Name: Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Leer circulerende tumorcellen isoleren en kweken uit muizenbloed met hepatocellulair carcinoom. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar kankermetastase en klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het laboratorium van Dr. Ogunwobi wordt ondersteund door een Research Centers in Minority Institutions Program-subsidie van het National Institute on Minority Health and Health Disparities (MD007599) van de National Institutes of Health. De inhoud van dit manuscript valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële opvattingen van de NIMHD of de NIH.

Ethiek Verklaring: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Hunter College van de City University van New York. 1. Pre-experiment Procedures <ol><li> Bij aankomst in het dierverblijf aanvankelijk huis 3 BALB / c muizen een kooi met een gefilterde top en houtsnippers beddengoed. Zorg ervoor dat de muizen hebben gratis toegang tot voedsel, Purina knaagdieren voer en water. Beddengoed en voedsel moet tweemaal per week worden gewijzigd terwijl kooien keer per week worden schoongemaakt. </li><li> Induceren algemene anesthesie bij muizen met behulp van een isofluraan vaporizer samen met zuurstof bij een constante snelheid van 1 liter per minuut. Het systeem is zelfstandig en heeft een precisie vaporizer. </li><li> Positie dier in een plastic doos die de nauwkeurigheid verdamper en gas / anesthesiesysteem aangesloten is. Aanvankelijk de verdamper tot 2,5 tot dier bewusteloos is, op welk punt lager de verdamper 2. </li><li> Op dat moment, schakelt deklep lijn, afdichting aan de doos en het openen van de neuskegel. </li><li> Beweeg het dier naar de bereidingszone, de neuskegel correct opgesteld en aangesloten (onderhoud anesthesie). </li><li> Bereid 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muis HCC cellen voor implantatie per muis. BNL 1ME A.7R.1 moeten groeien in medium (10% hitte-geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) incuberen in een celkweek schaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% CO 2. </li><li> Met een spuit met een 20 G naald implantaat 100 pl PBS dat 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 muis hepatocellulaire carcinoomcellen in een kwab van de lever van BALB / c muizen om de primaire tumoren. Na implantatie, het huis van de BALB / c muizen in een kooi met hetzelfde huis voorschriften als pre-implantatie. </li><li> Aan het experimentele eindpunt klinisch bewijs van hepatocellulaire carcinoom is waarneembaar als significante vermindering van lichaamsconditiescore (meestal ontdekt na 4 weken). Op dit punt is er een kans dat primaire tumoren ontwikkeld in de lever, terwijl metastatische afzettingen in de longen hebben gevormd. Daarna begint het proces van de isolatie en vermeerdering van circulerende tumorcellen. </li></ol> 2. Verzameling van volbloed voor het circuleren van Tumor Cell Isolation LET OP: Goed sanitized de operatie gebied en zorg ervoor dat het rommel-vrij. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten of weken in een desinfecterend middel volgens de aanbevelingen van de fabrikant <ol><li> Offer muizen door humane euthanasie bij experimentele eindpunt (klinisch bewijs van de ontwikkeling van tumoren). Euthanization muizen moeten CO 2 stikken betrekken. Neem de muizen naar behoren anesthesie bevestigen dat juist verdeeld. Kooldioxide dient langzaam vrijkomen in de kamer gedurende 5 - 10 min, waardoor ademhalingsstilstand. Volg door intracardiale verbloeding en cervicoal dislocatie. 5 </li><li> Gebruik van een 25 G naald bevestigd aan een injectiespuit 1 ml voor het verzamelen van bloed. Heparanize de spuit met 0,01 ml heparine. Punctie de huid onmiddellijk met de naald inferieur aan de xyphisternum bij ongeveer 45 ° hoek. Advance naald langzaam naar het hart doorboren, en vervolgens de hoek van de naald. Gestaag Houd de naald en spuit in de plaats, en trekken uit 500 ul - 1000 pi volledig bloed uit het hart. </li><li> Verwijder de spuit en naald en bloed over in een gelabelde 1,5 ml pyrogeenvrij buis. Centrifugeer de volbloed in 1,5 ml pyrogeenvrij buis verzameld op 1167 g gedurende 5 min. Opmerking: De centrifugatie scheidt het monster van compleet bloed in drie lagen: de onderste laag bestaande of hematocriet van rode bloedcellen, een tussenliggende dunne laag buffy