspronkelijke monster en weggooien als afval. Verwijder de plaat uit de magneet. </li><li> Voeg 200 ul van HBST aan elk putje met behulp van de multichannel pipet. Pomp de buffer en neer meerdere malen om de magnetische deeltjes te wassen. </li><li> Plaats de plaat terug op de magneet en wacht 30 seconden voor de deeltjes te trekken uit de oplossing. </li><li> Met behulp van de multichannel pipet, trek de 200 ul buffer en weggooien als afval. Verwijder de plaat uit de magneet. </li><li> Herhaal stap 5.8 through 5.10 tweemaal drie wassingen van de deeltjes te voltooien. </li><li> Voeg 100 ul van HBST aan elk putje met magnetische deeltjes, gevolgd door 2,5 pl 2 mM IR1. </li><li> Incubeer de deeltjes met IR1 op een plaat schudder gedurende 1 uur. </li><li> Na 1 uur, lees de emissie-intensiteit bij 510 nm (excitatie bij 365 nm) onder toepassing van een 96-well plaatlezer. <ol><li> Plaats de plaat in het instrument en opent de plaat lezer software voor het opzetten van een nieuw experiment. </li><li> Stel het nieuwe experiment een fluorescentie eindpunt gelezen met een excitatiegolflengte van 365 nm en emissiegolflengte van 510 nm. Stel de sleufbreedte beide golflengten 9 nm, met de optiek in de bovenste positie. </li><li> Lees de plaat en de gegevens te exporteren voor analyse. </li></ol></li><li> Breng de monsters een duidelijke 96-putjesplaat en beeld titratie met een UV transilluminator. </li></ol>

<ol><li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+Care+Diagnostics%3A+Status+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li>
<li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Biosensors+and+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li>
<li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lighting+up+cells%3A+labelling+proteins+with+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li>
<li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases%3A+research%2C+detection+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gold+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li>
<li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal%E2%80%93Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+centered+ligand+field+excited+states%3A+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li>
<li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes%3A+Synthesis%2C+Photophysical+Characterization%2C+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li>
<li>Ho, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium%28iii%29-containing+coordination+polymers+with+different+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li>
<li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclometalated+Iridium%28III%29+Aquo+Complexes%3A+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li>
<li>Ma, D. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine%2FHistidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li>
<li>Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li>
<li>Leung, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li>
<li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir%28iii%29+complexes%3A+beyond+electroluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li>
<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+Iridium%28III%29+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Organometallics%22%5BJournal%5D)">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonemissive+Iridium%28III%29+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li>
<li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histidine-rich+glycoprotein%3A+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune%2C+vascular+and+coagulation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%2C+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li>
<li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum%3A+histidine-rich+protein+II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li>
<li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+infectious+diseases%3A+Diagnostics+for+the+Developing+World%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li>
<li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum%3A+Dendrimeric+Biomineralization+Templates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li>
<li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium%28III%29+solvento+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li>
<li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li>
<li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drivers+of+biodiagnostic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li>
<li>Li, M. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium%28iii%29+complex+for+determination+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als microdeeltjes gebaseerde diagnostische hulpmiddelen op de voorgrond van moderne diagnostische technologie, detectie van doelwit biomoleculen rechtstreeks op het oppervlak van het deeltje een groot voordeel. Traditionele moleculaire detectiemethoden zoals ELISA en PCR, zijn voordelig, doordat zij zeer lage detectiegrenzen 25 kan bereiken. Echter, deze testen vereisen uitgebreide reagentia en langdurige protocols. Deze test werd ontworpen om ELISA-type sandwich interacties nabootsen zonder de tijd en reactieve vereisten (figuur 5). Bovendien zijn de kosten van de IR1 probe per monster werd geschat op rond een cent, terwijl de kosten van antilichamen voor een typische ELISA Vertaald 0,20-0,30 per monster. Omdat de hierboven beschreven werkwijzen steunen op een cyclometalated iridium probe voor detectie van malaria biomarker zou deze probe niet storingsgevoelig modes bij andere detectiemethoden (bijv. Fluorofoor quenchi wordenng en antilichaam / enzym afbraak). Histidine is uniek in zijn metalen bindende eigenschappen. De geschetste werkzaamheden maakt gebruik van dit fenomeen door vervanging van de antilichamen in een typische sandwich ELISA met metaal complexen. Ni (II) NTA vangt rcHRP-II op het oppervlak van het deeltje en IR1 signaleert de aanwezigheid van het eiwit. De meest kritische stap bij het onderzoek wordt waardoor de magnetische deeltjes te mengen met het monster en de probe. In een 96-putjesplaat ELISA, de biomoleculen en reagentia evenwicht bereiken met het tweedimensionale oppervlak van de bodem van de put. Magnetische deeltjes de neiging te regelen uit oplossing door hun dichte ijzeroxide kern, waarbij de beschikbare bindingsplaatsen zou verminderen. Zo moet de deeltjes gemengd worden gedurende de testduur te garanderen maximale binding. Bij het ontwerpen van een reagens voor diagnostica, moet men rekening houden met de vorm van patiëntmonster en de fysiologische concentratie van de biomarker. Voormalaria, kan de concentratie van pf HRP-II in het bloed van de patiënt variëren van laag naar hoog picomolaire nanomolair. Hoewel deze test is klinisch relevant voor de hogere niveaus van de infectie, de detectielimiet moet worden verbeterd om asymptomatische patiënten op te sporen met een lage picomolaire circulerende pf HRP-II. In de hierboven beschreven werkwijzen, het &quot;inschakel&quot; signaal gegenereerd door IR1 plaatsvindt in de aanwezigheid van histidine. Terwijl de malaria biomarker is rijk aan histidine, andere serumeiwitten, zoals humaan serum albumine en histidine rijk glycoproteïne, zou een signaal met de probe response opwekken. Dit zou op zijn beurt leiden tot een vals positieve diagnoses. Dit maakt het vangen van het eiwit op het oppervlak van het deeltje een positieve stap in het eiwit van belang kan snel worden geëxtraheerd uit een patiëntenmonster. Bovendien, het ontwerpen van een bifunctionele sonde, dat paren een histidine rijke peptide om een robuuste moleculaire herkenning element (dwz. Aptameer), Zou een andere laag van specificiteit aan de bepaling. Het peptide zal worden geladen met iridium voordat koppeling aan de aptameer. In een dergelijk ontwerp, kan de stabiele IR1 sonde nog steeds gebruikt worden, terwijl het bereiken doel specificiteit van de aptameer. Zodoende zou de toepassing van de sonde natieve HRP-II te detecteren in een complexe matrix (bijv. Plasma of volbloed) en niet-specifieke binding te verminderen. Om het signaal van snelle diagnostische tests te verbeteren zouden de assay in een elektrochemiluminescent (ECL) systeem, waarbij pf HRP-II kan worden gedetecteerd op de RDTs een elektrochemische uitlezing 26 worden opgenomen. Deze volgende generatie iridium probe zou sterk verbeteren onze on-bead ELISA assay voor de detectie van ziekte biomarkers.

