Name: Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer de isolatie van leukocyten uit de humane decidua via mechanische en enzymatische dissociatie met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode behoudt celoppervlaktemarkers voor immunofenotypering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH / DHHS. Dit werk werd ook ondersteund, gedeeltelijk, door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. Wij dankbaar erkennen Maureen McGerty (Wayne State University) voor haar kritische lezing van het manuscript.

Dit protocol is geschikt voor leukocyt los van de decidua basalis en decidua parietalis ter voorbereiding immunofenotypering met flowcytometrie. Verder kunnen de geïsoleerde cellen worden gebruikt voor celsortering, celkweek, RNA-isolatie en cytologie. Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet de mens ethische goedkeuring worden verkregen van de lokale Research Ethics Committee en Institutional Review Boards. De verzameling en het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden werden goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), ministerie van Volksgezondheid en Human Services (DHHS , Bethesda, MD, USA) en Wayne State University (Detroit, MI, USA). Schriftelijke toestemming is verkregen van alle zwangere vrouwen voorafgaand aan het verzamelen van weefselmonsters. OPMERKING: Tijdens het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlende agenten als bedoeld in dit protocol, is het essentieel dat de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd. 1. Dissectie van de Human deciduale Tissues OPMERKING: De basale inbouwpositie bodemplaat onder en bevestigd aan de placenta en vertegenwoordigt het moederlijke oppervlak. De chorioamniotic membranen zijn de amnion en chorion. De basale plaat omvat de decidua basalis en chorion omvat de decidua parietalis (figuur 1). <ol><li> Decidua Basalis <ol><li> Ontleden een deel van de basale plaat uit één zaadlob van de placenta (Figuren 1A en 1B). </li><li> Plaats het op een steriele snijplank met de placenta villi naar boven. De zijde met de placenta villi is meestal bloedig rood met harige weefsel in uiterlijk. De basale plaat is glad en bleek rood van kleur. </li><li> Gebruik scherpe, fijne punt schaar en tang om de vill verwijderenlende weefsels en bloedvaten. Houd het weefsel gedrenkt in 1x PBS (Ca 2+ - en Mg 2+ - gratis) tijdens het proces (figuur 1C). Verzamel 2 tot 3 van deze stukken en spoel ze grondig met 1x PBS om het bloed (figuur 1D) te verwijderen. </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Ontleden een stukje chorioamniotic membranen (ongeveer 10 cm x 10 cm, Figuur 1E). Plaats het op het bord met de chorion naar boven. De chorionic kant bevat bloedige stolsels en is meestal licht gelig van kleur. </li><li> Gebruik fijne punt tang om zoveel mogelijk van de bloedstolsels te verwijderen mogelijk (figuur 1E). Spoel het membraan in steriele 1x PBS om het overtollige bloed te reinigen van het membraan totdat het 1x PBS loopt duidelijk. </li><li> Gebruik een steriele celschraper om voorzichtig schrapen de deciduale laag van het membraan. Breng steriel 1x PBS op de membrane bij het ​​invullen van dit proces (Figuur 1F). Verzamel de deciduale weefsel en plaats ze in een 50 ml plastic buis met steriel 1x PBS (figuur 1G). </li></ol></li></ol> 2. Mechanische Disaggregatie en enzymatische afbraak <ol><li> Was het weefsel losgesneden van de decidua basalis (uit stap 1.1.3) of decidua parietalis (uit stap 1.2.3) met steriele 1x PBS in een 50 ml plastic buis. Verzamel materiaal pellets door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant boven het weefsel pellet zich voorzichtig, zonder de pellet te verstoren. OPMERKING: Op dit punt, de pellets zeer losse omdat rode bloedcellen bevat. Als het volume van de pellet ongeveer of minder dan 3 ml, resuspendeer de pellet in 6 ml cel losraken oplossing voorverwarmd tot 37 ° C. Indien de pellet groter is dan 3 ml volume, voeg meer mobiele onthechting oplossing (voeg ongeveer 2 maal the volume van de weefselmonsters). </li><li> Breng de gehomogeniseerd weefsels (decidua basalis + cel onthechting oplossing of decidua parietalis + cel onthechting oplossing) om een ​​C buis. </li><li> Plaats de C buis in de automatische dissociator en voer het desbetreffende programma. OPMERKING: Het programma voor de decidua basalis loopt voor 17 sec met 668 totale rondes per run. Het programma voor de decidua parietalis loopt voor 37 sec met 235 