coat en een bovenste plasmalaag. </li><li> Verwijder de plasma voorzichtig door pipetteren en het verzamelen van het in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeen-vrij buis Further experimenten zoals detectie van celvrije nucleïnezuren 7. </li><li> Voor isolatie van circulerende tumorcellen (CTCs), verzamelt de bufferlaag in een afzonderlijke 1,5 ml pyrogeenvrij buis voorbereiding voor rode bloedcellen (RBC) lysis. Dit is noodzakelijk om resterend RBC in de buffy coat laag te verwijderen. </li></ol> 3. Recept voor rode bloedcellen (RBC) Lysis Buffer <ol><li> Maak een 1 L oplossing van RBC lysis buffer. </li><li> Wordt 500 ml ammoniumchloride en 500 ml Tris. Meng een 1 L oplossing van RBC lysis buffer te creëren met een eindconcentratie van 155 mM ammoniumchloride en 10 mM Tris. </li><li> Buffer de oplossing een pH van 7,5. Bewaar de RBC lysis buffer bij 2 tot 8 ° C en breng tot kamertemperatuur onmiddellijk voor gebruik. </li></ol> 4. RBC Lysis van Buffy Coat <ol><li> Voeg 1 ml RBC lysis buffer om de steriele pyrogeenvrije 1,5 ml buis die de verzamelde buffy coat. </li><li> Meng de inhoud van de buis doorinverterende meerdere keren. Incubeer de gemengde inhoud van de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op de bank. Centrifugeer de gemengde inhoud gedurende 5 min bij 1167 x g. </li><li> Na centrifugeren wordt een witachtige korrel verkregen. Gooi de roodachtige supernatant langzaam en voorzichtig in 10% bleekmiddel, zonder verstoring van de pellet. Als de pellet is niet witachtig, re-do stappen 3,1-3,5. Het verhogen van de incubatietijd in RBC lysis buffer om 10 - 15 min kunnen eveneens nuttig zijn. </li><li> Veilig verwijderen van de biologisch afval eenmaal ontsmetting van biologisch afval in 10% bleekwater is voltooid na 24 uur. </li></ol> 5. Vermeerdering in celkweek OPMERKING: Tumorcellen worden meestal snel groeiende cellen witte bloedcellen die overvloedig in de oorspronkelijke combinatie van cellen gezaaid in de schaal zijn. Na herhaalde verandering van medium en daaropvolgende passages van CTCs, worden alle witte bloedcellen verwijderd en een relatief zuivere populatie van CTCs blijft. <ol><li> Naweggooien van het supernatant tot 10% bleekmiddel, was de witachtige pellet in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ten minste eenmaal, en resuspendeer in volledig kweekmedium voor propagatie in celcultuur. </li><li> Was eenmaal is voltooid, voeg 1 ml compleet BNL 1ME A.7R.1 kweekmedium (10% door warmte geïnactiveerd FBS, 1% penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine) aan de pellet en resuspendeer de pellet in het kweekmedium. </li><li> Zaad de geresuspendeerde mix van cellen in een celkweek schotel. Incubeer de celkweekschaal bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% CO2. </li><li> Verander het celkweekmedium elke 2-3 dagen. Na vijf tot zeven dagen, zal CTC&#39;s hebben gehandeld op grond van de celkweek gerecht en begonnen prolifererende. Deze cellen zullen levensvatbaar dan 25 passages en na herhaalde bevriezen en ontdooien cycli 5 blijven. </li></ol> 6. Keuring van Hepatocellulair Carcinoom doorgeven tumorcellijn <ol><li> Voeren apolymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde methode slechts één specifieke DNA segment van het muizen β-globine-gen te amplificeren om te bevestigen dat de nieuwe CTC vastgestelde cellijnen muizencellen zoals de oorspronkelijke geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 HCC lijn. Methode werd oorspronkelijk beschreven en gevalideerd door Steube et al. 5,8 </li><li> Voer immunokleuring van de hepatocyt-specifieke marker cAMP responsief element bindingseiwit 3-achtige 3 (CREB3L3) door een specifiek antilichaam. Dit zal dat nieuwe gevestigde CTC inderdaad hepatocyten als het origineel geïmplanteerde BNL 1ME A.7R.1 cellijn te bevestigen. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In deze studie is beschreven hoe CTC's geïsoleerd en gepropageerd kunnen worden uit het gehele bloed van een syngene muis met HCC. Het doel van dit werk is om de lopende studies naar de mechanismen van kankermetastase te verbeteren.
Een factor die bijdraagt aan de slechte prognose van veel kankers is het ontbreken van tijdige detectie en de daaruit voortvloeiende wijdverspreide verspreiding van de maligniteit3. CTC's komen voort uit primaire kankers en verspreiden zich via de bloedb...

