Name: Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer neurale activiteit op afstand te onderdrukken in ratten tijdens leer- en geheugentaken met farmacogenetica. Deze methode onthult de rol van specifieke hersengebieden in leerprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de auteurs van Robinson et al. 12 voor hun bijdragen aan het manuscript van waaruit dit protocol is gedeeltelijk afgeleid.

Het gebruik van dieren worden goedgekeurd door het Oberlin College Institutional Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren 21. 1. Voorbereiding voor Virale Infusion Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van BSL-1 voorzorgsmaatregelen. Bij toepassing van BSL-2 voorzorgsmaatregelen, een wegwerp laboratoriumjas, handschoenen, schoenen covers, oog bescherming en een stofmasker (type N95) zijn verplicht. Alle individuen omgaan met BSL-2 verbindingen moeten passen getest voor een stofmasker door een lokale volksgezondheid agentschap. Raadpleeg Lowery &amp; Majewska (2010) 22 voor meer informatie over de behandeling en opslag van virale vectoren. <ol><li> Bij het eerste gebruik, hoeveelheid en op te slaan ongebruikte virus in 20 ul microcentrifugebuizen herhaaldelijk invriezen en ontdooien vermijden. </li><li> Bereid het werkoppervlak van onnodige voorwerpen verwijderen en steriliseren van het oppervlak met 70% ethanol. Bereid een 10% bleekwater oplossing voor het reinigen van AAV afval. Plaats een beker vol van de bleekwater oplossing en een steriele 10 ul injectiespuit op het werkvlak. Plaats de microcentrifugebuis met de AAV in een container met crushed ijs tijdens set-up. </li><li> Plaats de microcentrifugebuis met het virus in een standaard bankschroef. Laad een 10 gl spuit met tenminste 4 pl AAV. Let erop dat de punt van de spuit tegen de onderzijde van de microcentrifugebuis buigen tijdens het laden. Zorg dat er geen luchtbellen in de 4 gl AAV oplossing in de injectiespuit. </li><li> Gooi de lege virus buis in de beker met 10% bleekmiddel. Bewaar ongebruikte delen van het virus, zoals gespecificeerd door de leverancier. </li><li> Voeg extra 10% bleekwater naar de afvalcontainer, en laat afval te zitten voor 30 min voor het weggooien van de ontsmet vloeibaar afval. </li><li> Gooi alle beschermingsmiddelen en plastic afval in een biohazard container in opdracht van institutionele richtlijnen. Decontaminate alle apparatuur en oppervlakken die in contact komen met het virus middels 10% bleekwater kwam. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Bereid de chirurgische gebied door het plaatsen van absorberend bankje papier onder de stereotaxische apparaat en op een aangrenzende ruimte aangewezen als een speciale virus handling gebied. <ol><li> Plaats een 10% bleekmiddel afvalcontainer in de speciale virus handling in de buurt van de chirurgische apparatuur. </li></ol></li><li> Leiden tot een stabiel niveau van de anesthesie en de voorbereiding van de rat voor een operatie. <ol><li> Plaats de rat in een inductiekamer met een mengsel van isofluraan gas (traject van 1-3%) en zuurstof (100% bij ongeveer 1 l / min) bevat totdat er een verlies van bewustzijn en gebrek aan grove doelgerichte beweging. Handhaaf isofluraan anesthesie gedurende de chirurgische procedure. </li><li> Na 6 diepe narcose is bereikt, scheren de rat van tussen de ogen om iets achter de oren. </li><li> Plaats de rat weer in de inductie kamer voor eenAanvullende 1-3 min. </li><li> Controleer of de isofluraan anesthesie is aangesloten op de neuskegel van de stereotaxische chirurgie. Open de plugkraan op de isofluraan buis om de stroom van isofluraan de stereotax beginnen. Handhaving van de isofluraan en zuurstof op het hierboven aangegeven niveau. </li><li> Plaats de rat in een stereotaxische apparaat door het veiligstellen van de mond naar de beet bar en het veiligstellen van het oor bars. </li><li> Breng oogzalf voor de ogen en betadine op de chirurgische lokatie vóór incisie. </li></ol></li><li> Wordt 2,4 cm middellijn incisie van de huid op het dorsale oppervlak van de schedel vanaf ongeveer 2 mm caudaal van de ogen. Trek de huid aan de schedel bloot te leggen. Periodiek inboezemen steriele 0,9% steriele zoutoplossing in de marge van de chirurgische site om weefsel van uitdroging te voorkomen. </li><li> Clear membraneuze weefsel van de schedel tot bregma en lambda zijn duidelijk zichtbaar. </li><li> Zorg ervoor dat de schedel is niveau door het meten van de dorsale-ventrale coördinaten opbregma en lambda. Stel het stereotaxische apparaat dienovereenkomstig tot dorsale-ventrale coordinaten bregma en lambda verschillen niet meer dan 0,04 mm. </li><li> Op dit moment beperken de isofluraan gas tussen 2 en 2,5%. </li><li> Zet de boormachine aan bregma, ReZero de coördinaten en verplaats de boor op de gewenste mediale-laterale en de voorste-achterste coördineren. </li><li> Boor een gat in het coördineren van het gebruik van een 0,9 mm boor als het produceert een passende omvang gat voor een 28 G infuus spuit. </li><li> Stel de infusiepomp tegen virus te leveren met een snelheid van 0,2 ul / min. Plaats de injectiespuit in de arm infusie van het stereotaxische apparaat en laat de spuit in de gewenste coördinatie. Levert de gewenste hoeveelheid virus (spreiding 0,1-0,8 pl). Zo levert 0,8 gl AAV dan 4 min. Opmerking: voeren proefonderzoeken het ideale infusievolume en de typische verspreiding van virus in elk gebied van belang te bepalen. <ol><li> Na levering van virus complete laat de spuit in de plaats voor 10 min om terugstromen in de naald-darmkanaal te voorkomen. Langzaam verhogen van de spuit met een snelheid van ongeveer 5 mm / min. Herhaal dit tot alle coördinaten zijn doordrenkt met AAV. </li></ol></li><li> Sluit de wond met chirurgische nietjes en de vacht van de wond met actuele antibiotische zalf. </li><li> Volg de institutionele richtlijnen voor postoperatieve pijnbestrijding. </li><li> Plaats de rat in een kooi met beddengoed, een deksel en een goede bewegwijzering en de terugkeer van de rat om het dier faciliteit. <ol><li> Als het werken onder BSL-2 voorzorgsmaatregelen, verzamel beddengoed voor de hoeveelheid tijd (meestal 48-72 uur) die door institutionele richtlijnen. Plaats beddengoed in een biologisch gevaarlijk afval container. </li><li> Gooi alle AAV-verontreinigde materialen zoals gespecificeerd door richtlijnen voor veilige verwijdering. </li></ol></li></ol> 3. Behavioral Apparatuur Opmerking: De sensorische preconditionering apparaat bestaat uit een standaard operante conditionering chamber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) met een roestvrij stalen rooster vloer, 2 Plexiglas zijwanden en 2 metalen wanden. <ol><li> Monteer een 2,8 W licht op een van de aluminium wanden om te dienen als het huis licht en de visuele stimulus toen flitste op 2 Hz. Monteer een luidspreker op de kamer naar de auditieve stimuli te leveren (10 sec, 1500 Hz, 78 dB zuivere toon en een 10 sec 78 dB witte ruis). <ol><li> Gebruik een voedsel hopper tot 45 mg voedsel pellets leveren in het voedsel beker. Binnen het voedsel kopje, infrarood fotocellen de totale tijdsduur in het voedsel kopje vóór, tijdens en na presentatie van stimuli en levensmiddelen punten. </li><li> Het huis van de kamers in-geluiddempende kasten (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) uitgerust met afzuigventilatoren (~ 68 dB). </li><li> Gebruik een PC computer met Med Associates software om de operante kamer van de gegevens te controleren en te verwerven. Tijdens de sessies Conditioning, data te verzamelen over de totale tijd doorgebracht met het hoofd in het voedsel beker tijdens presentatiestie van het licht stimulus (5 sec tijdperk) en tijdens de presentatie van het eten beloning (5 sec tijdperk). Tijdens de testsessie gegevens verzameld over de