Colorimetrische en tl-etikettering is een belangrijke methode voor het opsporen en volgen van biochemische moleculen en verwerkt 1,2. De meest voorkomende fluorescente merkers zijn laagmoleculaire organische kleurstoffen 3,4, maar deze moleculen niet altijd ideaal optische eigenschappen. Fluorescente kleurstoffen zijn gevoelig voor fotobleken, vaak kleine Stokes verschuivingen, en kunnen overlappen excitatie- en emissiespectra. Colorimetrische kenmerken wordt vaak bereikt door middel van enzymatische labels, die een versterkt signaal bruikbaar immunoassay kwantificatie 5,6 hebben. Deze enzymen hebben ook hun nadelen, zoals lichtgevoeligheid, reactie- omstandigheden en korte substraat houdbaarheid. Deze eigenschappen hebben de neiging om immunoassays en eiwitmarkerend vereisen onder goed gecontroleerde omstandigheden met behulp kostbare reagentia te doen. Emissive overgangsmetaalcomplexen zijn onderzocht als alternatieve benadering labeling for biochemische detectie. Vooral cyclometalated Ir (III) werd onderzocht in de context van organische lichtgevende diodes (OLED&#39;s) 09/07 zuurstof sensor 10, 11 katalyse en eiwit / cel kleuring 12-14. Hoge fotostabiliteit en quantum efficiency maken deze klasse van probes een goede kandidaat voor biomolecuul detectie 15,16. Eerder werd gevonden dat cyclometalated Ir (III) complexen van de vorm [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, histidine onomkeerbaar binden en wekken een blauwgroene signaalrespons 12,17. Deze complexen zijn niet-emitterende in de solvento toestand, maar wanneer histidine verplaatst het oplosmiddel moleculen en bindt aan het metaalcentrum, zij een intense fosforescerend signaal na langegolf UV straling vrij. Dit signaal treedt alleen op na ligand substitutie, en is het resultaat van een triplet state electron ontspannen naar de grondtoestand door de activering van metaal ligand ladingsoverdracht (3 MLCT) en ligand gecentreerd overschrijving (3 LC) trajecten 8,15. Deze complexen kunnen eventueel worden gebruikt als probes voor de detectie histidine-rijke eiwitten. Histidine-rijke eiwitten en hun regulering zijn belangrijke bij vele ziekten, waaronder levercirrose, kanker en aandoeningen trombische. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pfHRP-II) in het bijzonder is een goed gevalideerde biomarker voor malariaparasiet infectie. Dit eiwit is 67 kDa en bevat 34% histidine, meestal binnen karakteristieke AHHAHHAAD herhalende motieven 19. Deze histidine herhalingen kan binden vrije metaalionen 19 en heem complexen 20 in gastheer bloed. pfHRP-II wordt vaak gedetecteerd in low-resource-instellingen met behulp van immunochromatographic snelle diagnostische tests (RDTs), maar deze tests zijn vaak onnauwkeurig vanwege sample omstandigheden, lage biomarker concentratie, slechte productie normen, en antilichaam degradatie 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt;-Metaalbevattende fosforescerende sondes zoals cyclometalated Ir (III) complexen bovenbeschreven aantrekkelijke mogelijkheden voor de detectie van pfHRP-II vanwege hun selectieve binding van histidine en hun stabiele en efficiënte emissie-eigenschappen. In dit document wordt het gebruik van [Ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) tot BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van pfHRP-II onderzocht 22 detecteren. Kinetiek van deze interactie zijn in real time via biolayer interferometrie technieken. De test werd ingericht om een ​​on-bead ELISA-type format, waarbij nanomolair aantoonbaarheidsgrenzen werden bereikt. Deze test heeft voordelen ten opzichte van traditionele ELISA omdat het kan worden uitgevoerd in minder dan 2 uur met antilichaam-vrije reagentia, in plaats van 4-5 hr en biologische reagentia nodig met typische ELISA.

