Name: Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Leer de isolatie van leukocyten uit het maternale-fetale interface bij muizen. Deze methode combineert mechanische dissociatie met enzymatische vertering voor behoud van celoppervlaktemarkers en viabele cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NGL werd gesteund door de Wayne State University Perinatale Initiative in Maternal, Perinatale en Child Health. We dankbaar erkennen Maureen McGerty en Amy E. Comfort Suites Comfort Suites (Wayne State University) voor hun kritische lezing van het manuscript.

Voor het werken met de in dit protocol genoemde monsters, moet dier ethische goedkeuring worden gegeven door de lokale Research Ethics Committee en de Institutional Review Boards. Bij het werken met dierlijk bloed, cellen, of gevaarlijke stoffen als bedoeld in dit protocol, moet de juiste bioveiligheid en laboratorium veiligheid acties worden opgevolgd. 1. Mouse Handling en Tissue Collection <ol><li> Bereid een steriele werkplek en het verkrijgen van steriele instrumenten voor het weefsel collectie. Deze tools omvatten grote en kleine chirurgische schaar, pincet, en fijn-tip pincet. Omvatten kleine Petrischalen gelabeld met het geschikte weefsel namen, gevuld met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing (3-5 ml) geëquilibreerd tot kamertemperatuur (20-22 ° C). Ook een grote petrischaal, unlabeled, gevuld met 1x PBS-oplossing (10-15 ml). </li><li> Euthanaseren een zwangere muis (10,5-19,0 ​​dagen na coïtum (DPC) en voor aflevering) op kooldioxide (CO 2). Om de muis gedood, gebruikt de cervicale dislocatie techniek. Opmerking: Alvorens 10,5 dpc, is het moeilijk om de deciduale weefsel handmatig scheiden van de baarmoederweefsels. Als de isolatie van deciduale leukocyten niet is vereist, leukocyten uit de baarmoederweefsels van niet-zwangere muizen of die van muizen &lt;10,5 dpc kan ook worden uitgevoerd door het volgen van dit protocol. </li><li> Met een paar steriele chirurgische schaar, de onderbuik gedeelte van de huid en spierweefsel volledig te verwijderen. Met een pincet, bewegen af ​​alle andere organen tot de baarmoeder en eierstokken zijn zichtbaar. Met de baarmoeder nog steeds verbonden, gebruikt de tang te bewegen buiten de peritoneale holte (figuur 1A). </li><li> Zoek de eierstokken distale naar de eileider en tubale kruising van elke baarmoeder hoorn. De kleine chirurgische schaar, een insnijding in het tubale verbinding en scheiden de baarmoederhoorns van het mesenterium waarin de uterine vaten; Vervolgens,accijns bij de baarmoederhals naar de baarmoeder hoorns van de peritoneale holte (Figuur 1B) los. </li><li> Met kleine chirurgische schaar, een insnijding tussen de baarmoederhals en het onderste segment van de baarmoederhoorns. Leave hierbij een gedeelte van de cervix tijdens dit proces (figuur 1C) voorkomen dat het openen van de baarmoederhoorn. </li><li> Dompel de baarmoederhoorns (inclusief cervix) in een grote petrischaal gevuld met 1x PBS-oplossing (10-15 ml) aan de implantatieplaatsen hydrateren. </li><li> Hoewel nog steeds ondergedompeld in 1x PBS-oplossing, trim het vet uit de baarmoeder hoorns met de kleine chirurgische schaar. Houd de weefsels ondergedompeld in 1x PBS oplossing gedurende de dissectie. </li><li> Houd de baarmoeder hoorns op zijn plaats met de tang, verwijder dan één van de implantatieplaatsen uit de baarmoeder met een transversaal doorgesneden door de inter-implantatie regio, met behulp van de kleine chirurgische schaar (figuur 1D). De implantatie site bevat de foetus, omringd door dechorioallantoïsmembraan en de baarmoeder, deciduale, placentale en weefsels. </li><li> Met behulp van de tang, houd de site in plaats en maken een kleine incisie in de baarmoederwand grenst aan de placenta en deciduale weefsels (figuur 1E). Randen rond de omtrek van de placenta / decidua totdat deze gescheiden worden van zowel de baarmoederwand en chorioallantoïsmembraan