totale tijdsduur in de voedselkop in reactie op de presentatie van auditieve stimuli (10 sec epoch begin als de auditieve stimuli worden beëindigd). </li></ol></li></ol> 4. Overzicht van de Sensory Voorconditionering Paradigm <ol><li> Na herstel van de operatie geleidelijk voedsel beperken ratten 85% van het voedingssysteem lichaamsgewicht. Raadpleeg veterinaire personeel naar een geschikte voedsel beperking paradigma. Noot: De 3-fasen sensorische preconditionering paradigma is weergegeven in figuur 2. </li><li> Preconditionering Sessions (fase 1; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 4 opeenvolgende dagen): <ol><li> Present ratten met 12 vermengd proeven die bestaan ​​uit de levering van auditieve en visuele stimuli. Omvatten inter-proces intervallen die na elk een gemiddelde van 4,5 min (range 4,0-5,0 min)uditory presentatie. </li><li> Op 6 van de proeven, het heden een toon (geconditioneerd stimulus) gedurende 10 sec, onmiddellijk gevolgd door een 5 sec presentatie van het knipperlicht stimulus. </li><li> Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (ongepaard stimulus) alleen al voor 10 sec. </li></ol></li><li> Conditioning sessies (fase 2; Daily 64 min trainingssessies uitgevoerd over 5 opeenvolgende dagen): <ol><li> Present ratten met 8 proeven die bestaan ​​uit de levering van de visuele stimulus (het knipperlicht stimulus) voor 5 sec onmiddellijk gevolgd door levering van twee 45 mg voedsel pellets. Omvatten inter-proces intervallen die gemiddeld 7 min (range 6,0-8,0 min) na elke proef. Af en ratten vereisen meer dan 5 conditioning sessies om het licht voedsel vereniging leren. </li></ol></li><li> Test Session (fase 3, een enkele 78 min sessie): <ol><li> Presenteer de ratten met 12 vermengd proeven die bestaan ​​uit de levering van de auditieve stimuli alleen. Omvatten inter-proces intervallen die average 4,5 min (range 4,0-5,0 min) na elke auditieve presentatie. </li><li> Op 6 van de proeven, presenteren de toon stimulus (de geconditioneerde stimulus) alleen al voor 10 sec. </li><li> Aan de andere 6 proeven, presenteren de witte ruis (de ongepaarde stimulus) alleen al voor 10 sec. </li></ol></li><li> Tegenwicht de stimuli door het invullen van de studie met een tweede set van ratten die de witte ruis als geconditioneerd stimulus en de toon als het ongepaarde stimulans krijgen. </li></ol> 5. farmacologische en Behavioral Procedure <ol><li> Schakel de stroom naar de gedrags-apparaat en laad de Med-PC-code voor de juiste gedrags-sessie. Draad en het programma van de behavioral apparaat zodanig dat de fans die op de geluiddempende kasten zijn gemonteerd ingeschakeld wanneer de stroom wordt ingeschakeld. </li><li> Een 1 mg / ml oplossing van clozapine N-oxide (CNO) te bereiden, weeg 5,0 mg CNO in een 15 ml conische buis en voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% saline. Vortex tot de oplossing helder is. <ol><li> Als CNO niet oplost in oplossing of meer geconcentreerde oplossingen van CNO gewenst voeg een oplosbaar makend middel zoals DMSO 23. Specifiek, een 1 mg / ml oplossing van CNO bereiden met 0,5% DMSO Weeg 5,0 mg CNO en voeg 25 pl van DMSO tot een 15 ml conische buis. Flick voorzichtig waarborgen dat de inhoud blijven op de onderkant van de buis. Wanneer de oplossing helder, voeg 5 ml steriel water en 5 ml van een steriele 0,9% zoutoplossing. Verdere instructies voor het bereiden van oplossingen van CNO zijn beschikbaar op de DREADD wiki resource pagina 25. </li><li> Bereid een nieuwe CNO oplossing elke dag dat het wordt toegediend. </li></ol></li><li> Injecteer de CNO intraperitoneaal in een dosis van 1 mg / kg op ongeveer 30 minuten voor gedragstesten. Bijvoorbeeld Injecteer 200 g rat met 0,2 ml van de 1 mg / ml CNO oplossing. De dosis en tijdsverloop van CNO administratie werden geselecteerd op basis van eerder gepubliceerde rapporten 2,12.<ol><li> Injecteer CNO 30 min voor elke preconditionering zitting (Fase 1, totaal 4 dagen na injectie) maar vóór het voertuig dienen aan alle volgende behavioral sessies. </li></ol></li><li> Na 30 min, plaatst de ratten in de gedragstesten kamers en inleiding van de computercode voor het betreffende gedrags- sessie. </li><li> Na voltooiing van de gedragstaak, onmiddellijk de ratten uit de kamers en de terugkeer van de ratten aan het dier kolonie. </li></ol> 6. Analyses van Behavioral gegevens Opmerking: De afhankelijke variabele voor gedrags sessies de tijdsduur dat het hoofd van de rat is in de voedselkop zoals gedetecteerd door onderbreking van de infrarode fotocellen in het voedselkop. De data (in sec) wordt verzameld en geregistreerd door de computer software. <ol><li> Niet uit te voeren analyses over de gegevens die tijdens de conditioneringsfase. </li><li> Voor de conditionering sessies: analyseert elke ratten &#39;eenheid aan het licht voedsel vereniging leren door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de presentatie van de visuele stimulus over de 5 behavioral sessies. Specifiek, het berekenen van de gemiddelde tijd doorgebracht in het voedsel beker tijdens de 5 sec licht tijdperk voor elk van 8 proeven / sessie (dwz een gemiddelde van 8 proeven die elk 5 sec duur / rat). Vergelijk gemiddelde controle en experimentele waarden voor elk van de 5 dagelijkse sessies (zie figuur 3A). <ol><li> Analyseer de motivatie van de ratten &#39;om voedsel te belonen verkrijgen door voedsel gedrag cup te vergelijken tijdens de levering van het voedsel beloning (5 sec tijdperk) over de 5 gedragstherapie sessies met behulp van dezelfde berekening als opgegeven voor de 5 sec licht tijdperk boven. Deze waarden zullen constant hoger dan die tijdens de presentatie van de visuele stimulus verworven (zie figuur 3B). </li></ol></li><li> Voor de testsessie: berekenen discriminatie verhouding die voedsel kopje gedrag van de ratten &#39;beschrijft in reactie op de presentations van elke auditieve stimulus. <ol><li> Specifiek voor elke rat, verdeelt de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de sensorische geconditioneerde stimulus (dwz de toon) door de som van de gemiddelde tijd doorgebracht op het voedselkop na elk van 6 presentaties van de zintuiglijke voorgeconditioneerde stimulus (ie, de toon stimulus) plus het gemiddelde van de totale tijd doorgebracht in het voedsel beker na elk van 6 presentaties van de ongepaarde stimulus (ie, de witte ruis stimulus). Elk tijdvak is 10 seconden duren. Opmerking: Een discriminatie score van 0,5 of hoger toont aan dat ratten leerden de verenigingen die inherent zijn aan het zintuiglijke preconditionering paradigma. </li></ol></li></ol> 7. Verificatie van AAV Plaatsing en Expression <ol><li> Verdoven en perfuseren de ratten transcardiaal met 4% paraformaldehyde. Door het gebruik van fluorescente labels, niet meer dan een post-fixatie periode van 2 uur tot minimize verlies van antigeniciteit en het fluorescentiesignaal te behouden. </li><li> Uitdrogen geperfuseerd hersenen door ze in hersenen pot met 30 ml van een 20% sucrose-oplossing in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x) gedurende minstens 2 dagen of totdat de hersenen zinkt naar de bodem van de pot hersenen. </li><li> Gebruik een koude glijdende microtoom coronale hersensecties (20-40 urn) maken het gehele rostrocaudale omvang van het gebied van belang. </li><li> Voer immunohistochemie tegen de gemerkte receptor of reporter proteïne om de locatie en expressie van de ontwerper receptor en / of reporter 12 bepalen. Een immunohistochemie kleuringsprotocol is voorzien op het DREADD wiki resource pagina 25. </li><li> Monteer de onderdelen op SuperFrost-plus dia&#39;s en dekglaasje met 100-200 ul van een waterige montage medium. </li><li> Voer fluorescentiemicroscopie op hersenweefsel te AAV plaatsing en eiwitexpressie 12,24 controleren.</li>
</ol>