<table><tbody><tr><td>Dichlortetrakis(2-(2-pyridinyl)fenyl)diiridium(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>zilvertrifluoromethaansulfonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Aminozuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>varieert</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II peptide</td><td>Gesynthetiseerd in eigen beheer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>recombinant HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar zwarte polypropyleen 96-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar witte polypropyleen 96-well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier zwarte polypropyleen 96-well plate</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA magnetische agarosedeeltjes</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA biolayer interferentiemetingssensoren</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Biolayer Interferometrie Instrument</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

iridium (iii) lichtgevende probe voor detectie van de malaria protein biomarker histidine rich protein-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Dit werk beschrijft de synthese van een niet-emitterende, cyclometalated Ir (III) complex, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), die een snelle, langlevende fosforescerende signaal opwekt wanneer gecoördineerd aan een histidine- bevattend eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een magnetisch deeltje. Synthese van IR1, in hoge opbrengsten, voltooid O / N en omvat splitsing van het bovenliggende cyclometalated Ir (III) chloro-gebrugd dimeer in twee equivalenten van de gesolvateerde complex. Om de specificiteit te bevestigen, werden verschillende aminozuren gesondeerd voor de coördinatie activiteit wanneer toegevoegd aan de gesynthetiseerde probe, en slechts histidine ontlokte een signaal reactie. Met behulp van BNT-II, een vertakt peptide nabootsing van de malaria biomarker Histidine Rich Protein II (pfHRP-II), werd de iridium sonde gevalideerd als een instrument voor HRP-II detectie. Afschrikken effecten werden in het BNT-II / IR1 titratie vastgesteld in vergelijking met L-Histidine / IR1, maar deze werden aan sterische hindering en triPlet staat blussen. Biolayer interferometrie gebruikt voor real-time kinetiek van interactie van IR1 met BNT-II te bepalen. Nadat het systeem is geoptimaliseerd, de detectiegrens van rcHRP-II met de probe bleek 12,8 nM in oplossing. Wanneer dit eiwit geïmmobiliseerd op het oppervlak van een 50 urn magnetische agarose deeltjes, de detectiegrens was 14,5 nM. De robuuste signaalresponsie van deze anorganische probe, alsook de gebruiksflexibiliteit in oplossing of geïmmobiliseerd op een oppervlak, kan leent tegen een verscheidenheid aan toepassingen van diagnostische beeldvorming gebruik.