dat de foetus omvat (Figuur 1F). </li><li> Verwijder de placenta en de bijgevoegde deciduale weefsels en plaats in 1x PBS-oplossing (3-5 ml; zie stap 1.12). </li><li> Plaats de foetus omringd door het chorioallantoïsmembraan bevestigd aan de baarmoederweefsels in een petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml). De hydratatie van deze weefsels zal de scheiding van het chorioallantoïsmembraan van de baarmoederwand te vergemakkelijken (zie stap 1.14). </li><li> Met behulp van een paar fijne-tip pincet, zachtjes schil de deciduale weefsel (wit-grijze laag) van de placenta oppervlak. Voer dezeStap voorzichtig om de integriteit van de placenta en deciduale weefsel (figuur 1G) handhaven. </li><li> Plaats de placenta en deciduale weefsel in twee afzonderlijk gelabeld petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml elk). </li><li> Verwijder voorzichtig de baarmoederwand van de chorion membraan met fine-tip pincet. Dit zijn de baarmoederweefsels. </li><li> Plaats de baarmoederweefsels in een petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing (3-5 ml). </li><li> Herhaal stap 1,8 tot 1,15 totdat alle innestelingplaatsen zijn verwerkt. </li><li> Verzamel verscheidene baarmoeder, deciduale, placentale en weefsels naar de opbrengst aan cellen tijdens enzymatische digestie verbeteren. De hoeveelheid weefsel hangt af van de worpgrootte; echter leukocyten isolatie vereist&gt; 2 stukjes weefsel. Let op: Voor meer gedetailleerde informatie over de ontleding van de implantatie sites op verschillende zwangerschapsduur dagen, bekijk de foto&#39;s gevonden in hoofdstuk twee van de Guide to Investigatiop van de muis zwangerschap 42. </li></ol> 2. Baarmoeder, deciduale en placentaweefsel Dissociatie <ol><li> Label verschillende steriele 2 ml conische buizen met de juiste weefsel naam en plaats een flacon met 1000 ul van enzymatische oplossing op ijs. </li><li> Uit de petrischaal gevuld met 1x PBS oplossing, overdracht twee stukken (100-150 mg) van de baarmoeder, deciduale, placentale of weefsels in een gelabelde 2 ml conische buis. </li><li> Voeg 500 ul koude enzymatische oplossing in elk 2 ml conische buis. </li><li> Met fijne steriele schaar, beginnen met het weefsel ondergedompeld in de enzymatische oplossing distantiëren totdat het fijn wordt gehakt. Na verloop van tijd, zal de schorsing van een melkachtig uiterlijk te ontwikkelen. Deze stap mag niet langer dan 2 minuten over-manipulatie van het monster te voorkomen. </li><li> Wanneer het weefsel is gedissocieerd, een extra 500 pl koude enzymatische oplossing voor de 2 ml conische buis. </li><li> Plaats de 2 ml conische buis op ijs. </li><li> Herhaal stap 2,2 tot 2,6 per individu tissue totdat alle weefsels zijn verwerkt. </li><li> Breng alle 2 ml conische buizen met gehomogeniseerd weefsel (gehakt weefsel + enzymatische oplossing) monsters van het ijs in een incubator bij 37 ° C en het uitvoeren van een zachte orbitale schudden (80 rpm). Incubeer gedurende 30 - 35 min. Zorg ervoor dat de temperatuur van de incubator wordt gestabiliseerd alvorens de incubatietijd. </li><li> Na incubatie, verwijder de 2 ml conische buizen met los weefsels uit de incubator en plaats ze op ijs om verdere spijsvertering te voorkomen. </li><li> Label steriele 50 ml conische buizen volgens het type weefsel. Verwijder de deksels en te vervangen door een steriele cel zeef (100 micrometer poriegrootte). </li><li> Giet de gedissocieerde weefsel weg 2 ml conische buizen door de cel zeef middels ~ 20 ml 1x PBS oplossing. De stukjes weefsel in de cel zeef achterblijven en de celsuspensie wordt doorheen. </li><li> Was de dissociated weefsels in de cel zeef 2-3 maal met 20 ml 1 x PBS oplossing wordt met een transferpipet. </li><li> Spoel de lege 2 ml conische buizen met 1x PBS-oplossing (1 ml) en giet de inhoud door de cel zeven. </li><li> Verwijder de cel zeven van de 50 ml conische buizen en vervang de deksels. Centrifugeer de buisjes bij 1250 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. </li><li> Voorzichtig het supernatans aspireren zonder de celpellet. De celpellet bevat de geïsoleerde leukocyten en stromale cellen. