Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de fysische eigenschappen van fasescheidende membranen te beeldvormen en onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst dilio, fosfatidylcholine, fgo, myeline en cholesterol in een verhouding van twee op twee op één te mengen om een fasescheidende lipidenmengsel te vormen. Vervolgens worden de ondersteunde lipiden dubbellagen bereid door de liposomensuspensie af te zetten op een MICA-oppervlak met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Het oppervlak van de dubbellaag wordt vervolgens gescand, waardoor een topografisch beeld wordt geproduceerd waarin structurele kenmerken zoals hoogte kunnen worden gemeten. Vervolgens wordt krachtspectroscopie uitgevoerd op specifieke gebieden van de dubbellaag om de fysische eigenschappen van de dubbellaag te onderzoeken, met name de doorbraakkracht en de dikte van de membraan. Uiteindelijk laten de resultaten verschillen in eigenschappen zien tussen verschillende lipidefasen op basis van een FM-beelden en krachtcurven.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals fluorescentiemicroscopie, is de toename van resolutie en aanvullende eigenschappen die een FM kan onderzoeken op het monster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van biofysica, zoals de structuur van biologische membranen en eiwitten die ingebed zijn in dergelijke membranen. Bovendien kunnen we ook de fysische eigenschappen van het membraan bekijken en monitoren hoe veranderingen in de samenstelling of aanvullende membraactief middelen deze eigenschappen kunnen veranderen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de kwetsbare aard van het monster. Dit heeft gevolgen voor de monstervoorbereiding, de keuze van cantilevers en de FM-beeldvorming en spectroscopievoorwaarden. Begin met het oplossen van DOPC, spino, myeline en cholesterol in chloroform bij de gewenste concentraties. Combineer vervolgens 18,38 microliter DOPC, 17,1 microliter sing myeline en 11,3 microliter cholesterol om een oplossing te maken met één milligram totaal lipiden en een molaire verhouding van respectievelijk twee op twee op één.

Meng een oplossing door te vortexen, droog de mengsel met behulp van een inert gas zoals stikstof en droog het vervolgens verder onder vacuüm gedurende ten minste een uur. Los vervolgens de gedroogde lipiden op in 100 microliter PBS tot een concentratie van 10 milligram per milliliter. Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer een minuut.

Om een troebele suspensie te verkrijgen die meerlagige blaasjes bevat. Zorg ervoor dat er geen lipidefilms aan de zijkanten van de flacon blijven plakken. Neem 10 microliter van de meerlagige lipidesuspensie en voeg 150 microliter ondersteunde lipiden dubbellaagbuffer toe.

Meng vervolgens een oplossing en breng deze over in een klein glas vat met een deksel van twee milliliter en verzegel het met parafilm. Soniceer het mengsel bij kamertemperatuur in een badsonicator gedurende 10 minuten. Gedurende deze tijd moet de oplossing helder worden en kleine uni- of blaasjes met een diameter van ongeveer 50 nanometer opleveren.

Was glazen deksels in water gevolgd door ethanol en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Neem vervolgens Micah-schijven en trek de buitenste laag eraf met plakband. Bevestig de MICA-schijf aan een deksel met behulp van een druppel transparante optisch heldere lijm.

Bevestig vervolgens plastic cilinders aan de MICA met behulp van vacuümvet en zorg ervoor dat er geen lekken zijn. Pipet de hele liposomeoplossing rechtstreeks op de mica en voeg een extra 140 microliter ondersteunde lipiden dubbellaagbuffer toe om een volume van 300 microliter te bereiken. Voeg vervolgens 0,9 microliter van een eenmolaire calciumchloride-oplossing toe om een eindconcentratie van drie millimolair calcium te bereiken, incubeer de monsters gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius en vervolgens gedurende ten minste 10 minuten bij 65 graden Celsius. Tijdens deze stap verwarmt u ook de ondersteunde lipiden dubbellaagbuffer voor tot 65 graden Celsius.

Voeg eventueel buffer toe om ervoor te zorgen dat het monster niet uitdroogt. Het deksel van de monsterkamer bedekken zal het monster ook gehydrateerd houden. Spoel het monster vervolgens voorzichtig 10 tot 15 keer af met de voorverwarmde lipiden dubbellaagbuffer om het calcium en niet-versmolten blaasjes te verwijderen.

Wees extra voorzichtig tijdens de wasstappen om te voorkomen dat de dubbellaag uitdroogt na de wasstappen. Koel de ondersteunde dubbellagen af tot kamertemperatuur. Voor metingen op de atoomkrachtmicroscoop, stel de atoomkrachtmicroscoop of een FM in om beeldvorming van de lipiden dubbellagen in een oplossing uit te voeren.

Gebruik de contactmodus in overeenstemming met de specificaties van de fabrikant, voeg buffer toe aan het monster om het tijdens het hele experiment in buffer ondergedompeld te houden. Monteer het monster op de A FM-fase en zorg ervoor dat alle trillingsisolatiemodules zijn ingeschakeld. Wacht minimaal 15 minuten totdat het systeem is geëquilibreerd en de thermische drift is verminderd.

Benader vervolgens het monster in contactmodus met een zachte AFM-cantilevertip totdat contact is gemaakt. Omdat dubbellagen erg kwetsbaar zijn, minimaliseer de setpoint van de A FM-tip tijdens contactmodusbeeldvorming om de kracht op een minimum te houden en om correctie te maken voor thermische drift terwijl het contact met het monster wordt gehandhaafd. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwerk de beelden door elke scanlijn aan polynoomniveaufuncties aan te passen.

Verwijder lijnen voor scans die het contact met het membraan verliezen. Gebruik de eigen software van het A FM-fabrikantbedrijf om de cantilever te kalibreren door het protocol van de fabrikant te volgen om de juiste conversie van het elektrische signaal in een krachtmeting te bepalen. Selecteer na het beeldvormen van een gebied van de dubbellaag een gebied van vijf micrometer bij vijf micrometer in de dubbellaag om krachtspectroscopie uit te voeren.

Stel de AFM in zodat deze krachtcurven in een raster van 16 bij 16 van dat gebied maakt,