Zoals getoond in figuur 1, de synthese van de IR1 solvento-complex betrokken splitsing van het chloride brug in de bovenliggende dimeer door precipitatie van het chloride in de vorm van onoplosbare AgCl en associatie van watermoleculen aan het metaalcentrum. De vorming van IR1 werd bevestigd door 1 H NMR en ESI. Bovendien, UV-zichtbare banden kenmerkend metaal ligand ladingsoverdracht en π-π * overgangen werden toegewezen aan het spectrum, verder valideren van de vorming van IR1. Het opgeloste complex vertoont geen emitterend vermogen bij excitatie bij 365 nm. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figuur 1:. Synthese en karakterisering van IR1 Chloride brug splitsing reactie van Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) fenyl) diiridium (III) aan de Aquo complex maken Ir (ppy) 2 (H2O) 2 </sub&gt; + (IR1). Na toevoeging van L-His de Aquo complex in waterige buffer, luminescente signaal ingeschakeld. Nadat het complex gesynthetiseerd en gekarakteriseerd, werd de aminozuur selectiviteit geanalyseerd zoals hiervoor omschreven met een soortgelijke iridium analogon 17. Figuur 2A toont dat slechts histidine veroorzaakte een signaal responsie bij 510 nm, wanneer geëxciteerd bij 365 nm. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figuur 2: Amino Acid Selectiviteit en Titratie van IR1 met Histidine rijke peptiden (A) Interactie van 200 uM van diverse aminozuren (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) bij 50 uM. IR1 in HBS. Spectrale scans werden 400-700 nm bij een excitatiegolflengte van 365 nm in een zwarte 96 puts plaat. Signaal in relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) van alle aminozuren baast histidine (gestippelde zwart trace) was verwaarloosbaar. (B) nanomolaire concentraties van BNT-II (▪) en rcHRP-II (♦) werden getitreerd met IR1 in HBS. De histidine rijke peptiden werden geïncubeerd met de probe gedurende 15 min in oplossing vóór het lezen van de emissie bij 510 nm na excitatie met 365 nm licht. Detectiegrens werd berekend als de waarde van x als y = 3σ leeg. Deze &quot;on-switch &#39;van de fosforescentie van de iridium sonde treedt op omdat de singlet aangeslagen toestand (1 MLCT / 1 LC) van de Ir (III) bioconjugaat ondergaat intersystem oversteek naar de triplet aangeslagen toestand (3 MLCT), wanneer histidine wordt gecoördineerd het metaalcentrum. Deze probe werd op BNT-II een peptide nabootser van het Plasmodium falciparum malaria biomarker Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). In een titratie van BNT-II met IR1, werd een concentratie afhankelijk signaal respons waargenomen ( <strong&gt; Figuur 2B). Recombinant HRP-II (rcHRP-II) vertoonden ook een soortgelijke reactie in oplossing. De detectielimieten van BNT-II en rcHRP-II in oplossing was 54,8 nM en 12,8 nM. Met biolayer interferometrie technieken, de Kd van binding aan IR1 BNT-II geïmmobiliseerd op een Ni (II) NTA oppervlak bleek 2,05 pM (Figuur 3). <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figuur 3: Real-time kinetische analyse van IR1 met BNT-II Biolayer interferometrie voor kinetische analyse van diverse concentraties van IR1 binding aan BNT-II op het oppervlak van een Ni (II) NTA glassensor.. Na equilibreren van de sensoren KB (regio A), worden de sensoren geladen met 0,5 uM BNT-II (regio B). Zodra het peptide op de sensoren is geplaatst, wordt een basislijn vastgesteld (regio C) voorafgaand aan het meten van de associatie van IR1 de BNT-II (Region D). Naeen periode van vereniging, de sensoren worden weer in KB geplaatst dissociatie (Regio E) te meten. Het hele kinetische analyse neemt minder dan 30 minuten. Bij overgang van een op oplossingen gebaseerde test die een magnetisch deeltje platform, de extra complexiteit van het deeltje in het systeem moest rekening worden gehouden. Het was bekend uit eerder werk, dat deze deeltjes efficiënt malaria biomarker pf HRP-II binden. 24 Black fluorescerende platen werkte goed voor de oplossing assay hierboven beschreven, maar witte platen geschikter zijn voor de detectie platform deeltjes, zoals in Figuur 4A. In een witte plaat, wordt het licht terug in het monster gereflecteerd, waardoor een betere absorptie door IR1 gebonden aan het oppervlak van het deeltje. In de assay on-deeltje, de detectiegrens van rcHRP-II werd bepaald op 14,5 nM (Figuur 4B). De detectiegrens voor rcHRP-II-oplossing en on-bead waren statistisch dezelfde basis van een ongepaarde t-test (p = 0,731). <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figuur 4:. On-bead Detectie van BNT-II en HRP-II (A) Verschil tussen gedetecteerd IR1 gebonden aan BNT-II op het oppervlak van 50 micrometer Ni signaal (II) NTA magnetische agarose deeltjes in een zwarte 96- putjesplaat (getrokken lijn) versus een witte 96-well plaat (stippellijn). De deeltjes werden enthousiast met 365 nm licht, en de emissie werd gemeten bij 510 nm. (B) Titratie van rcHRP-II geïmmobiliseerd op magnetische deeltjes en gedetecteerd met IR1. Detectiegrens werd berekend als het value van x als y = 3σ leeg. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figuur 5: Schematische weergave van On-bead Detectie van rcHRP-II met IR1 opzet van HRP-II binden aan het oppervlak van Ni (II) NTA deeltjes en gelabeld met IR1.. De deeltjes worden geïncubeerd met een histidine rijke peptide gedurende 15 minuten. Na deze incubatieperiode worden de deeltjes gewassen met HBST behulp van een magneet, zodat de deeltjes trekken uit de oplossing. Tenslotte worden de peptide gebonden deeltjes geïncubeerd met IR1 gedurende 1 uur voorafgaand aan het lezen van de emissie bij 510 nm na excitatie met 365 nm licht.