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 1 ml RPMI cultuurmedium zonder foetaal runderserum (FBS). Meng voorzichtig. Gebruik geen vortex. </li><li> Voeg 500 ul van nette FBS aan een 5 ml polystyreen buis en langzaam overlay de celsuspensie. </li><li> Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1100 xg zonder rem bij kamertemperatuur levensvatbare cellen te pelletiseren terwijl celresten wordt vastgehouden op de PBS / FBS-interface. </li><li> Zuig het supernatans zonder het aanraken van de cel pellet. De CELl pellet bevat voornamelijk levensvatbare cellen. </li><li> Optioneel: De mononucleaire cellen te concentreren, gebruikt een verzadigde polysaccharideoplossing 20%, zoals hieronder beschreven. <ol><li> Resuspendeer de celpellet in 1000 pl RPMI cultuurmedium zonder FBS. </li><li> Voeg 1 ml 20% verzadigde polysacharideoplossing een 5 ml polystyreen buis en langzaam overlay de celsuspensie top van deze oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Terwijl de gelaagdheid van het monster, vermijd het mengen van de 20% verzadigde oplossing polysaccharide met de celsuspensie. </li><li> Centrifugeren met een swing-out rotor bij 500 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur zonder rem. Het is belangrijk de rem uit te schakelen om te voorkomen dat het mengen van de cellen en verlies van de gradiënt. Mononucleaire cellen wordt in het grensvlak tussen de 20% verzadigde oplossing van polysaccharide en 1x PBS-oplossing. </li><li> Zuig en gooi het supernatant. De celpellet bevat voornamelijk mononucleaire cellen. Neete: Voor levensvatbaarheid kleuring en intracellulaire kleuring uit te voeren, zie stap 3. immunofenotypering voeren, zie stap 4. Voor levensvatbaarheid kleuring en alleen extracellulaire vlekken uit te voeren, zie stap 5. Om een ​​celcultuur van geïsoleerde leukocyten uit te voeren, zie stap 6. Om te voeren magnetische celsortering, zie stap 7. </li></ol></li></ol> 3. levensvatbaarheid kleuring voor fixable Cells <ol><li> Resuspendeer de celpellet in 1100 pl 1x PBS oplossing. Meng zachtjes met een micropipet. </li><li> Breng 100 pi van de celsuspensie in een 5 ml polystyreen buis. Voeg 400 ul van 1 x PBS oplossing van het 5 ml polystyreen buis. Deze buis is een controle voor weefsel auto-fluorescentie. Bewaren bij 4 ºC tot stap 3,5. </li><li> Breng de resterende 1.000 ul van de celsuspensie in nieuw 5 ml polystyreen buis. Voeg 1 ul van de levensvatbaarheid kleurstof en voorzichtig gehomogeniseerd. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ºC. </li><li> Na incubatie voeg 1000 &amp; #181; l 1x PBS-oplossing. Meng voorzichtig met de hand. </li><li> Centrifuge zowel 5 ml polystyreen buizen (stap 3,2 en 3,3) bij 1250 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zuig en gooi het supernatant. Opmerking: De cel pellet (stap 3,3) gebruikt in stap 4. De cel pellet (stap 3,2) dient als controle voor tissue auto-fluorescentie. </li></ol> 4. Immuunfenotypering <ol><li> Resuspendeer de cel pellet in 50 ul anti-muis CD16 / CD32 (verdund 1: 100 in FACS buffer [0,1% BSA, 0,05% natriumazide, 1x PBS, pH 7,4]). Meng de celsuspensie voorzichtig. Gebruik niet de vortex. </li><li> Incubeer de celsuspensie in 5 ml polystyreen buis in het donker bij 4 ° C gedurende 10 min. </li><li> Na incubatie, voeg 50 ul van elk anti-leukocyten monoklonale antilichamen reageren met extracellulaire celoppervlak markers of isotype-gematchte controle-antilichaam (antilichaam verdunningen worden gevalideerd). Om bijvoorbeeld leukocyten subpopulaties analyse, gebruik anti-moGebruik antilichamen die reageren met de volgende leukocyt-celoppervlak markers: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD 11 c, CD49b, B220, CD3, CD4 en CD8 (Tabel 1). </li><li> Wanneer antilichamen tegen extracellulaire markers zijn toegevoegd aan de 5 ml polystyreen buis meng voorzichtig. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Tijdens deze incubatie, bereiden en pre-warm de fixatie bufferoplossing (verdund met gedeïoniseerd water, 1: 5) tot 37 ° C, indien nodig. Houd de buffer bij 37 ° C in de duisternis tot het gebruik ervan noodzakelijk is. </li><li> Na 30 min incubatie, voeg 500 ul FACS buffer in de 5 ml polystyreen buis en meng. Deze stap is noodzakelijk om de cellen te wassen en verwijderen van eventuele overmaat aan ongebonden antilichaam. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant. Opmerking: Als intracellulaire kleuring niet nodig is, zie stap 5. Indien intracellulaire kleuring nodig is, permeabilisatie presteren en intracelular vlekken hier, en ga dan verder met de fixatie (stap 4.8). </li><li> Voeg 500 ul van voorverwarmde fixatie bufferoplossing om de celpellet en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 37 ° C. </li><li> Breng 500 pi FACS-buffer in de 5 ml polystyreen buis. Meng voorzichtig. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant. </li><li> Voeg 500 ui FACS buffer aan elk monster. Deze monsters kunnen nu worden geanalyseerd door flow cytometrie. Het verwerven van de monsters direct voor de beste resultaten. </li></ol> 5. levensvatbaarheid kleuring voor unfixable Cells <ol><li> Na extracellulaire immunofenotypering, resuspendeer de celpellet in 500 ui FACS-buffer. </li><li> Voeg 1 ul van 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI, 200 gg / ml) net voor het verkrijgen van het monster. </li><li> Visualiseren monsters binnen 1-2 minuten na toevoeging DAPI met een flow cytometer. </li></ol><ol><li> Bereid een werkstation onder een steriele zuurkast. Pre-warm de RPMI cultuurmedium tot 37 ° C met een waterbad. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 1000 pi FACS buffer celtelling. </li><li> Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een automatische celgetalmeter of hemocytometer en 0,4% trypan blauwe oplossing, volgens de instructies van de fabrikant. Noteer het totaal levend celgetal. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min om de FACS buffer te verwijderen. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 ul voorverwarmde RPMI cultuurmedium door voorzichtig pipetteren 2-3 keer. </li><li> Plate het gewenste aantal cellen in een steriele 24-well plaat en incubeer bij 37 ° C. De incubatietijd zal worden bepaald door de vraagstelling. </li></ol> 7. Magnetic Cell Sorting <ol><li> Stel een schone werkstation met de volgende materialen: MS kolommen, magnetische celscheider, 15ml conisch 30 urn pre-scheiding filters, en een multi-stand. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 ui MACS buffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7,2). </li><li> Met behulp van een automatische celgetalmeter of hemocytometer en 0,4% trypan blauwe oplossing, tellen en noteer de totale levend celgetal. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1250 xg bij 4 ° C gedurende 10 min. Zuig en gooi het supernatant. Voeg nog eens 500 ul van MACS buffer. </li><li> Ga naar de magnetische scheiding de aanbevelingen van de fabrikant uitgevoerd. </li><li> Bepaal de zuiverheid door middel van flowcytometrie of microscopie. </li></ol>

De auteurs openbaren geen belangenconflicten.

Het verzamelen van consistente gegevens die de overvloed en fenotypische kenmerken van het infiltreren leukocyten registreert bij de moeder-foetale interface is van essentieel belang voor het begrijpen van de pathogenese van de zwangerschap gerelateerde complicaties. Verschillende technieken beschreven dat de isolatie van infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels bij maternale-foetale-interface gedurende de zwangerschap 31,38,39,43-46 vergemakkelijken. Echter, elke techniek verschilt, gebruikt verschill...