De kankeronderzoeksgemeenschap is al bekend met het bestaan van circulerende tumorcellen (CTC's) sinds ze voor het eerst werden waargenomen door Thomas Ashworth in 18691. Sindsdien is aangetoond dat CTC's belangrijk zijn voor tumormetastase en ziekteprogressie2-5. Tegenwoordig zijn solide tumoren een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CTC's zijn zeldzame cellen die afkomstig zijn van primaire tumoren en door de bloedbaan naar verschillende organen reizen, waarvan slechts een klein deel uiteindelijk uitgroeit tot metastasen2-5. Opmerkelijk is dat er een positieve correlatie bestaat tussen tumorgrootte en het aantal CTC's3,4.
Een beter begrip van de biologie van CTC's kan bijdragen aan de zoektocht naar gerichte therapie. Bovendien kunnen CTC's diagnostische toepassingen hebben. Om deze potentiële klinische toepassingen te bereiken, moeten enkele huidige uitdagingen bij het bestuderen van CTC's worden overwonnen. Een uitdaging houdt verband met het feit dat CTC's aanwezig kunnen zijn als enkele cellen of als clusters en ze mogelijk zelfs hun fenotype kunnen veranderen als reactie op de bloedomgeving2. Bovendien kan detectie erg uitdagend zijn, deels vanwege het lage aantal CTC's (enkele tot honderden per milliliter) onder één miljard hematologische cellen per milliliter in het bloed6. Desondanks is in de afgelopen jaren het onderzoek naar de potentiële klinische toepassingen van CTC's uit solide orgaankankers geïntensiveerd.
Ondanks deze inspanningen, blijven de uitdagingen van het bestuderen en begrijpen van de rol van CTC's bestaan vanwege de zeldzaamheid van CTC's en de ontoereikendheid van de momenteel beschikbare technologische hulpmiddelen. Ondanks deze uitdagingen, blijft het enorme potentieel voor klinische toepassingen een stimulans om onderzoek naar de rol van CTC's bij kankermetastase te bevorderen.
We waren onlangs succesvol in het isoleren en vermeerderen in celkweek van CTC's uit een orthotopisch syngene model van hepatocellulair carcinoom (HCC) metastase5. Het doel van het huidige artikel is om alle aspecten van de succesvolle methodologie in detail te beschrijven. De betekenis van deze methodologie ligt in het feit dat deze aanpak kan worden aangepast om met succes humane CTC's te isoleren en in cultuur te vermeerderen, waardoor de mogelijkheid van in vitro studies van de biologie van CTC's wordt vergroot.
Er zijn meerdere potentiële klinische toepassingen voor het gebruik van CTC's. CTC's kunnen nuttig zijn voor prognose, responsbewaking, screening, dynamische bewaking van moleculaire tumorveranderingen en gepersonaliseerde therapie4. Daarom heeft een beter begrip van de biologie van CTC's een hoog potentieel voor klinische impact.