<ol><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G-protein+coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Urban, D. J., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+%28Designer+Receptors+Exclusively+Activated+by+Designer+Drugs%29%3A+Chemogenetic+tools+with+therapeutic+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pharmacol.Toxicol%22%5BJournal%5D)">DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility.</a> Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).</li>
<li>Weiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+M1+muscarinic+receptor+agonism+of+N-desmethylclozapine+in+the+unique+clinical+effects+of+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharm.+%28Berl%22%5BJournal%5D)">The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine.</a> Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).</li>
<li>Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+NJ+%22amnesia+and+the+hippocampal+system%22">amnesia and the hippocampal system</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).</li>
<li>Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network).</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Agster, K. L., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+efferents+of+the+perirhinal%2C+postrhinal+and+entorhinal+cortices+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat.</a> Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).</li>
<li>Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+anatomical+systems+embedded+within+the+primate+medial+temporal+lobe%3A+implications+for+hippocampal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).</li>
<li>Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+circuitry+between+retrosplenial+and+postrhinal+cortices+during+fear+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning.</a> J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).</li>
<li>Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).</li>
<li>Kaut, K. P., Bunsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+lesions+to+the+rat+hippocampus+or+rhinal+cortex+on+olfactory+and+spatial+memory%3A+retrograde+and+anterograde+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn.+Affect.+Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings.</a> Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).</li>
<li>Brogden, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Sensory preconditioning.</a> J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).</li>
<li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+silencing+of+neurons+in+retrosplenial+cortex+disrupts+sensory+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning.</a> J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+guidelines+for+research+involving+recombinant+or+synthetic+nucleic+acid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Available+from%3A+http%3A%2F%2Foba.od.nih.gov%2Frdna%2Fnih_guidelines_oba.html%22%5BJournal%5D)">NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules.</a> Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Virol%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li>
<li>Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+risks+related+to+the+use+of+adeno-associated+virus-based+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors.</a> Gene Ther. 3, 545-565 (2003).</li>
<li>Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-2+%28AAV-2%29+causes+trophoblast+dysfunction%2C+and+placental+AAV-2+infection+is+associated+with+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Path%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia.</a> Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).</li>
<li>Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+in+testicular+tissue+and+in+abnormal+semen+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples.</a> Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vector+integration+sites+in+mouse+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma.</a> Science. 317 (5837), 477-47 (2007).</li>
<li>Donsante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+expression+of+Pctk1%2C+Tcf12+and+Ccnd+in+hippocampus+of+rats%3A+impact+on+cognitive+function%2C+synaptic+plasticity+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and.</a> 97 (1), 69-80 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Academy+Press.+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22National+Academy+Press%22%5BJournal%5D)">National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> National Academy Press. , Washington, DC. (1996).</li>
<li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+injection+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial injection of adeno-associated viral vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Cavaletti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+in+the+peripheral+nervous+system+of+systemically+administered+dimethylsulfoxide+in+the+rat%3A+a+neurophysiological+and+pathological%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological.</a> 119 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Parnaudeau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+thalamus+hypofunction+impairs+flexible+goal-directed+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior.</a> Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).</li>
<li>wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).</li>
<li>Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-pathway+striatal+neurons+regulate+the+retention+of+decision-making+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies.</a> J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).</li>
<li>Cassatarro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+pharmacogenetic+modulation+of+the+nucleus+accumbens+reduces+ethanol+consumption+in+a+limited+access+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharm%22%5BJournal%5D)">Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm.</a> Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).</li>
<li>Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+versus+delayed+stimulation+of+feeding+by+the+endogenously+released+AgRP+neuron+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22GABA%2C+NPY+and+AgRP.+Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators.</a> GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).</li>
<li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li>
<li>Nelson, R. J., Young, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+in+mice+with+targeted+disruption+of+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Behavior in mice with targeted disruption of single genes.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol beschrijft hoe een farmacogenetische benadering (DREADD) zijn van toepassing om te onderzoeken hoe een specifieke regio hersenen draagt ​​bij aan een multi-fase complexe leertaak. Met de mogelijkheid om tijdelijke neurale activiteit op afstand zwijgen in discrete hersengebieden over leerfasen combinatie van deze benaderingen is een platform waarop een verschillende gedragingen, zoals meer genuanceerd of gemaskeerde vormen van leren onderzoeken. In de in dit protocol beschreven voorbeeld controle ratten en r...