Immunotolerantie bij zwangerschap is een periode waarin kenmerkende reactie plaatsvinden het immuunsysteem van de moeder. Deze veranderingen kan de moeder naar de foetus, een semi-allogeen transplantaat 1 tolereren. De foetus tot expressie vaderlijke major histocompatibility complex (MHC) antigenen 2 en foetale cellen gevonden in de moederlijke circulatie 3; echter de foetus niet verworpen 4,5. Dit raadsel is niet helemaal duidelijk. De meest recente hypothese stelt dat de moeder-foetale tolerantie wordt gemaakt tijdens de coïtus en bevruchting 6,7 en onderhouden om een voldragen zwangerschap 8-10 ondersteunen. Een uitsplitsing van deze moeder-foetale tolerantie wordt beschouwd als een mechanisme van de ziekte tijdens de vroege en late stadia van de zwangerschap 10-16. Maternale-foetale tolerantie betreft de deelname van diverse leukocyten subpopulaties, waaronder T-cellen (regulatoire T-cellen, Th1-cellen, Th2-cellen, en Th17 cellen), macrophages, neutrofielen, mastcellen, NK-cellen en NKT-cellen, dendritische cellen en B-cellen, die verandering in dichtheid en lokalisatie gedurende de zwangerschap 15,17-19. Maternale-foetale tolerantie verrijkt ten maternale-foetale-interface 20 - de anatomische plaats waar het immuunsysteem van de moeder interageert met de foetale antigenen 20,21. De moeder-foetale interface is gemaakt tijdens placentatie wanneer de foetale extravilleuze trofoblastcellen binnenvallen de baarmoeder slijmvlies 22-24. Aan de foetale kant van deze interface, de vliezen rond de foetus het creëren van een gespecialiseerde epitheeloppervlak binnen de placenta en de syncytiotrofoblast cellen controle van de uitwisseling van voedingsstoffen via hun direct contact met bloed van de moeder 22. Aan moederszijde van de interface, de decidua rekruteert heterogene pool van leukocyten in muizen die verantwoordelijk zijn voor 30% tot 50% van alle decidua cellen. Naast hun deelname aan Maternal immuun tolerantie, deze cellen zijn de belangrijkste bijdragers aan verschillende processen tijdens de zwangerschap, bijv., de bescherming van de voortplantingsorganen van infecties, bevruchting, embryo implantatie 7,25, deciduale angiogenese 26, vasculaire remodeling 24,27, trofoblastinvasie 28, placenta ontwikkeling 24,25, en, uiteindelijk, arbeid en levering 15,17. Daarom is het onderzoek van de bij maternale-foetale tolerantie leukocyten is essentieel voor het ophelderen van de pathogenese van zwangerschap gerelateerde complicaties. Hoewel het gebruik van immunohistochemie en immunofluorescentie gegevens heeft gegenereerd voor de directe visualisatie en lokalisatie van baarmoeder, decidua of placenta leukocyten 29,30 flowcytometrie analyse bleek voorts specifieke subsets van leukocyten in elk van deze weefsels 31,32. Daarnaast flowcytometrie is gebruikt om de dichtheid en percentage mater vastnal-foetale-interface leukocyten 33 en expressie van extracellulaire en intracellulaire eiwitten 8-10,34. Flow cytometrische analyse van leukocyten bij de moeder-foetale-interface vereist een single-cell suspensie. Om infiltrerende leukocyten te isoleren van de deciduale, baarmoeder, placenta en weefsels zijn twee methoden weefsel dissociatie gebruikt: mechanische en enzymatische. Beide werkwijzen maken de scheiding van geïnfiltreerde leukocyten uit de extracellulaire matrix (ECM) van deze weefsels. Enzymatische weefsel dissociatie is superieur aan mechanische weefsel dissociatie omdat het zorgt voor een hogere opbrengst van leukocyten met minder shear-force-bijbehorende schade 35. Bijgevolg mechanische weefsel dissociatie vraagt ​​erom weefsel 36, waarbij de variabiliteit en heterogeniteit van de monsters kan toenemen. Toch kan mechanische dissociatie de keuze bij het antigeen van belang kan worden veranderd door enzymatische dissociatie of wanneer de functionaliteit van de cels plaats moeten worden behouden (bijv., cytotoxiciteit van NK-cellen) 35. De toepassing van proteolyse van specifieke enzymen om de ECM breken elimineert de lage opbrengsten waargenomen met mechanische dissociatie. Verschillende studies hebben melding gemaakt van het gebruik van trypsine 32, collagenase 37, DNase 31, dispase 38 en commerciële cocktails van verschillende enzymen 32,39. Echter, de aard en concentratie van de verschillende enzymen en de duur van digestie nauwkeurig worden vastgesteld en gevalideerd om handhaving van de integriteit van het celoppervlak antigene epitopen vereist voor immunofenotypering waarborgen. De verschillende oppervlaktestructuren zijn differentieel gevoelig voor vernietiging door verschillende enzymen, met sommige enzymen, zoals trypsine, die bekend voor het strippen van leukocyten oppervlakte epitopen herkend door verschillende monoklonale antilichamen. Hierin wordt geïntroduceerd is een methode waarbij een proteolytic en collagenolytische enzymatische cocktail, genaamd Accutase. Deze enzymatische oplossing