<table><tbody><tr><td>Heparin Sodium Salt 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tube Micro 1.5 ml Clear NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1.5 ml&nbsp; pyrogen-vrije eppendorf buizen</td></tr><tr><td>Needle Sterile Disp BD 25 G x 1 in</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G naald</td></tr><tr><td>Slp Tip SRNG 1 ml 200 each per pack</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml spuittip</td></tr><tr><td>Syringe 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>1 ml spuit</td></tr><tr><td>VWR Forceps Tissue 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Forceps</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Glijbanen</td></tr><tr><td>VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Dekglas</td></tr><tr><td>VWR Slide Box True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Glijbanenbox</td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>PAP pen</td></tr><tr><td>Water RNASe and DNAse free 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Nuclease Vrij Water</td></tr><tr><td>Buffer Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Buffer</td></tr><tr><td>Ammonium Chloride ACS Grade 2, 5 Kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Ammonium Chloride Buffer</td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15 mm Style polystyrene</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>Weefselkwekerij Schaal</td></tr><tr><td>Clorox Germicidal Bleach, Regular</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleekmiddel</td></tr><tr><td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline) without calcium &amp; magnesium (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; with 4.5 g/L glucose &amp; L-glutamine without sodium pyruvate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x media voor BNL 1ME A.7R.1 cellen</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Penicilline Streptomycine</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>13.000 rpm Centrifuge</td></tr></tbody></table>

isolatie en voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis cancer

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Kankermetastase is de belangrijkste oorzaak van sterfgevallen geassocieerd met kanker. Recente studies hebben aangetoond dat circulerende tumorcellen (CTC's) belangrijk zijn voor kankermetastase. Inderdaad, het aantal CTC's correleert met de tumorgrootte. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een methodologie voor het isoleren en vermeerderen van CTC's uit een syngeneïsch muismodel van hepatocellulair carcinoom (HCC) die downstream-analyse van potentieel belangrijke moleculaire mechanismen van solide orgaantumormetastase mogelijk maakt. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar. Het is een niet-invasieve techniek en heeft daarom het potentieel om de invasieve biopsie van weefsels van mensen te vervangen, wat geassocieerd kan zijn met complicaties. Daarom staat de hier besproken methode de isolatie en vermeerdering van CTC's uit volbloedmonsters toe, zodat ze kunnen worden onderzocht en gekarakteriseerd. Dit heeft potentieel voor toekomstige aanpassing voor klinische toepassingen zoals diagnose en gepersonaliseerde gerichte therapie.

De hier beschreven methode heeft aangetoond dat CTCs worden geïsoleerd. Muizen werden op humane wijze gedood bij experimentele eindpunt. Het proces betrokken kooldioxide stikken, intra-cardiale leegbloeden en cervicale dislocatie. Een schema van de belangrijkste stappen van de procedure zijn weergegeven in figuur 2. Volbloedmonsters door intra-cardiale leegbloeden verzameld werden verwerkt volgens de hierboven beschreven protocol. Daarna werd centrifugeren toegepast om de buffy coat laag die werd onderw...

Circulerende tumorcellen (CTC's) hebben aangetoond een belangrijke rol te spelen bij tumormetastase. Hier wordt een methode beschreven voor het isoleren en vermenigvuldigen van CTC's uit het volledige bloed van een syngene model van muistumoren met leverkanker (HCC) metastase.

Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren en vermeerderen van circulerende tumorcellen uit het volbloed van een syngene muistumormodel met hepatocellulair carcinoom-metastasen. Dit wordt bereikt door eerst het volbloed dat van de muizen is afgenomen te centrifugeren en de buffy coat te isoleren. Vervolgens worden de rode bloedcellen in de buffy coat gelyseerd en worden de circulerende tumorcellen verzameld in een pellet.De cellen worden vervolgens gewassen, gesuspendeerd in volledig kweekmedium en vermeerderd in celcultuur. De snelgroeiende tumorcellen blijven levensvatbaar over talloze passages en kunnen worden geverifieerd met behulp van standaard moleculaire diagnostische technieken. Het belang van het isoleren van circulerende tumorcellen met onze techniek is dat het een reproduceerbaar model biedt, dat kan worden geoptimaliseerd voor potentieel gebruik in een klinische setting.Michelle Nadu, een undergraduate student uit ons laboratorium, zal de procedure met mij demonstreren. Om te beginnen wordt er volbloed geoogst van een Ciea Kamau tumormodel met hepatocellulaire carcinoommetastasen, zoals beschreven in een apart JoVE-artikel. Centrifugeer het verzamelde volbloed bij 1.167 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Zodra de lagen zijn gescheiden, wordt de bovenste plasmalaag voorzichtig verwijderd en overgebracht naar een aparte ROGEN-vrije buis van 1,5 milliliter voor verdere experimenten, zoals de detectie van celvrije nucleïnezuren. Vervolgens wordt de buffycoatlaag overgebracht naar een aparte ROGEN-vrije buis van 1,5 milliliter ter voorbereiding op de lyse van rode bloedcellen. Dit is noodzakelijk om resterende rode bloedcellen in de buffycoatlaag te verwijderen voorafgaand aan de isolatie van circulerende tumorcellen.Begin met het bereiden van een liter oplossing van rode bloedcel-lysisbuffer met een eindconcentratie van 155 millimol ammoniumchloride en 10 millimol tris. Stel de pH van de oplossing in op 7.5. Neem een aliquot van ongeveer twee tot vier milliliter uit de voorraad van één liter rode bloedcel-lysisbuffermengsel.Voeg vervolgens één milliliter van de lysisbuffer voor rode bloedcellen toe aan de buis met het verzamelde buffycoat. Meng de inhoud van de buis door deze meerdere keren om te keren. Incubeer de buis daarna vijf minuten bij kamertemperatuur op de werkbank.Centrifuge vervolgens de gemengde inhoud gedurende vijf minuten. Bij 1.167 ×g zal na centrifugatie een witachtig pellet worden verkregen. Verwijder het roodachtige supernatant langzaam en voorzichtig in 10% bleekmiddel, zonder het pellet te verstoren.Gooi de supernatant weg en was het witachtige pellet in één milliliter PBS. Centrifugeer de cellen vervolgens opnieuw tot een pellet en resuspendeer ze in compleet kweekmedium. Breng de geresuspendeerde cellen over in een celkweekschaal en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met lucht en 5% koolstofdioxide.Vervang het celkweekmedium elke twee tot drie dagen. Na vijf tot zeven dagen zullen de circulerende tumorcellen aan de kweekschaal zijn gehecht en zijn ze begonnen met te prolifereren. Om te verifiëren of de circulerende tumorcellen van het hepatocellulair carcinoom correct zijn geïsoleerd.Voer PCR uit voor een specifiek segment van het muis bèta-globinegen, zoals beschreven en gevalideerd door Stu. Kleur de cellen vervolgens immunohistochemisch met een antilichaam specifiek voor de hepatocyt-specifieke marker Cyclic AMP responsive element binding protein three like three met behulp van standaardtechnieken; hier getoond zijn representatieve afbeeldingen van circulerende tumorcellen van twee verschillende muizen.In kweek uit een orthotoop syngene muismodel van hepatocellulair carcinoom. Metastatische tumorcellen hechten aan de kweekplaat en prolifereren snel. Ze kunnen worden uitgebreid tot meer dan 25 passages en zijn bestand tegen herhaalde vries-dooi-cycli.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u levensvatbare circulerende tumorcellen kunt isoleren en propageren, en hoe u deze zowel moleculair als functioneel kunt karakteriseren.

isolation-propagation-circulating-tumor-cells-from-mouse-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

The video describes the technique for intracecal injection of cancerous cells to develop an orthotopic mouse model with highly uniform tumors. Therefore, the orthotopic mouse model allows realistic simulation of metastasis, providing a valuable tool to study the phenotype changes during tumor growth and dissemination.