Robuuste detectie reagentia zijn steeds noodzakelijker voor het ontwikkelen van nieuwe malaria diagnostische hulpmiddelen. Er werd een iridium(III) sonde ontworpen die een langdurig lumineus signaal uitzendt in aanwezigheid van een histidine-rijk malaria-eiwit biomerker. Detectie van het eiwit, hetzij in oplossing of geïmmobiliseerd op een magnetisch deeltje, biedt flexibiliteit in toepassing.

Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van de aanwezigheid van een histidine-rijke malal-eiwitbiomarker in een monster met behulp van een fosforescerende iridiumsonde. Dit wordt bereikt door eerst het cyclogemethyleerde iridiumcomplex te synthetiseren. Na een snelle splitsing van de chloridebrug van het ouderdimercomplex kan het cyclogemethyleerde iridiumcomplex worden geïsoleerd en gezuiverd voor gebruik in de assay.De tweede stap is het valideren van de interacties van de probe met verschillende aminozuren om de specificiteit ervan te waarborgen. Voor histamine alleen wordt het fosforescentiesignaal uitsluitend ingeschakeld in de aanwezigheid van histamine en wordt dit waargenomen via luminescentiespectroscopie. Vervolgens wordt, als proof of concept, de iridium-probe getitreerd met een peptide-mimeticum van de malaria-biomarker, histidine rich protein two, om de detectielimieten in oplossing te bepalen.Daarnaast wordt de kinetiek van de interactie tussen de probe en het peptide opgehelderd met behulp van biolayer-interferometrie. De laatste stap is het immobiliseren van recombinant histidine-rijk eiwit op het oppervlak van nikkel-NTA-magnetische deeltjes en het bepalen van de detectielimiet van het eiwit met behulp van de probe. Ten slotte worden luminescentie en spectroscopie gebruikt om aan te tonen hoe eiwitten op het oppervlak van een vaste drager kunnen worden gedetecteerd met behulp van een nieuwe klasse fosforescerende iridium-probes.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals fluorescente eiwitlabeling en immunoassays, zijn dat de probe robuust is. Deze heeft een snelle associatiekinetiek en is niet gevoelig voor fotobleken. Bovendien vereist deze techniek geen tijdrovende procedures, zoals bij immunoassays wel het geval is.De implicaties van deze techniek reiken tot de diagnose van malaria-infecties. Dit komt door het hoge histidine-gehalte van de eiwitbiomarker voor plasmodium SRO-infectie, genaamd Histidine rich protein two. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we merkten dat er een artikel was gepubliceerd waarin een cyclometale iridiumsonde werd gebruikt om levende cellen te kleuren.In dit artikel werd gesteld dat de probe de levende cel binnendrong en de kernen deed oplichten door zich te binden aan histidine-rijke eiwitten. Gezien de aard van de mal-biomarker, histidine-rijk eiwit twee, hebben we besloten deze probe te gebruiken om ons eiwit van belang te detecteren. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal vanwege de complexiteit van de assay en de talrijke was- en transferstappen die nodig zijn om dit doeleiwit op een particle te detecteren. Om te beginnen wegen we 53,6 mg van de ouderiridiumdimeer af en lossen we dit op in 5 mL methyleenchloride.Voeg deze oplossing toe aan een Lummi-kolf van 50 milliliter die is uitgerust met een roerstaafje. Weeg vervolgens 26,2 milligram zilver FL af en los dit op in vijf milliliter methanol. Voeg het opgeloste zilver FL toe aan de oorspronkelijke iridiumdimer-oplossing en roer gedurende één uur.Na één uur zou er een crèmekleurige suspensie moeten ontstaan; filter de suspensie door silicagel in een filterkolf. Breng het gefilterde product over naar een DRAM-buisje van 25 bij 95 millimeter en verdampt het resterende oplosmiddel gedurende vijf tot 10 minuten met een rotatieverdamper. Controleer, zodra