totale rondes per run. Deze programma&#39;s zijn aangepast aan leukocyten te isoleren van de decidua basalis of decidua parietalis met goede opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> Na de mechanische disaggregatie van het weefsel, verteren van de weefsels door een commercieel verkrijgbare cel losraken oplossing zoals Accutase; (A cocktail die proteolytische en collagenolytische enzymen bevat) gedurende 45 minuten bij 37 ° C onder zacht schudden. </li></ol> 3. Isolatie van Leukocyten <ol><li> Na incubatie, voeg 10 ml van 1 x PBS om de DIGEbrande resten mengsel en doorgeven door een 100 urn zeef cel in een 50 ml plastic buis. Afhankelijk van de kleverigheid van het digestiemengsel mogelijk dat één tot enkele cel zeven gebruiken om een ​​mengsel. </li><li> De buis met 1x PBS en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de 1x PBS boven de celpellets zorgvuldig en resuspendeer de pellets met 5 ml ijskoude FACS buffer. OPMERKING: Om de polymorfonucleaire en mononucleaire leukocyten samen studeren, ga dan naar stap 6.1; aan de mononucleaire leukocyten bestuderen, verder met stap 3.3. </li><li> Voeg 5 ml van 20% dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) in een 15 ml plastic buis langzaam overlay de celsuspensie bovenop de dichtheidsgradiënt media. Hoewel lagen van het monster, is het belangrijk de dichtheidsgradiënt media niet te mengen met de celsuspensie. </li><li> Centrifugeren met een swing-out rotor bij 500 xg gedurende 30 min bij 4 ° C zonder rem. Het is belangrijk de rem uit te schakelen om te voorkomen dat het mengen van de cellen en losing het verloop. Leukocyten worden in het grensvlak tussen de dichtheidsgradiënt media en FACS buffer. </li><li> Verwijder de bovenste laag die de FACS buffer en celresten bevat zeer voorzichtig met een pipet. De band bij het grensvlak bevat deciduale mononucleaire cellen en een gedeelte van de polymorfonucleaire leukocyten. </li><li> Overdracht van de cellen op het grensvlak volledig in nieuw 15 ml plastic buis. Voeg minstens 3 maal volume van FACS-buffer. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelletiseren. Zuig het supernatant en was de cellen met FACS-buffer. Pelletiseren de cellen met andere centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Om de celkweek te voeren, zie Stap 4. Om celsortering uit te voeren, zie Stap 5. immunofenotypering voeren, zie stap 6. </li></ol> 4. Toepassingen - Celcultuur <ol><li> Resuspendeer de cellen van stap 1 in 3,7 ml RPMI 1640 kweekmedium Tel het aantal levensvatbare cellen using een automatische cel balie of een hemocytometer en een trypan blauwe oplossing 0,4%. </li><li> Tel de hoeveelheid RPMI cultuurmedium tot een celconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml te maken. De cellen zijn nu klaar voor cultuur. </li></ol> 5. Toepassingen - Isolatie van macrofagen voor Primary Cell Culture <ol><li> Om CD14 + cellen te isoleren, magnetisch labelen van de cellen van stap 3.7 met CD14 microkorrels (parels per 20 gl 10 7 cellen), incubeer 15 min bij 4 ° C en gescheiden CD14 + cellen uit andere soorten cellen door toepassing van een magnetisch veld. Na 2 wassingen met MACS buffer en verwijdering van het magnetische veld, elueren de magnetisch vastgehouden CD14 + cellen met MACS buffer. </li><li> Na centrifugatie, resuspendeer de celpellets in kweekmedium RPMI 1640. De cellen zijn klaar voor plating (figuur 2). </li></ol> 6. Toepassingen - Immuunfenotypering <ol><li> Om de cellen voor immunophenot gebruikenyping, resuspendeer de cellen van stap 3.7 in 1 ml 1x PBS. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een automatische celgetalmeter of een hemocytometer en een trypan blauwe oplossing 0,4%. </li><li> Label de cellen met een fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (Figuur 3). Was de cellen tweemaal met FACS buffer en resuspendeer de cellen in vlekken buffer. Incubeer een FcR blocker gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Voeg extracellulaire antilichamen geconjugeerd met fluorochromen. Bijvoorbeeld, in dit protocol, gebruikt anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 en anti-CD56-antilichamen (Tabel 1). Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. </li><li> Na 2 wasbeurten met 1x PBS, de cellen worden geanalyseerd in 500 pl buffer vlek met een flow cytometer. Een weergave van de gating strategie gebruikt om de leukocyten subpopulaties in de deciduale weefsel analyse wordt getoond in figuur 4. </li></ol>