Een uitdaging op het gebied van Behavioral Neuroscience is het neurale substraat van complexe gedrag te bepalen. Een aantal technieken zoals permanente laesies, tijdelijke inactivering hersenen via canules implantaten en optogenetics zijn gebruikt om de bijdrage van discrete hersengebieden identificeren subcomponenten van complexe gedragingen. Hoewel deze benaderingen te informeren ons begrip van regionale specificiteit tijdens het leren, elke techniek is niet zonder beperkingen. Specifiek worden permanent laesies gewoonlijk uitgevoerd vóór gedragstesten, waardoor het effect gedurende de duur van het paradigma aanwezig. Canulatie studies dat de presentatie van een korte-termijn neurale inactivator (bijv tetrodotoxin) te betrekken kan aanzienlijke schade aan hersenweefsel te produceren en kan stress in proefpersonen vlak voor gedrags testen induceren. Verder wordt inactivering door middel canulatie beperkt tot het gebied van weefsel dat rond detopje van de canules. Tot slot, terwijl optogenetics biedt een scala van flexibiliteit voor de tijdelijke controle van de activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, het is onbetaalbaar en technisch veeleisend. Deze beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van een farmacogenetische aanpak (Designer-receptoren Uitsluitend-Activated-by-Ontwerper-Drugs, DREADDs) 1,2. Belangrijk, terwijl het begrip farmacogenetica is verfijnd, de uitvoering van de techniek is eenvoudig. Vergelijkbaar met traditionele stereotaxische chirurgische methoden die infusie toxine (bijvoorbeeld NMDA, iboteenzuur) in discrete hersengebieden omvat deze techniek infusie een adeno-geassocieerd virus (AAV), die een DNA-fragment dat voor een gemodificeerd remmend G-proteïne gekoppelde receptor bevat betrekken (hM4Di, de ontwerper receptor) in het interessegebied van standaard laboratorium knaagdieren (zie figuur 1). De virale vector bevat ook een fluorescerende reporter (mcitrine). Eenmaal opgenomen incellen, worden de designer receptor (en reporter proteïne) maximaal tot expressie ~ 3 weken na infusie en kan selectief worden geactiveerd voor 2-5 uur met de systemische toediening van de anderszins biologisch inert ontwerperdrug, clozapine-N-oxide (CNO) 1 , 3. Omdat de experimentator is begiftigd met precieze, maar remote temporele controle over de neurale activiteit in bepaalde gebieden van de hersenen, farmacogenetica combineert bijzonder goed met gedragsproblemen paradigma&#39;s die worden uitgevoerd in meerdere fasen. In dit voorbeeld is de bijdrage van de retrospleniale cortex (RSC) naar stimulus stimulus learning vergeleken met zijn rol in Pavlov leren evenwel deze combinatie van benaderingen is zeer geschikt om een ​​aantal vragen die proberen te bepalen hoe specifieke hersengebieden bijdragen aan complex gedrag. Bovendien, terwijl in het onderhavige protocol beschreven, virale en transgene benaderingen kunnen worden gebruikt om type-specifieke cel DREADD expressie 2 bereiken. Zoals iks inherent aan gedragsparadigma&#39;s die farmacologische en / of andere vormen van experimentele manipulaties, zorgvuldige afweging van proefopzet en daaropvolgende kwantitatieve bepalingsmethoden kunnen nodig bij gebruik van de DREADD benadering. Onderzoekers nieuw voor de DREADD benadering worden verwezen naar een uitgebreid overzicht van de huidige DREADD technologie 2. Dagelijks organismen informatie over nieuwe impulsen en gebeurtenissen en hun onderlinge relaties. Zelfs in een vertrouwde omgeving, zoals thuis, men snel veranderingen detecteren in de relatie tussen stimuli, die veranderingen voorspellende betekenisvolle gebeurtenissen zijn. Dergelijke stimulus-stimulus (ie, relationeel) leren betreft de samenvoegende van meerdere stimuli en is van oudsher geassocieerd met de hippocampus, die centraal woont binnen de mediale temporale kwab 4. Echter, de hippocampus niet bestaat of geïsoleerd optreden; corticale gebieden, zowel binnen als buitenkant van de mediale temporale kwab bieden kritische zintuiglijke informatie naar de hippocampus formatie 5-7. Traditionele permanent letsel studies dwingend bewijs voor de betrokkenheid van een aantal corticale gebieden (bijvoorbeeld de retrospleniale, postrhinal en entorhinale cortex) in hippocampus-afhankelijk leren, maar zijn beperkt in hun vermogen om de functie van een bepaald gebied te onderscheiden in afzonderlijke fasen leren 8-10. Het onderhavige protocol test de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor stimulus-stimulus leren door silencing de RSC tijdens een fase van een 3-fasen sensorische preconditionering paradigma 11,12. In het kort, ratten infusies krijgen van een AAV dat de ontwerper receptor bevat en ~ 3 weken later toegediend de ontwerperdrug (CNO) 30 minuten voor aanvang van gedragsonderzoek. In het huidige protocol, experimentele ratten ontvangt CNO tijdens de eerste fase van het testen (als stimulus-stimulus learning optreedt) en ze het voertuig ontvangt gedurende de volgende 2 fasen van het testen. Om te controleren voor onbedoelde effecten van CNO op het gedrag, bezielen ratten met de ontwerper receptor (hM4Di) en injecteren met het voertuig in plaats van CNO. Om rekening te houden algemene gevolgen van virale infusie en receptor expressie, trekken een controlevirus dat de ontwerper receptor bevat en beheren CNO. Een aantal verschillende serotypen van AAV worden gebruikt om genetisch materiaal. De huidige NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant of synthetische moleculen stelt dat AAV (alle serotypes) en recombinant of synthetische AAV constructen, waarbij het transgen niet of potentieel tumorigene genproduct of een toxine molecuul coderen en worden geproduceerd in afwezigheid van een helper virus, vereisen BSL-1 voorzorgsmaatregelen (Bijlage B-1. Risk Group 1 (RG1) gemachtigden) 13. Een aantal beoordelingen met betrekking tot de AAV structuur, het nut en de veiligheid zijn beschikbaar 14,15. Opmerkelijk is dat de, Als gevolg van bezorgdheid met betrekking tot mogelijke reproductie 16,17 potentiële carcinogene mechanismen 18-20 in knaagdieren, sommige instellingen vereisen het gebruik van BSL-2 bij het ​​werken met AAV. Controleer de juiste BSL voor gebruik door overleg met de commissies van toezicht op individuele instellingen waar het onderzoek zal worden uitgevoerd, de Centers for Disease Control en de NIH richtlijnen voor onderzoek met recombinant DNA-moleculen 13 bij het ​​gebruik van virale vectoren voor genetische manipulatie in de Verenigde Staten. Persoonlijke bescherming, onderzoeker opleiding, vector insluiting, ontsmetting, de verwijdering van ontsmet materialen, en post-injectie dierverblijven eisen worden gespecificeerd door deze richtlijnen. Bovendien, raadplegen en geschikte Institutional Animal Care en gebruik richtlijnen comité of gelijkwaardige richtlijnen institutionele commissie van toezicht op de veilige behandeling, het beheer en de verwijdering van AAV waarborgen.