het grootste deel van het oplosmiddel is verwijderd, of er een olieus geel residu in het buisje is achtergebleven.Voeg één milliliter methanol toe aan dit residu om het product op te lossen. Laat dit één tot twee dagen staan om een gele vaste stof te verkrijgen en karakteriseer het product zoals beschreven in het tekstprotocol om de interacties van de iridiumsonde met verschillende aminozuren te onderzoeken. Pipetteer 100 µL van elke aminozuuroplossing in een zwarte 96-wellplaat.Voeg 100 µL gebufferde zoutoplossing of HBS toe aan de plaat om als blanco te dienen. Voeg vervolgens 2,5 µL van de bereide twee millimolaire iridiumsondeo-oplossing toe aan elk monster en schud de plaat 10 minuten op een plaatschudder. Neem na 10 minuten de emissiespectra van de monsters op met een 96-well plaatlezer.Plaats hiervoor de plaat in het instrument en open de software van de plaatlezer om een nieuw experiment in te stellen. Draag vervolgens de monsters over naar een transparante 96-wells plaat en beeld de emissie vast met een UV-transilluminator om de titratie van de iridiumprobe met de vertakte peptide-mimic van de malaria-biomarker, histamine-rich protein two BNT two, uit te voeren. Bereid eerst een stokoplossing van 1 mM BNT two in HBS voor.Verdun vervolgens de BN T twee-oplossing seriëel zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg van elke verdunning 100 µL in triplikaat toe aan de putjes van een 96-wells plaat, waarbij HBS als blanco dient; voeg aan elk monster 2,5 µL van een 2 mM iridium-probe toe. Schud de plaat 10 minuten op een plaatschudder en meet na het schudden de emissie-intensiteit bij 510 nm met een 96-wells plaatlezer.Breng ten slotte de monsters over naar een transparante 96-wells plaat en beeld de titratie af met een UV-transilluminator om een real-time kinetische analyse uit te voeren met biolayer interferometrie. Voeg eerst 200 µL kinetische buffer toe aan acht wells in de eerste kolom van een zwarte 96-wells plaat. Nadat de plaat in de plastic sensorhouder is geplaatst, worden acht nikkel-biosensoren voorzichtig overgebracht naar de eerste kolom in de plastic houder, zodanig dat de tips in de wells met buffer zijn ondergedompeld.Plaats vervolgens de plastic houder aan de linkerkant van het interferometrie-instrument in een nieuwe zwarte 96-wells plaatpipet, voeg 200 µL KB toe aan alle acht wells in kolom één en drie in dezelfde plaat, en voeg 200 µL van de 0,5 µM BNT-2 oplossing toe aan de wells in kolom twee. Voeg vervolgens 200 µL van elke verdunning van de iridiumprobe toe aan kolom vier, beginnend met KB als blanco in well A4. Voeg de verdunningen toe zodanig dat de concentratie van de iridiumprobe naar beneden in de kolom toeneemt.Plaats deze plaat in het instrument rechts van de plaat met de pre-wetting sensoren in de software voor biolayer-interferometrie. Stel een basis kinetisch experiment in door de plaatassay en sensortips te definiëren om de plaat vast te leggen; klik met de rechtermuisknop op een kolom op het scherm en kies de juiste definitie. Selecteer voor de wells de buffer.Laad voor kolom één en drie, en voor kolom twee en monster. Definieer voor kolom vier de assay in het volgende tabblad door eerst op 'add equilibrium' te klikken. 