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Karakterisering van het functionele en fenotypische eigenschappen van infiltrerende leukocyten op menselijk maternale-foetale interface is essentieel voor het begrip van de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap aandoeningen. Er zijn verschillende technieken beschreven om leukocyten uit de humane maternale-foetale-interface isoleren gedurende de zwangerschap 10,14,25,28,37,42,43. Echter, elk van deze technieken verschilt, gebruikt verschillende enzymen of enzym-combinaties, vereist verschillende disso...

Zwangerschap vertoont drie verschillende immunologische fasen: 1) implantatie en vroege placentatie geassocieerd met pro-inflammatoire respons (bijv implantatie lijkt op een open wonde &quot;); 2) het tweede trimester en de meeste derde trimester van de zwangerschap wanneer immuunhomeostase wordt bereikt door een overwegend anti-inflammatoire staat in het maternale-foetale interface; en 3) de bevalling, een pro-inflammatoire staat 1-7. Immune cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van de ontstekingsreactie bij de moeder-foetale interface waar hun overvloed en lokalisatie veranderingen tijdens de zwangerschap 6-9. Bij de mens, de moeder-foetale-interface vertegenwoordigt een gebied van direct contact tussen de moeder (decidua) en foetale (chorion of trofoblast) weefsels. Deze interface bevat: 1) de decidua parietalis die lijnen de baarmoederholte niet onder de placenta en naast elkaarhet chorion laeve; en 2) de decidua basalis, gelegen in de basale plaat van de placenta indien het wordt aangevallen door interstitiële trofoblasten 10 (figuur 1). De intimiteit van deze gebieden van contact schept voorwaarden voor de foetus antigene blootstelling aan de maternale immuunsysteem 11-13. Niet verrassend, leukocyten bevatten tot 30-40% van de deciduale cellen 8,9,14,15 in aanvulling op de typische stromale-type cellen en kliercellen 8,14,16. De rol van leukocyten bij de moeder-foetale-interface omvat meerdere processen dat de beperking van trofoblastinvasie 17, herinrichting van spiraal arteriën 18,19, het onderhoud van maternale tolerantie 12,20, en initiatie van arbeid 21-26 bevatten. Leukocyten van zowel het adaptieve en aangeboren onderdeel van het immuunsysteem, dat wil zeggen, T-cellen, macrofagen, neutrofielen, B cellen, dendritische cellen en NK-cellen, geïdentificeerd in de deciduale weefsel en deverhoudingen en activatie toestand werden aangetoond in ruimte en tijd variëren gedurende dracht 6-10,12,14,24,27-30. Verstoringen in de leukocyten populatie en / of functie worden geassocieerd met spontane abortus 31, 32 pre-eclampsie, geboortegewicht 32,33 en vroeggeboorte 7,24. Daarom zal de studie van de fenotypische kenmerken en functionaliteit van leukocyten op menselijk maternale-foetale interface van de opheldering van de immunologische pathways verstoord bij zwangerschap stoornissen vergemakkelijken. Een van de meest krachtige hulpmiddelen gebruikt om het fenotype en de functionele eigenschappen van leukocyten te bepalen wordt flowcytometrie technologie die de kwantitatieve analyse van meerdere parameters tegelijkertijd 34-36 toelaat. Leukocyten door middel van flowcytometrie geanalyseerd, wordt isolatie van de leukocyten in een enkelvoudige celsuspensie vereist. Daarom is een werkwijze te scheiden infiltreren leukocytes van de maternale-foetale interface komen hun fenotypische en functionele eigenschappen te bestuderen. Verscheidene werkwijzen zijn beschreven om leukocyten te isoleren uit de humane maternale-foetale-interface 10,14,25,27,37-39. Terwijl sommige van toepassing mechanische uitsplitsing 10,25,27,38, anderen gebruiken enzymatische afbraak 37,40 voor weefsel dissociatie. Omdat mechanische disaggregatie opbrengst wel lager en verminderde levensvatbaarheid 41 en enzymatische dissociatie kunnen levensvatbaarheid en celoppervlaktemarker retentie 42 invloed op de hierin beschreven methode combineert zachte mechanische dissociatie met enzymatische voorbehandeling om de opbrengst van geïsoleerde leukocyten verhogen zonder afbreuk cellevensvatbaarheid. Een soortgelijke combinatie van methoden is aangetoond effectief bij het ​​isoleren van leukocyten uit het deciduale weefsel van de