is mild genoeg terwijl efficiënt dissociëren murine weefsels bij de maternale-foetale interface en vereist geen toevoeging van andere dissocieert reagentia of serum dat zij de dissociatie reactie te beëindigen. Bovendien is het klaar voor gebruik en behoeft, hoewel de tijd van dissociatie moet worden bevestigd, is robuuster dan de bovengenoemde enzymen 40,41. Het gebruik van een combinatie van beide soorten weefsel disaggregatie verbetert de kwaliteit en de hoeveelheid cellen verkregen; aldus, hebben verschillende studies het gecombineerde gebruik van mechanische en enzymatische dissociatie uitgevoerd met bevredigende resultaten 31,32,37. De hierin beschreven protocol werd vastgesteld en gevalideerd in ons laboratorium; Het gebruikt een combinatie van een zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische uitsplitsing. Dit protocol maakt de isolatie en verdere studiede infiltrerende leukocyten in muizen weefsels bij de maternale-foetale interface (uterus, decidua en placenta). Het volgende protocol handhaaft de integriteit van celoppervlak markers en levert voldoende levensvatbare cellen voor verdere toepassingen zoals aangetoond door flow cytometrische analyse. Ten slotte is dit protocol handhaaft de samenhang van celpreparaat voor de analyse en vergelijking van verschillende murine weefsels van het maternale-foetale interface.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory preparation</td><td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA en 1x PBS, pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Accutase enzymatische oplossing</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis extracellulaire antilichamen</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>Tabel 1</td></tr><tr><td>Natriumaziet</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viabiliteitskleur</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Fixatiebufferoplossing</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Laboratory preparation</td><td>0.1% BSA, 0.05% natriumaziet, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Trypanblauw oplossing 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Aanvullende instrumenten</td></tr><tr><td>Incubator met shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumsysteem</td><td></td><td></td><td>laboratorium geconstrueerd</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Precision</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>Celteller</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td></td></tr><tr><td>Optische en fluorescentiemicroscopen</td><td>Zeiss en Olympus</td><td>Zeiss LSM780 en Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van leukocyten uit de murine tissues de maternal-fetal interface

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immuuntolerantie in de zwangerschap vereist dat het immuunsysteem van de moeder ondergaat opvallende veranderingen om te accepteren en te koesteren de zich ontwikkelende foetus. Deze tolerantie wordt gestart tijdens de coïtus, tijdens bevruchting en implantatie opgericht en onderhouden tijdens de zwangerschap. Actieve cellulaire en moleculaire mediatoren van tolerantie maternale-foetale worden verrijkt op de plaats van contact tussen foetale en maternale weefsels, zogenaamde maternale-foetale interface, die de placenta en de baarmoeder en deciduale weefsel omvat. Deze interface omvat stromale cellen en infiltrerende leukocyten en hun overvloed en fenotypische karakteristieken verandert in de loop van de zwangerschap. Infiltrerende leukocyten in het maternale-foetale-interface omvatten neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, mestcellen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en NKT cellen die tezamen de lokale micro-omgeving die de zwangerschap in stand te creëren. Een onbalans tussen deze cellen of inappropriate verandering in hun fenotypen wordt beschouwd als een mechanisme van ziekte tijdens de zwangerschap. Daarom is de studie van leukocyten dat de maternale-foetale-interface infiltreren is essentieel om de immune mechanismen die leiden tot zwangerschap verwante complicaties helderen. Hierin beschreven is een protocol dat een combinatie van zachte mechanische dissociatie gevolgd door een sterke enzymatische disaggregatie met een proteolytische en collagenolytische enzymatische cocktail de infiltrerende leukocyten uit de muizen weefsels te isoleren van de maternale-foetale interface gebruikt. Dit protocol maakt de isolatie van grote aantallen levensvatbare leukocyten (&gt; 70%) met voldoende geconserveerde antigene en functionele eigenschappen. Geïsoleerde leukocyten kan vervolgens worden geanalyseerd door verscheidene technieken, waaronder immunofenotypering, celsortering, imaging, immunoblotting, mRNA expressie, celkweek en in vitro functionele testen zoals gemengde leukocyt reacties, proliferatie of cytotoxiciteit assays.