60 seconden laden, 120 seconden.Associatie 120 seconden en dissociatie 300 seconden. Selecteer de equilibriumsstap en dubbelklik op kolom één. Doe vervolgens hetzelfde voor laden naar kolom twee, baseline naar kolom drie, associatie naar kolom vier en dissociatie naar kolom drie.Select tot slot de nikkel-NTA-sensoren. Bevestig dat het experiment correct is geschetst. Voer een bestandsnaam in.Controleer of de vertragingsexperiment-optie is aangevinkt en druk op 'go'. Zodra de kinetische run is voltooid, verwerkt u de gegevens in de meegeleverde verwerkingssoftware om de detectie op kralen van BNT twee en recombinant HRP twee met de iridiumsonde uit te voeren. Bereid seriële verdunningen van BNT twee en recombinant HRP twee voor zoals beschreven in het tekstprotocol.Pipette vervolgens 100 µL van elke verdunning in triplikaat in een witte 96-wells plaat, waarbij de verdunningen in een kolom worden aangebracht van de laagste naar de hoogste concentratie. Pipetteer 10 µL van 50 µm nikkel-NTA magnetische agarose-deeltjes in elke verdunningswell. Let erop dat de magnetische deeltjes tijdens het pipetteren gesuspendeerd blijven. Als ze beginnen te bezinken, meng dan door te pipetteren of door middel van vortexen. Plaats de plaat 15 minuten op een plaatshaker om de monsters met de deeltjes te incuberen. Plaats de plaat na deze incubatieperiode op een 96-wells magneet en wacht 30 seconden tot de deeltjes uit de oplossing zijn getrokken.Verwijder met een meerkanaals pipet de oorspronkelijke monsteroplossing en gooi deze weg als afval, nadat de plaat van de magneet is gehaald, door 200 µL HBS met tween of HBST in elke put aan te brengen. Pomp met de meerkanaals pipet de buffer meerdere keren op en neer om de magnetische deeltjes te wassen. Plaats de plaat terug op de magneet en wacht 30 seconden tot de deeltjes uit de oplossing zijn getrokken.Gebruik de multikanalspipet om de 200 µL buffer af te zuigen en weg te gooien als afval. Verwijder de plaat van de magneet voordat de wasstappen twee keer worden herhaald, om zo in totaal drie wassingen van de partikels te voltooien. Voeg vervolgens 100 µL HBST toe aan elke well die magnetische partikels bevat, gevolgd door 2,5 µL van de 2 mM iridium-sondeo-oplossing.Incubeer de partikels met de iridiumsonde gedurende één uur op een plaatshaker. Lees na één uur de emissie-intensiteit af bij 510 nanometers met een 96-wells plaatlezer.Na de synthese en karakterisering van de cyclogemethyleerde iridiumprobe worden verschillende aminozuren getest op reactiviteit met het complex. Alleen histidine wekt een signaalrespons op in relatieve fluorescentie-eenheden bij titratie van de probe. Met twee histaminehoudende peptiden in oplossing wordt een concentratieafhankelijke respons waargenomen.Deze respons is hier zichtbaar onder breedbandig UV-licht. Biolayer interferometrie voor kinetische analyse van verschillende concentraties van de iridiumprobe die bindt aan BNT twee op het oppervlak van een nikkel-NT.A glassensor onthult dat de iridiumprobe een micromolaire affiniteit heeft voor de histidine-bevattende peptiden.De detectielimiet voor het histidine-rijke eiwit met behulp van de probe was vergelijkbaar wanneer het eiwit was geïmmobiliseerd op het oppervlak van een magnetisch deeltje. Net als in oplossing kan deze labeling van het eiwit, zodra de techniek onder knie is, worden gevisualiseerd op het oppervlak van de deeltjes zelf. Deze techniek kan in twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn tijdens de was- en overdrachtstappen met de magnetische eiwitgebonden deeltjes. Het uitwassen van ongebonden eiwit is essentieel voor de juiste detectie van geïmmobiliseerd P-F-H-R-P twee, bij het ontwerpen van een moleculaire herkenningseenheid die specifiek gericht is op het gebonden eiwit via antilichaam-antigeeninteracties. Het gebruik van de robuuste iridiumsonde zal na ontwikkeling een gevoeligere en specifiekere detectie mogelijk maken van eiwitten die gebonden zijn aan het oppervlak van de deeltjes.Deze techniek heeft de potentie om de weg vrij te maken voor onderzoekers in het vakgebied van de diagnostiek om het gebruik te onderzoeken van dergelijke reagentia die robuust zijn, niet alleen voor de detectie van malaria, maar ook voor andere infectieziekten.