<table><tbody><tr><td>Male, Long Evans Rats, 55-60 days old</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Let op: Dit is een BSL-1-verbinding</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Let op: Dit is een BSL-1-verbinding</td></tr><tr><td>Clozapine-N-oxide</td><td>R&amp;D Systems</td><td>4936-10</td><td>Designer drug</td></tr><tr><td>Rat Cage lid (polycarbonate)</td><td>Alternative Design&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Wordt gebruikt om dierenkooien 48-72 uur na infusie te bedekken</td></tr><tr><td>Filter paper (vervanging)</td><td>Alternative Design</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Filterpapier dat bij kooideksels hoort</td></tr><tr><td>Tabelklem</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Voor het vasthouden van microscentrifugebuizen met AAV in de kap</td></tr><tr><td>Biogevaar afvalzakken</td><td>Staples</td><td>113444</td><td>Medline biogevaar lijnen</td></tr><tr><td>Biogevaar afvalbak</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>United Solutions 34 gallon rechthoekige wielen vuilnisbak met haak en vergrendeling handvat</td></tr><tr><td>Isofluraan, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anesthesie</td></tr><tr><td>Dual kleine dier stereotaxische met digitale weergave console</td><td>David Kopf</td><td>Model 942</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Niet-breuk oor bars, set van 2 (rat)</td><td>David Kopf</td><td>Model 955</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Anesthesie masker (rat)</td><td>David Kopf</td><td>Model 906</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Hoge snelheid stereotaxische boor omvat tafeltop motor controller, voetpedaal, handgreep, stereotaxische handgreep houder</td><td>David Kopf</td><td>Model 1474</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Microdrill boorkoppen, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Chirurgische levering</td></tr><tr><td>Automatische spuitpomp met micro4 controller</td><td>David Kopf</td><td>Model UMP3-1</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Pro-dier afneembare keramische blad clipper kit</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Chirurgische levering</td></tr><tr><td>Betadine huidreiniger</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Chirurgische levering</td></tr><tr><td>Drievoudige antibiotische zalf</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Chirurgische levering</td></tr><tr><td>Puralube dierenarts zalf</td><td>Alleen Veterinary Supply</td><td>17033-211-38</td><td>Chirurgische levering</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>Microscoop</td><td>AD7013MTL</td><td>Een alternatief voor de traditionele dissectiescoop</td></tr><tr><td>Dino-lite stijve tafel-top boom stand</td><td>Microscoop</td><td>MS36B</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>28 G 10 μl spuit</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Chirurgische apparatuur</td></tr><tr><td>Extra hoge MDF geluid demping cubicle</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' W x 22' H x 16' D</td></tr><tr><td>Extra hoge modulaire testkamer</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Roestvrij stalen roostervloer</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Huislicht</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Gebruikt als de huislicht en stimulus licht</td></tr><tr><td>Modulaire pellet dispenser</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Pellet ontvangstbak, beker type</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Hoofd invoer detector voor rat</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Stofvrije precisie voedsel pellets, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Gedragsvoorraad</td></tr><tr><td>Cage luidspreker voor rat kamer</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Programmeerbare audio generator</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Smart ctrl 8 ingang/16 uitgang pakket</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Grote tafel-top kast en voeding</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>PCI interface pakket</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>MED Intel core computer pkg met X Pro 19" monitor</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Gedragsapparatuur</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (grannular), 1 kg</td><td>Electron Microsopy Sciences</td><td>19210</td><td>Gevaar: kankerverwekkend, wegen in kap</td></tr><tr><td>Konijn monoklonaal antilichaam (HA-Tag)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3724S</td><td>Histologie reagens</td></tr><tr><td>XP Konijn monoklonaal antilichaam (GFP)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2956S</td><td>Histologie reagens</td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4412S</td><td>Histologie benodigdheden</td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>Histologie benodigdheden</td></tr></tbody></table>

