Een methode voor het op afstand zwijgen neurale activiteit in Knaagdieren Tijdens Discrete Fasen van het Leren

Het doel van deze procedure is om tijdelijk en op afstand neuronale activiteit in discrete hersengebieden te dempen terwijl dieren bezig zijn met leren en geheugentaken. Dit wordt bereikt door eerst een V die een ontwerpreceptor en een reporter bevat in een spuit te laden voor infusie. De tweede stap is om een V in het gebied van belang in de rattenhersenen te infunderen.

Vervolgens wordt het biologisch inerte ontwerpgeneesmiddel clozapine en oxide bereid en systemisch in de rat geïnjecteerd. De laatste stap is het uitvoeren van gedragstesten met behulp van een sensorische voorwaardelijke paradigma. Uiteindelijk wordt immunofluorescentiemicroscopie op het rattenhersenweefsel gebruikt om de plaatsing van de ontwerpreceptor te verifiëren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van gedragsneurowetenschap, inclusief maar niet beperkt tot regulatie van motivatie, aandacht en leren en geheugen. Zorg ervoor dat alle institutionele voorzorgsmaatregelen voor het werken met adeno-geassocieerde virussen worden gevolgd, aangezien het virus dat in deze video wordt gebruikt, is geclassificeerd als een bioveiligheidsniveau één-verbinding. Bereid een 10% bleekmiddeloplossing voor. Voor het ontsmetten van een a v-afvalplaats, een bega met bleekmiddeloplossing en een steriele 10 microliter spuit.

Plaats in de werkruimte de microcentrifugebuis met een aliquot van een a v in een standaard bankklauw. Laad een 10 microliter spuit met minimaal vier microliters van een a v. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn in de vier microliters van de a a v-oplossing. Gooi in de spuit de lege virusbuis in de beker met 10% bleekmiddel.

Voeg extra 10% bleekmiddel toe aan de afvalcontainer en laat het afval gedurende 30 minuten staan voordat het ontsmette vloeibare afval wordt weggegooid zoals gespecificeerd in de institutionele richtlijnen. Bereid het operatiegebied voor door absorberend tafelpapier onder het stereotactische apparaat te plaatsen en op een aangrenzende ruimte die is aangewezen als een speciale virusverwerkingsruimte. Nadat de anesthesie werd geïnduceerd met 3% isof, fluor en zuurstof met een snelheid van één liter per minuut.

Scheer het haar tussen de ogen tot net achter de oren. Na het scheren plaatst u de rat terug in de inductiekamer voor drie minuten met de rat vastgezet in een stereotactisch apparaat. Bedek de ogen met oftalmisch zalf en bereid de snedeplaats voor door te reinigen met Betadine.

Na het maken van een 2,4 centimeter middelste incisie van de huid, die de schedel bedekt, beginnend ongeveer twee millimeter cordaal ten opzichte van de ogen, trekt u de huid terug om de schedel bloot te leggen en verwijdert u het membraanachtige weefsel van de schedel tot bgma en lambda duidelijk zichtbaar zijn. Zorg ervoor dat de schedel vlak is, plaats de boor op bgma, zet de coördinaten op nul en verplaats vervolgens de boor naar de gewenste mediale, laterale en anterior-posterior coördinaten. Boor een gat met een 0,9, 0,7 of 0,5 millimeter boortje.

Stel de infuuspomp in om het virus te leveren met een snelheid van 0,2 microliter per minuut. Plaats de spuit in de infuusarm van het stereotactische apparaat en laat de spuit zakken naar de gewenste coördinaat. Gebruik de pomp om de gewenste hoeveelheid virus te leveren nadat de levering van virussen is voltooid.

Laat de spuit 10 minuten op zijn plaats om terugstroming in de naald te voorkomen, trek de spuit langzaam omhoog met een snelheid van ongeveer vijf millimeter per minuut. Ga vervolgens naar de volgende coördinaat en herhaal de procedure totdat alle coördinaten zijn geïnfundeerd met een a v. Na het sluiten van de wond en het bieden van postoperatieve pijnverlichting volgens het goedgekeurde protocol, plaatst u de rat in een schone kooi met beddengoed, een deksel en de juiste bewegwijzering.

Wanneer de rat volledig is hersteld van de anesthesie, brengt u hem terug naar de huisvestingskamer. Wacht drie of meer weken voordat u begint met gedragstesten om een adequate expressie van de ontwerpreceptor te garanderen. Deze figuur toont de drie fasen van het sensorische voorwaardelijke paradigma, de voorwaardelijke fase, de conditioneringsfase en de testfase.

Het ontwerpgeneesmiddel, clozapine en oxide of CNO, wordt gebruikt om neurale activiteit te dempen. Door de ontwerpreceptor te activeren, kan CNO worden geïnjecteerd vóór elke fase van de test. Hier wordt CNO 30 minuten vóór elk van de voorwaardelijke sessies geïnjecteerd. Na het bereiden van een verse oplossing van één milligram per milliliter clozapine en oxide, volgens de instructies in het schriftelijke deel van het protocol, injecteert u de CNO intraperitoneaal met een dosis van één milligram per kilogram 30 minuten vóór het gedragsonderzoek.

Start de computercode voor de juiste gedragssessie. Nadat 30 minuten zijn verstreken, plaatst u de ratten in de testkamers en begint u de eerste van 4 64 minuten voorwaardelijke sessies door ratten te presenteren met 12 onderling gemengde proeven die bestaan uit het leveren van auditieve en visuele stimuli. Bij zes van de proeven presenteert u een toon, de voorwaardelijke stimulus gedurende 10 seconden, gevolgd door onmiddellijk een vijf seconden durende presentatie van de lichtflitser stimulus. Bij de andere zes proeven.

Presenteer het witte ruis, de niet-gepaarde stimulus gedurende 10 seconden. Na voltooiing van de voorwaardelijke fase, begint u met de conditioneringssessies, die gedurende vijf opeenvolgende dagen worden uitgevoerd. Presenteer de ratten met acht proeven die bestaan uit het leveren van de visuele stimulus, de lichtflitser gedurende vijf seconden, gevolgd door onmiddellijk de levering van 2 45 milligram voedselkorrels.

Deze tijd omvat inter-proef intervallen die zeven minuten duren wanneer de conditioneringssessies zijn voltooid. Voer de enkele 78 minuten durende testproef uit door de ratten te presenteren met 12 onderling gemengde proeven die bestaan uit het leveren van de auditieve stimuli alleen. Bij zes van de proeven.

Presenteer de toonstimulus, de voorwaardelijke stimulus alleen gedurende 10 seconden. Bij de andere zes proeven presenteert u het