maternale-foetale-interface 39 zijn. Daarom is het hierin beschreven protocol omvat mechanisch disaggregatie met een automatische weefsel dissociator dat consistentie verhoogt terwijl bespaart tijd en arbeid in vergelijking met de traditionele hakken met tegengestelde scalpels, scheermesjes, of chirurgische schaar 10,28. De gekozen voor weefsel dissociatie enzym was Accutase. In tegenstelling tot veel gebruikte collagenase 43, dispase 44 en trypsine 45, Accutase (een cel onthechting oplossing) combineert zowel algemene proteolytische en collagenolytische activiteiten die bijdragen aan een efficiënte en toch zachte dissociatie 46,47. Na dissociatie, worden de leukocyten verrijkte van de totale bevolking van de decidua cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Verschillende dichtheidsgradiënt media zijn eerder toegepast, de meest voorkomende daarvan zijn Percoll (een suspensie van colloïdale silicadeeltjes) 48 en Ficoll (een polymeer van sucrose met een hoog molecuulgewicht synthetisch) 49. De superieure efficiency van isolatie door de sucrose polymeer previo geweestusly getoond 50 en de hierin verder beschreven protocol bewijst dat deze dichtheidsgradiënt media produceert een voldoende hoge zuiverheid van mononucleaire leukocyten. Vandaar dat de hierin beschreven protocol combineert de mechanische weefsel disaggregatie met automatisch dissociator weefsel, enzymatische digestie met een mobiele onthechting oplossing en leukocyten scheiden met een dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) om leukocyten uit menselijk deciduale weefsel te isoleren. Is bewezen dit protocol om celoppervlakantigenen behouden samen met levensvatbaarheid van de cellen. De geïsoleerde leukocyten kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen immunofenotypering met flowcytometrie en functionele studies in vitro omvatten.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissectie</td></tr><tr><td>Steriele dissectiewerktuigen: chirurgische schaar, pincetten en pincetten met fijne punt&nbsp;</td><td>Elke leverancier</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Grote en kleine Petri-schalen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociatie</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(oplossing voor celdetachment)</td></tr><tr><td>Steriele 2 ml safe-lock conische buizen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische centrifugeerbuizen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m celzeven</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ronde bodem polystyreen testbuisjes</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C buizen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Celcultuur</td></tr><tr><td>RPMI cultuurmedium 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS en 1% P/S)</td></tr><tr><td>Kunststof kamer slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Klasse 100</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Celteller</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Celscheiding</td></tr><tr><td>MS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Celscheider</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;m pre-scheiding filters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml safe-lock conische buizen</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,5% bovien serum albumine, 2 mM EDTA en 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Blok)</td></tr><tr><td>Anti-menselijke celoppervlakte antigeen antilichamen&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tabel 1)</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD levensvatbaarheidskleurstof</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,1% BSA, 0,05% Natriumazide, en 1X PBS, pH=7,4)</td></tr><tr><td>Kleurbuffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blauw oplossing 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Aanvullende instrumenten</td></tr><tr><td>Incubator met shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumsysteem</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatische weefseldissociator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissociator</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van leukocyten uit de human maternal-foetale interface