een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in knaagdieren tijdens discrete fasen van het leren

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand zwijgen in discrete hersengebieden terwijl dieren zijn betrokken bij leren en geheugen taken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-receptoren-Uitsluitend-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedrags-paradigma (zintuiglijke preconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen de verschillende vormen van leren. Specifiek wordt viraal-bemiddelde aflevering gebruikt om een ​​genetisch gemodificeerde remmend G-proteïne gekoppelde receptor (de ontwerpers receptor) in een afzonderlijk gebied van de hersenen bij knaagdieren tot expressie. Drie weken later, wanneer ontwerper receptor expressieniveaus zijn hoog, een farmacologisch middel (de ontwerpers Drug) wordt systemisch toegediend 30 min vóór een bepaalde gedrags-sessie. Het geneesmiddel heeft affiniteit voor de ontwerper receptor en dus resulteert in remming van neuronen die de ontwerper receptor tot expressie maar anderszins biologisch inert. De hersenen regio blijft zwijgen voor 2-5 uur (afhankeding van de dosis en wijze van toediening). Na voltooiing van de gedrags- paradigma wordt hersenweefsel beoordeeld op correcte plaatsing en receptor expressie. Deze benadering is bijzonder nuttig voor het bepalen van de bijdrage van afzonderlijke hersengebieden bepaalde onderdelen van gedrag en kan worden gebruikt in willekeurig aantal gedragsparadigma&#39;s.

Behavioral resultaten Na voltooiing van het experiment, zou de doeltreffendheid van de regiospecifieke tijdelijke inactivatie kwantitatief en kwalitatief worden beoordeeld. Het onderhavige voorbeeld heeft betrekking op een 3-fasen behavioral paradigma (sensorische voorconditionering), waarbij CNO werd toegediend aan neurale activiteit in de RSC verzwakken Tijdens de voorbereiding heeft tot de hypothese dat de RSC noodzakelijk voor de vorming van associaties tussen neutrale stimuli 12...

Dit protocol beschrijft hoe neuronale activiteit tijdelijk en op afstand kan worden uitgeschakeld in discrete hersengebieden terwijl ratten bezig zijn met leren en geheugentaken. De aanpak combineert farmacogenetica (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) met een gedragsparadigma (zintuiglijke voorconditionering) dat is ontworpen om onderscheid te maken tussen verschillende componenten van leren.

Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

Het doel van deze procedure is om neuronale activiteit in specifieke hersengebieden tijdelijk en op afstand te onderdrukken terwijl dieren betrokken zijn bij leer- en geheugentaakten. Dit wordt bereikt door eerst een a a V die een designerreceptor en een reporter bevat in een injectiespuit te laden voor infusie. De tweede stap is het infuseren van a a V in het betreffende gebied van de rattenhersenen.Vervolgens worden het biologisch inerte designerdrug clozapine en oxide klaargemaakt en systemisch in de rat geïnjecteerd. De laatste stap is het uitvoeren van gedragstesten met behulp van een sensorisch preconditioning-paradigma. Tot slot wordt immunofluorescentiemicroscopie op het hersenweefsel van de rat gebruikt om de plaatsing van de designerreceptor te verifiëren.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de gedragsneurowetenschappen, waaronder maar niet beperkt tot de regulatie van motivatie, aandacht, en leren en geheugen. Zorg ervoor dat alle institutionele voorzorgsmaatregelen voor het werken met adeno-geassocieerde virussen gedurende het gehele proces worden nageleefd; het virus dat in deze video wordt gebruikt, is geclassificeerd als een biosafety level 1-verbinding. Bereid een 10% bleekoplossing voor. Voor het decomprimeren van a v-afval: plaats een bekerglas met bleekoplossing en een steriele 10 µL spuit klaar.Plaats in de werkruimte de microcentrifugebuis met een aliquot van een A v in een standaard bankschroef. Vul een spuit van 10 µL met ten minste 4 µL van een A v. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de 4 µL van de a a v-oplossing. Gooi de lege virusbuis uit de spuit in de beker met 10% bleekmiddel.Voeg extra 10% bleek toe aan de afvalcontainer en laat het afval 30 minuten staan voordat het gedecontamineerde vloeibare afval wordt afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen. Bereid het operatiegebied voor door absorberend benchpapier onder het stereotaxische apparaat en op een aangrenzende ruimte aan te brengen die is aangewezen als speciaal gebied voor de hantering van virussen. Na het induceren van de anesthesie werd 3% isofluraan en zuurstof toegediend met een debiet van één liter per minuut.Scheer de vacht weg tussen de ogen en tot net achter de oren. Plaats de rat na het scheren drie minuten terug in de inductiekamer, terwijl de rat is vastgezet in een stereotaxisch apparaat. Bedek de ogen met oogzalf en bereid de incisieplaats voor door deze te reinigen met Betadine.Maak een mediane incisie van 2,4 centimeter in de huid over de schedel, beginnend ongeveer twee millimeter caudaal ten opzichte van de ogen, retracteer de huid om de schedel bloot te leggen en verwijder vervolgens het vliesweefsel van de schedel totdat bgma en lambda duidelijk zichtbaar zijn. Nadat is vastgesteld dat de schedel vlak ligt, wordt de boor bij bgma geplaatst, worden de coördinaten op nul gezet en wordt de boor vervolgens naar de gewenste mediale, laterale en anterieur-posterieure coördinaten verplaatst. Boor een gat met een boor van 0,9, 0,7 of 0,5 millimeter.Stel de infusiepomp zo in dat het virus met een snelheid van 0,2 µL per minuut wordt toegediend. Plaats de spuit in de infusiearm van het stereotaxische apparaat en laat de spuit zakken naar de gewenste coördinaat. Gebruik de pomp om de gewenste hoeveelheid virus toe te dienen nadat de toediening van de virussen is voltooid.Laat de spuit 10 minuten op zijn plaats staan om terugstroom in het kanaal van de naald te voorkomen; til de spuit vervolgens langzaam op met een snelheid van ongeveer vijf millimeter per minuut. Ga daarna naar de volgende coördinaat en herhaal de procedure totdat alle coördinaten zijn geïnfuseerd met een a v. Nadat de wond is gesloten en postoperatieve analgesie is toegediend volgens het goedgekeurde protocol, wordt de rat in een schone kooi geplaatst met strooisel, een deksel en de juiste markering.Wanneer de rat volledig is bijgekomen uit de anesthesie, dient deze teruggeplaatst te worden in de verblijfruimte. Wacht drie weken of langer voordat de gedragstests worden gestart om een adequate expressie van de designer-receptor te waarborgen. Deze figuur toont de drie fasen van het sensorische preconditioneringsparadigma: de preconditioneringsfase, de conditioneringsfase en de testfase.Het designer-geneesmiddel clozapine-N-oxide of CNO wordt gebruikt om neurale activiteit te onderdrukken. Door de designreceptor te activeren, kan CNO vóór elke testfase worden geïnjecteerd. Hier wordt CNO 30 minuten vóór elke preconditioneringssessie geïnjecteerd. Nadat een verse oplossing van 1 mg/mL clozapine-N-oxide is bereid, volgens de instructies in het geschreven gedeelte van het protocol, wordt de CNO intraperitoneaal geïnjecteerd in een dosis van 1 mg/kg, 30 minuten vóór de gedragstesten.Start de computercode voor de betreffende gedragssessie. Plaats de ratten na 30 minuten in de testkamers en begin de eerste van 4 preconditioneringssessies van 64 minuten door de ratten 12 gemengde trials te presenteren, bestaande uit het afspelen van auditieve en visuele stimuli. Presenteer bij zes van de trials een toon, de preconditioneringsstimulus, gedurende 10 seconden, direct gevolgd door een presentatie van vijf seconden van de flitsende lichtstimulus bij de overige zes trials.Presenteer de witte ruis, de niet-uitgezonden stimulus, gedurende 10 seconden. Begin na voltooiing van de preconditioneringsfase met de conditioneringssessies, die gedurende vijf opeenvolgende dagen worden uitgevoerd. Presenteer de ratten acht trials die bestaan uit het toedienen van de visuele stimulus, het knipperende licht gedurende vijf seconden, direct gevolgd door de toediening van 2 45 milligram voedselpellets.Voeg ditmaal inter-trial-intervallen van zeven minuten toe wanneer de conditionering sessies zijn voltooid. Voer de enkele testsessie van 78 minuten uit door de ratten 12 gemengde trials aan te bieden die uitsluitend bestaan uit het afspelen van de auditieve stimuli. In zes van de trials.Presenteer de toonstimulus, de preconditioneringsstimulus, gedurende 10 seconden. In de overige zes trials wordt het witte ruisgeluid, de ongepaarde stimulus, gedurende 10 seconden gepresenteerd. Verwijder de ratten direct na voltooiing van de gedragstaak uit de kamers en plaats ze terug in de dierkolonie.Analyseer de gegevens van de conditionerings- en testfase volgens de gedetailleerde instructies in het geschreven gedeelte van het protocol. Nadat immunohistochemie is uitgevoerd gericht tegen de getagde reporter of het reportereiwit, worden de gekleurde coupes microscopisch onderzocht om de locatie en expressie van de designer-receptor en/of reporter vast te stellen. Zoals verwacht leerden zowel de controle- als experimentele ratten tijdens de conditioneringssessies de Pavloviaanse associatie tussen de flitsende lichtstimulus en het voedsel.Sessies, beide groepen waren ook gemotiveerd om voedselbeloningen te verkrijgen tijdens de conditioneringssessie. In tegenstelling hiertoe slaagden de experimentele ratten tijdens de kritieke testsessie er niet in om onderscheid te maken tussen de vooraf geconditioneerde en de niet-gepaarde auditieve stimuli, terwijl de controleratten een sterker voedselkopgedrag vertoonden als reactie op presentaties van de vooraf geconditioneerde stimulus. Bijgevolg vertoonden de controleratten, maar niet de experimentele ratten, het effect van sensorische preconconditionering.Deze afbeelding toont de histologische verificatie van de locatie van een infusie in het doelgebied van het knaagdierenbrein na de ontwikkeling ervan. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen om de bijdragen van specifieke hersengebieden en/of celtypen aan complex gedrag in vivo te onderzoeken.