Intracecal Tumor Cell Injection: A Technique to Deliver Cancer Cells for Establishing Orthotopic Colorectal Cancer Mouse Model

This video describes a detailed protocol for isolating circulating tumor cells from the whole blood sample of a euthanized colorectal tumor mouse model. These isolated CTCs can be cultured and used for intended downstream analysis.

CTC Isolation from a Whole Blood Sample: A Method to Obtain CTCs from Murine Colorectal Cancer Model

De metastatische verspreiding van kanker de belangrijkste oorzaak van kankersterfte. Wij bieden een uitgebreide beschrijving van ons overleven chirurgie methodologie voor de oprichting van een "patiënt-achtige" orthotoop syngeen muis modelsysteem voor het bestuderen van de mechanismen van metastase in vaste orgel tumoren.

Een &quot;Patiënt-Like&quot; Orthotope Syngene Mouse Model van Hepatocellular carcinoom metastase

We beschrijven een betrouwbare methode om primaire tumorspecifieke endotheelcellen te isoleren en te kweken van genetisch gemanipuleerde muismodellen.

Isolatie en Cultuur Uitbreiding van Tumor-specifieke endotheelcellen

Dit manuscript beschrijft een methode die wordt gebruikt om xenografts (PDX's) van prostaatkankerpatiënten te genereren vanuit circulerende tumorcellen (CTC's). Het genereren van PDX-modellen uit CTC's biedt een alternatief experimenteel model om prostaatkanker te bestuderen; de meest vaak gediagnosticeerde tumor en een frequente doodsoorzaak door kanker bij mannen.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

Een dierlijk model is nodig om het ontcijferen van de rol van circulerende tumorcellen (CTCs) bij de bevordering van longkanker kolonisatie tijdens kanker uitzaaiingen. Hier, we vastgesteld en met succes uitgevoerd een in vivo assay op specifiek proef de eis van polymere fibronectine (polyFN) vergadering over CTCs voor longkanker kolonisatie.

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.

Micromanipulatie van circulerende tumor cellen voor downstream moleculaire analyse en gemetastaseerde potentiële beoordeling

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare methode voor isolatie van muizen rhabdomyosarcoom primaire cellen, tumorsphere vorming en behandeling, en transplantaat transplantatie vanaf tumorspheres culturen.

Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

Het kweken van CTC's maakt een diepere functionele karakterisering van kanker mogelijk, door specifieke markerexpressie te testen en resistentie tegen geneesmiddelen en het vermogen om de lever te koloniseren te beoordelen, naast andere mogelijkheden. Over het algemeen zou de CTC-cultuur een veelbelovend klinisch hulpmiddel kunnen zijn voor gepersonaliseerde geneeskunde om de uitkomst van de patiënt te verbeteren.

Circulerende tumorcellijnen: een innovatief hulpmiddel voor fundamenteel en translationeel onderzoek

De vertaling van de bevindingen van intravitale microscopie wordt uitgedaagd door de geringe dieptepenetratie in het weefsel. Hier beschrijven we een muismodel met dorsale vensterkamer dat co-registratie van intravitale microscopie en klinisch toepasbare beeldvormingsmodaliteiten (bijv. CT, MRI) mogelijk maakt voor directe ruimtelijke correlatie, waardoor de klinische vertaling van intravitale microscopiebevindingen mogelijk wordt gestroomlijnd.

Een dorsaal huidplooi raamkamer tumor muismodel voor gecombineerde intravitale microscopie en magnetische resonantie beeldvorming in translationeel kankeronderzoek

Leer circulerende tumorcellen isoleren en kweken uit muizenbloed met hepatocellulair carcinoom. Deze reproduceerbare methode ondersteunt onderzoek naar kankermetastase en klinische toepassingen.

Isolatie en Voortplanting van circulerende tumorcellen uit een muis Cancer

Meer video's verkennen