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Zwangerschap wordt gekenmerkt door de infiltratie van leukocyten in de reproductieve weefsels en de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis). Deze interface is de anatomische plaats van contact tussen moeder en foetale weefsels; Daarom is het een immunologisch werkingsplaats tijdens de zwangerschap. Infiltreren leukocyten bij de moeder-foetale-interface spelen een centrale rol in de implantatie, zwangerschap onderhoud, en de timing van de levering. Daarom zal fenotypische en functionele karakteriseringen van deze leukocyten inzicht in de mechanismen die leiden tot zwangerschap stoornissen. Verscheidene protocollen zijn beschreven om te isoleren infiltrerende leukocyten uit de decidua basalis en decidua parietalis; echter, het gebrek aan consistentie in de reagentia, enzymen en tijden van incubatie is het moeilijk deze resultaten te vergelijken. Hierin beschreven is een nieuwe benadering die het gebruik van zachte mechanische en enzymatische diss combineertociation technieken om de levensvatbaarheid en integriteit van extracellulaire en intracellulaire markers in leukocyten geïsoleerd uit menselijke weefsels op de maternale-foetale-interface behouden. Afgezien van immunofenotypering, celcultuur en celsortering, de toekomstige toepassingen van dit protocol zijn talrijk en gevarieerd. Na dit protocol kan de geïsoleerde leukocyten worden gebruikt om DNA-methylering, expressie van doelwitgenen in vitro leukocyten functionaliteit (dat wil zeggen, fagocytose, cytotoxiciteit, T-celproliferatie en plasticiteit, etc.), en de productie van reactieve zuurstofsoorten te bepalen de maternale-foetale interface. Bovendien, met behulp van de beschreven protocol, dit laboratorium is in staat om nieuwe en zeldzame leukocyten te beschrijven op de maternale-foetale-interface geweest.

. De ontleding van menselijke weefsels op de maternale-foetale interface (decidua basalis en decidua parietalis) wordt in figuur 1 Deze werkwijze omvat het ontleden van de basale plaat, waarbij de decidua basalis (Figuur 1A - D) omvat. De decidua basalis wordt verkregen door verwijdering van de placenta villi (foetale zijde) van de basale plaat (figuur 1C). De decidua parietalis wordt verzameld door voorzichtig schrapen het chorion membraan (Fig...