De dissectie van muizen weefsels van de maternale-foetale interface is weergegeven in figuur 1; Deze procedure omvat het openen van de peritoneale holte (Figuur 1A, B), baarmoederhoorns (figuur 1C) met de implantatieplaatsen (figuur 1D), en het verzamelen van de baarmoederweefsels (Figuur 1E), placenta (Figuur 1F), en decidua weefsels (figuur 1G) en 16,5 dpc. Figuur 2 toont de morfologi...

Beschreven hierin is een protocol om de infiltraterende leukocyten van weefsels bij de moeder-foetus interface (baarmoeder, decidua en placenta) van muizen te isoleren en te analyseren. Dit protocol behoudt de integriteit van de meeste celoppervlaktemarkers en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream toepassingen, inclusief flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van de infiltrerende leukocyten van de murine materno-foetale interface. Dit wordt bereikt door eerst de uterus, placenta en eua te oogsten. De weefsels worden afgebroken door mechanische dissociatie in een enzymatische oplossing, gevolgd door een daaropvolgende enzymatische digestie.De resulterende celsuspensie wordt vervolgens gefiltreerd en gewassen, waarna de immuuncellen van belang via een gradiënt van foetaal runderserum worden gescheiden van celdebris, zoals niet-levende cellen. Uiteindelijk kunnen de geïsoleerde leukocyten worden gebruikt voor immunofenotypering, celkweek of cel sortering. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we probeerden een protocol op te stellen voor het isoleren van leukocyten uit de materno-foetale interface, waarbij we merkten dat de gepubliceerde methoden de isolatie van de zeldzame immuuncellen waar wij in geïnteresseerd waren, niet faciliteerden.Een demonstratie. De procedure zal worden uitgevoerd door Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, onderzoekers uit mijn laboratorium. Om de weefsels van de materno-foetale interface te verzamelen, begint u met het volledig verwijderen van het onderste abdominale deel van de huid en het spierweefsel met een steriele chirurgische schaar. Gebruik vervolgens een pincet om alle andere organen opzij te schuiven tot de uterus en de ovaria zichtbaar zijn. Verplaats daarna de uterus uit de peritoneale holte.Lokaliseer de eierstokken distaal van de UCT en de utero-tubale overgang van elke uterine hoorn. Maak vervolgens een incisie bij de utero-tubale overgang om de hoorns te scheiden van het mesenterium dat de uterine vaten bevat. Exciteer bij de cervix om de uterine hoorns los te koppelen van de peritoneumholte.Gebruik vervolgens een chirurgische schaar om een incisie te maken tussen de cervix en het onderste segment van de uterine hoorns, waarbij een deel van de cervix behouden blijft om te voorkomen dat de uterine hoorn opent. Dompel de hoorns en de cervix onder in een grote Petrischaal gevuld met 10 tot 15 milliliters PBS om de implantatieplaatsen te hydrateren. Verwijder eventueel vetweefsel van de weefsels.Houd vervolgens de hoorns op hun plaats met de pincet. Maak een transversale snede door een inter-implantatieregio om een van de implantatieplaatsen uit de uterus te verwijderen. Houd nu de plaats op zijn positie en maak een kleine incisie in de baarmoederwand grenzend aan de placentaire en residuele weefsels.Trim rond de omtrek van de placenta en het decidua totdat de weefsels gescheiden zijn van zowel de baarmoederwand als het chorioamniotische membraan. Breng vervolgens de placenta en de vastgehechte decidua-weefsels over naar een schone Petrischaal met drie tot vijf milliliters PBS. Plaats de foetus in een andere Petrischaal met PBS en gebruik een pincet met fijne punt om het witgrijze decidua-weefsel voorzichtig van het placenta-oppervlak af te pellen.Zorg ervoor dat de integriteit