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

In dit rapport presenteren we een volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdig systeem dat in staat gelijktijdig testen van multi-cognitief gedrag en het opnemen van neuronale activiteiten voor knaagdieren.

Een Volledig geautomatiseerd en zeer veelzijdige systeem voor het testen van meerdere cognitieve functies en opnemen Neuronale Activiteiten in Knaagdieren

Place an anesthetized neonatal pup on a heating pad.Disinfect the scalp with ethanol.Fill a syringe with a viral solution containing adeno-associated viruses carrying the gene for a drug-activated inhibitory receptor and a tracking dye.Align the syringe tip with the pup’s head and slowly inject the virus into the brain for even distribution.Allow the pup to recover.During incubation, viral particles enter neurons and release their genetic material into the nucleus.It leads to inhibitory...

Chemogenetic Silencing of Neuronal Activity in a Neonatal Mouse

Source: Lai, J., et al. Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates a microinjection-based technique for simultaneous neuronal recording and inhibition in the rat superior colliculus. The procedure involves stereotaxic targeting, skull drilling, and the insertion of an injectrode, which delivers an inhibitory neurotransmitter while recording neuronal activity. Light stimulation evokes...

Inhibition of Neuronal Activity and Its Detection Using Electrophysiology in a Rat

Voorgesteld wordt een volledig geautomatiseerd protocol voor knaagdieren operante conditionering. Het protocol is gebaseerd op nauwkeurige tijdelijke controle gedrags gebeurtenissen in hoeverre dit besturingselement beïnvloedt hersenactiviteit onderliggende sensorimotorische integratie en cognitieve controle-experimenten onderzocht.

Een volledig geautomatiseerde Knaagdieren Conditioning Protocol voor Sensomotorische Integratie en cognitieve controle-experimenten

Het leren van nieuwe stimulus-respons associaties aangrijpt diverse neurale processen die uiteindelijk terug in veranderen piek aan afzonderlijke neuronen. Hier beschrijven we een gedrags-protocol waardoor de continue registratie van de single-neuron activiteit terwijl dieren verwerven, doven, en opnieuw op te pakken een geconditioneerde respons binnen een enkele experimentele sessie.

Opnemen Single Neuronen &#39;actiepotentialen van vrij bewegende Duiven over drie stadia van het leerproces

Hier maken we een glazen pipette met twee functies: remming van diepe hersenstructuren door micro-injecties van geneesmiddelen en real-time monitoring van hun effecten door gelijktijdige elektrofysiologische opnames.

Gelijktijdig Elektrofysiologische opname en Micro-injecties van remmende middelen in de knaagdierhersenen

Shuttle-box vermijdingsleren is goed opgericht in behavioral neurowetenschappen. Dit protocol beschrijft hoe shuttle-learning in knaagdieren kan worden gecombineerd met locatie-specifieke elektrische intracorticale microstimulatie (ICMS) en gelijktijdige chronische in vivo opnames als een instrument om meerdere aspecten van leren en perceptie bestuderen.

Gecombineerd Shuttle-Box Training met Elektrofysiologische Cortex opnemen en stimulatie als een instrument om Perception en learning studie

Nervus vagus stimulatie (NVS) heeft ontpopt als een instrument om gerichte synaptische plasticiteit induceren in de voorhersenen tot een reeks van gedragingen te wijzigen. Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van VNS aan de consolidatie van de angst uitsterven geheugen te vergemakkelijken.

Nervus Vagus Stimulatie als een Tool om plasticiteit te induceren in Pathways Relevant voor Extinction Learning

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Het ontwerp en de assemblage van microdrives in vivo elektrofysiologische opnames van hersenen signalen van de muis beschreven. Door het aanbrengen van micro-elektrode bundels aan stevige driveable dragers, deze technieken zorgen voor langdurige en stabiele neurale opnames. Het lichtgewicht ontwerp zorgt voor onbeperkte gedrags prestaties door het dier volgende station implantatie.

Bouw van Microdrive Arrays voor Chronische Neurale Recordings in Awake Behaving Muizen

Leer neurale activiteit op afstand te onderdrukken in ratten tijdens leer- en geheugentaken met farmacogenetica. Deze methode onthult de rol van specifieke hersengebieden in leerprocessen.

Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

Meer video's verkennen