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van leukocyten uit de menselijke decidua basalis en decidua parietalis. Dit wordt bereikt door eerst de menselijke decidua-weefsels uit de placenta te dissekeren. Vervolgens wordt het decidua-weefsel gedissocieerd via mechanische desaggregatie en enzymatische digestie.Vervolgens wordt de celsuspensie gefilterd met een 100 micrometer cell strainer die is gewassen met XPBS en gecentrifugeerd bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om een celpellet te verkrijgen. Ten slotte wordt de celsuspensie bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing geladen en gecentrifugeerd, waarna de interface met leukocyten wordt verzameld. Uiteindelijk kunnen de geïsoleerde leukocyten worden gebruikt voor immunofenotypering, celkweek en functionele studies.Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals mechanische dissociatie of enzymatische digestie, is dat het mechanische weefseldesegregatie combineert met een automatische weefselassociator en thematische digestie met Accutane en leukocytenisolatie met behulp van een fecale gradiënt. Er is aangetoond dat dit protocol celoppervlakantigenen en de cellevensvatbaarheid behoudt, en de implicaties hiervan reiken tot het begrip van de functionele en fenotypische eigenschappen van infiltrerende leukocyten op de materno-foetale interface in relatie tot de pathogenese van prenatale complicaties. De verzameling en het gebruik van menselijke monsters voor onderzoeksdoeleinden zijn goedgekeurd door de institutionele toetsingscommissies van de Eunice Kennedy Shriver, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services en Wayne State University.Voorafgaand aan de afname van weefselmonsters werd van alle zwangere vrouwen schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.Om te beginnen wordt er een stuk van de basale plaat gedisseceerd uit één lob van de placenta. Plaats dit op een steriel snijbord met de placentale vliezen, die bloedrood zijn en een harig uiterlijk hebben, naar boven gericht.De basale plaat is glad en lichtrood van kleur. Terwijl het weefsel geweekt blijft in 1x PBS, gebruikt u scherpe, fijne scharen en een pincet om het villeus weefsel en de bloedvaten te verwijderen. Verzamel twee tot drie stukjes en spoel deze grondig met PBS om het bloed te verwijderen. Om de decidua basalis te isoleren, disseceert u een vierkant stuk van 10 centimeter bij 10 centimeter.Plaats het op de plaat met het chorion, dat bloedstolsels bevat en gewoonlijk lichtgeel van kleur is, met de bovenzijde naar boven. Gebruik vervolgens een fijne pincet om zoveel mogelijk van de bloedstolsels te verwijderen. Spoel de membraan daarna met steriele 1x PBS tot het PBS helder weglopend is.Verwijder voorzichtig de decidua-laag met een steriele wegwerpcelschraper terwijl er PBS op het membraan wordt aangebracht. Verzamel het decidua-weefsel en plaats dit in een plastic buis van 50 milliliter met steriele PBS om de decidua Bali of de deci paral mechanisch te desaggregeren. Begin met het wassen van het weefsel in een buis van 50 milliliter met steriele 1xPBS.Centrifuge het weefsel vervolgens vijf minuten bij 300 G en kamertemperatuur. Aspireer voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer daarna het weefsel en de detachementoplossing volgens het tekstprotocol en breng de gehomogeniseerde weefsels over naar een C-buis.Plaats de buis in de automatische dissociator en start het bijbehorende programma. Voeg na dissociatie een commercieel verkrijgbare celdetachementsolutie toe aan de weefsels, zoals Accutane, en incubeer dit 45 minuten bij 37 °C onder zachte agitatie om het weefsel te verteren. Voeg na de incubatie 10 mL PBS toe aan het digestiemengsel en filter dit door een cellzeef van 100 µm in een buis van 50 mL. Afhankelijk van de kleverigheid kunnen meerdere zeven nodig zijn om één digestie te filteren.Vul de buis aan met PBS en centrifugeer vijf minuten bij 300 G en kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant en gebruik vijf milliliter ijskoud fax-buffer om de celpellet opnieuw te suspenderen. Om mononucleaire leukocyten te bestuderen, voegt u vijf milliliter 20% density gradient medium toe aan een plastic buis van 15 milliliter.Breng vervolgens langzaam de celsuspensie aan over de bovenlaag, waarbij u er zorg voor draagt dat de lagen niet mengen. Centrifugeer vervolgens 30 minuten bij 500 G op vier graden Celsius met een swing-out rotor en zonder remfunctie; de leukocyten bevinden zich nu in de interface tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de FACS-buffer. Pipetteer daarna voorzichtig de bovenlaag weg die de FACS-buffer en celresten bevat. De interface bevat de resterende mononucleaire cellen en een deel van de polymorfnucleaire leukocyten.Breng deze laag over naar een nieuwe buis van 15 milliliter. Voeg ten minste drie volumes fax-buffer toe aan de buis en centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 300 G. Om de cellen te pelletteren, wordt het supernatant afgezogen en worden de cellen nogmaals gewassen met fax-buffer voordat de celcultuur wordt uitgevoerd.Sorteering en immunofenotypering volgens het tekstprotocol; deze figuur toont de morfologie van geïsoleerde macrofagen, verzameld uit de decidua pariahs bij een zwangerschap op termijn middels magnetische celsortering. Geïsoleerde macrofagen behouden het vermogen om cytokinen af te geven na drie dagen cultuur. De opbrengst van levensvatbare cellen geïsoleerd uit de decidua, baus en decidua paral werd bepaald na dichtheidsgradiëntscheiding.Met gebruik van een fixeerbare levensvatbaarheidsmarker, zoals hier getoond, was deze groter dan 90% voor elke deciduaal celpopulatie. Hier wordt de gating-strategie getoond voor het analyseren van polymorfnucleaire en mononucleaire leukocyten binnen de zichtbare gating, inclusief T-cellen, neutrofielen, macrofagen, NK-cellen, NKT-cellen en B-cellen. Deze figuur toont bij een zwangerschap op termijn neutrofielen, macrofagen, T-cellen en B-cellen uit geïsoleerde residuele cellen van een zwangerschap op termijn.Ten slotte worden NK-cellen, NKT-cellen en T-cellen uit geïsoleerde residuele cellen van een termijnzwangerschap weergegeven in deze set grafieken. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden het weefsel goed te reinigen om bloedcontaminatie te voorkomen, en het weefsel en het enzymcocktail tijdens de procedure in het zicht te houden.