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Magnetische modulatie biosensing systeem wordt gebruikt om snel, gevoelig en eenvoudig te detecteren biologische assays, zoals DNA-moleculen en eiwitten.

Homogene snelle detectie van biologische testen met behulp van Magnetic Modulation biosensing System

Kwantitatieve, high-throughput, real-time, en label-free biomoleculaire detectie (DNA, eiwitten, enz.) op...

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

Hier presenteren we een protocol om RNA / eiwit interacties te analyseren. De elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) is gebaseerd op de differentiële migratie van RNA / eiwit-complexen en vrij RNA in natieve gelelektroforese. Door een radioactief gemerkte RNA-probe, kan RNA / eiwit-complexen worden gevisualiseerd door autoradiografie.

Elektroforetische mobiliteit Shift Assay (EMSA) voor de studie van RNA-eiwit interacties: Het IRE / IRP Voorbeeld

Terwijl hoge resolutie smeltende analyse biedt de mogelijkheid om te differentiëren tussen single nucleotide polymorfismen in een heterogene populatie, kunnen mutante allel amplificatie vertekening zijn vermogen allelen aanwezig betrekkelijk lage percentages in een monster te detecteren verhogen. Dit protocol beschrijft verbeteringen die de gevoeligheid van hoge resolutie smeltende analyse te verbeteren.

Methoden om de gevoeligheid van hoge resolutie Melting Single Nucleotide Polymorphism genotypering in Malaria Verhoog

Menselijk microRNA transloceert van gastheer erytrocyten naar Plasmodium falciparum parasieten. Hier worden de technieken beschreven die worden gebruikt om synthetische microRNA's in gastheer erytrocyten te transfecteren en alle RNA's uit P. falciparum te isoleren. Daarnaast zal dit artikel een methode voor polysoomisolatie in P. falciparum beschrijven om de ribosomale bezetting en translationele potentieel van parasiet transcripten te bepalen.

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Hier beschrijven we een procedure die een gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de fosforyleringsafhankelijke activering van de IRF3-transcriptiefactor. Dit wordt bereikt door de combinatie van een hoge resolutie SDS-PAGE en een native-PAGE gekoppeld aan immunoblots met behulp van meerdere fosfospecifieke antilichamen.

Een hoge resolutie methode om Fosforylatie-afhankelijke activering van IRF3 Monitor

Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in besmette waterige rode bloedcellen, met behulp van een verzwakte totale reflectie infrared spectrometer en multivariate data-analyse.

Detectie en kwantificering van Plasmodium falciparum in waterige rode bloedcellen door verzwakt totale reflectie infraroodspectroscopie en Multivariate Data-analyse

Om de serologische diagnostische tests voor Mycobacterium tuberculoseantigenen te verbeteren, ontwikkelden we superparamagnetische ijzeroxide nanoprobes om extrapulmonale tuberculose op te sporen.

Synthese, karakterisering en toepassing van superparamagnetische ijzeroxide nanosondes voor detectie van extrapulmonale tuberculose

Dit protocol richt zich op de identificatie van eiwitten die binden aan inositol fosfaten of fosfoinositides. Het maakt gebruik van affiniteits chromatografie met biotinyleerd inositol fosfaten of fosfoinositides die zijn geïmmobiliseerd via streptavidine aan agarose of magnetische kralen. Inositol fosfaat of fosfoinositide bindende eiwitten worden geïdentificeerd door Western blotting of massaspectrometrie.

Identificatie van inositol fosfaat of Fosfoinositide interactie eiwitten door Affiniteits chromatografie gekoppeld aan Western Blot of massaspectrometrie

De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.

Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten

Het huidige protocol beschrijft een gedetailleerde, real-time NIR-II fluorescentie beeldvormingsoperatie van een muis met behulp van een NIR-II optisch beeldvormingsapparaat.

Een heldere NIR-II fluorescentiesonde voor vasculaire en tumorbeeldvorming

Ontdek de detectie van het malaria-biomarker Histidine Rich Protein-II met een fosforescerende iridium(III)-probe. Deze methode biedt robuuste luminescentiesignalen voor snelle en betrouwbare diagnostiek.

Iridium (III) Lichtgevende Probe voor detectie van de malaria Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Meer video's verkennen