van de placentaweweefsels en de ECI-weefsels behouden blijft. Verdeel de placenta- en ECI-weefsels over twee individueel gelabelde Petrischalen gevuld met PBS. Gebruik vervolgens de fijne pincet om de baarmoederwand van het chorio-allantoïsche vlies voorzichtig te verwijderen en plaats deze baarmoederweefsels in een nieuwe Petrischaal gevuld met PBS om de weefsels mechanisch te dissociëren.Breng vervolgens twee hoeveelheden van 100 tot 150 milligram van de uterine disci en placentawegen over naar individueel gelabelde conische buisjes van twee milliliter. Voeg 500 microliters koude enzymatische oplossing één toe aan elk buisje. Gebruik vervolgens een steriele schaar om elk van de weefsels gedurende maximaal twee minuten mechanisch te dissociëren tot er suspensies ontstaan.Er ontstaat een melkachtig uiterlijk. Voeg nogmaals 500 µL koude enzymatische oplossing toe aan elke buis en plaats de buizen op ijs. Incubeer vervolgens alle weefsels bij 37 °C met een zachte orbitale agitatie van 80 RPM en plaats de buizen na 30 tot 35 minuten op ijs om de digestie te stoppen.Zef nu elk weefselmengsel door een zeef van 100 micron in individueel gelabelde conische buizen van 50 milliliter, en was elke buis van twee milliliter en de zeef twee tot drie keer met 20 milliliter PBS om alle cellen op te vangen. Wanneer alle cellen zijn gefilterd, worden ze gecentrifugeerd en wordt het supernatant voorzichtig geaspireerd zonder de pellets te verstoren. Resuspendeer de geïsoleerde leukocyten en stromale cellen voorzichtig in één milliliter RPMI-kweekmedium zonder te vortexen.Voeg vervolgens voor elk weefsel 500 µL foetaal runderserum toe aan een polystyreenbuis van vijf milliliter en breng de celstroom langzaam aan bovenop het serum. Centrifugeer tenslotte, wanneer alle cellen zijn aangebracht, de cellen zonder onderbreking en aspireer het supernatant zonder de celpellets aan te raken. In deze afbeeldingen is de morfologie te zien van F4/80-positieve macrofagen geïsoleerd uit decidua- en uterusweefsels.Op 16,5 dagen post coum worden cellen getoond uit zowel maternaal als foetaal interfaceweefsel. Er is een viabiliteit van meer dan 70% na isolatie met deze methode; de monsters bevatten populaties neutrofielen, macrofagen, T-cellen, NK-cellen en dendritische cellen, met een hoog aandeel macrofagen die CD11c co-expresseren. Leukocyten-subpopulaties zijn geïsoleerd uit weefsels bij de mirror en de materno-foetale interface. Ook B-cellen en CD4-positieve T-cellen zijn aanwezig; CD8-positieve T-cellen en CD3-positieve, CD4-negatieve, CD8-negatieve T-cellen zijn eveneens geïsoleerd, zoals waargenomen in deze density plot.Houd er bij het uitvoeren van deze procedure rekening mee dat de weefsels en de enzymcocktail op ijs moeten blijven. Stel de juiste temperatuur in de incubator in en manipuleer de weefsels tijdens de digestie volgens deze procedure niet overmatig. Andere methoden, zoals immunofenotypering, celkweek, celsortering en DNA-RNA-isolatie, kunnen worden uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het isoleren van de infiltrerende leukocyten op de materno-foetale interface, de uterus en de placenta.

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

In this video, we demonstrate the isolation of marginating hepatic leukocytes from mouse liver by forced perfusion.

Isolation of Marginating Hepatic Leukocytes from a Mouse Liver

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Leer de isolatie van leukocyten uit het maternale-fetale interface bij muizen. Deze methode combineert mechanische dissociatie met enzymatische vertering voor behoud van celoppervlaktemarkers en viabele cellen.

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Meer video's verkennen