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren subsets van precursor B-cellen uit navelstrengbloed. Een voldoende hoeveelheid en kwaliteit van nucleïnezuren kunnen worden geëxtraheerd uit de cellen en gebruikt in daaropvolgende testen gebruik DNA of RNA.

Isolatie van Precursor B-cel subsets van navelstrengbloed

Beschreven hierin is een protocol om de infiltraterende leukocyten van weefsels bij de moeder-foetus interface (baarmoeder, decidua en placenta) van muizen te isoleren en te analyseren. Dit protocol behoudt de integriteit van de meeste celoppervlaktemarkers en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream toepassingen, inclusief flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Hierin beschrijven we werkwijzen voor de ontleding van foetale en maternale weefsels van menselijke term placenta, gevolgd door isolatie en expansie van mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) van deze weefsels.

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Een eenvoudige methode om primaire humane placenta (villi) en decidua orgaankweken vast is beschreven. Villous en deciduale orgel culturen zijn van onschatbare waarde tools voor het bestuderen van de pathogenese bij de mens maternale-foetale interface. Infectie met de facultatief intracellulaire bacterie Listeria monocytogenes wordt aangetoond.

Menselijke placenta en deciduale Organ culturen om infecties bij de moeder op foetus Interface Studie

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Moedermelk zendt humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hoewel slechts ~ 15% van zuigelingen die borstvoeding krijgen door HIV-geïnfecteerde moeders geïnfecteerd raken. Borstvoeding zuigelingen nemen ~ 105− 108 maternale leukocyten dagelijks, hoewel deze cellen zijn onderonderzocht. Hier beschrijven we de isolatie van moedermelk leukocyten en een analyse van hun fagocytische capaciteit.

Isolatie van leukocyten van menselijke moedermelk voor gebruik in een antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose test van HIV-doelwitten

Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Leer de isolatie van leukocyten uit de humane decidua via mechanische en enzymatische dissociatie met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode behoudt celoppervlaktemarkers voor immunofenotypering.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Meer video's verkennen