Name: Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer AFM-beeldvorming en krachtspectroscopie van ondersteunde lipidendubbellagen voor biophysica. Deze methode onthult membraandikte, doorbraakkracht en fasegedrag van biologische membranen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Max Planck Society, de Duitse Cancer Research Center, de universiteit van Tübingen en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (verlenen no. 0312040). Wij danken Eduard Hermann voor het helpen ons de analyse van de kracht curve gegevens en Dr. Jakob Suckale voor een zorgvuldige lezing van dit manuscript automatiseren.

1. Voorbereiding van ondersteunde lipidendubbellagen (SLB) 11,12,21 <ol><li> Voorbereiding van de lipidemengsel en Multilamellaire Vesicle Schorsingen <ol><li> Bereid de volgende buffers vooraf. <ol><li> Bereid PBS-buffer bij concentraties van 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 en 137 mM NaCl, pH 7,2. </li><li> Bereid SLB (ondersteunde lipide dubbellaag) buffer bij concentraties van 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4. </li><li> Bereid een oplossing van 1 M CaCl2. </li></ol></li><li> Los de volgende lipiden in chloroform in een gewenste concentratie: bijvoorbeeld di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC) en 25 mg / ml, sfingomyeline (SM) en 25 mg / ml en cholesterol (Chol) en 10 mg / ml. </li><li> Neem 18.38 ui DOPC, 17,10 pl SM en 11,30 pl Chol om een ​​oplossing met 1 mg totale lipiden in een 2 te: 2: 1 DOPC: SM: Chol molverhouding. Varieer de volumes dienovereenkomstig op basis van de concentrations van de bereide in 1.1.2 lipiden. Toch behouden de molaire verhouding van 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, het veranderen van de molaire verhouding van de fasekenmerken van het membraan 25 te veranderen. </li><li> Meng de oplossing volledig door vortexen. Voeg een fluorescerende kleurstof lipide 0.05 mol% wanneer men wenst de bilaag te visualiseren door een fluorescentiemicroscoop. Opmerking: De familie van lange-keten dialkylcarbocyanines, zoals deed, DII en DIO bestrijken een breed scala van golflengten en kan ideaal gebruikt worden om lipide membranen te labelen. Alternatief kan fluorescerend gemerkte lipiden, zoals rhodamine-fosfatidylethanolamine of BODIPY-cholesterol gebruikt. In ieder geval moet de concentratie van de kleurstof worden geoptimaliseerd afhankelijk van de instelling microscopie, rekening houdend dat hoge concentraties van de fluorofoor gebonden aan het lipide de lipide gedrag 19 kan veranderen. </li><li> Droog het chloroform onder toepassing van N 2 gas (of eventueel beschikbare inert gas zoals Ar en He). </li><li> Verdere droog tHij lipide mengsel onder vacuum gedurende ten minste 1 uur. Opmerking: Als het opslaan van deze lipidemengsel, zuiveren lucht met inert gas (N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C. Aliquot overtollige lipiden-in-chloroform in kleine bruine flesjes. Droog ze op soortgelijke wijze als de lipide mengsel verplaatsen lucht met inert gas (N2, Ar of He) en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Los de gedroogde lipiden in PBS buffer tot een concentratie van 10 mg / ml. </li><li> Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer 20 sec tot 1 min tot een troebele suspensie te krijgen, met multilamellaire blaasjes. Zorg ervoor dat de er geen lipidefilms vastzitten aan de wand van het flesje. </li><li> Verdeel deze suspensie in 10 ul porties (1 mg lipide maakt 10 porties). </li><li> Bewaar bij -20 ° C tot verder gebruik. </li></ol></li><li> Bereiding van Unilamellaire Vesicles Opmerking: Verschillende maten van unilamellaire vesicles kunnen worden bereid met sonicatie werkwijze of extrusiewerkwijze. Sonicatie gebruikt sound energie aan het mengsel roeren en scheid de lagen van de multilamellaire suspensie. Dit wordt aangegeven door het opruimen van de wazige schorsing. Extrusie dwingt de multilamellaire blaasjes door een membraan filter te passeren met een bepaalde poriegrootte. <ol><li> Sonicatie Method <ol><li> Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer. </li><li> Breng het mengsel in kleine (2 ml) afgesloten glazen flesjes en afdichting met Parafilm. </li><li> Ultrasone trillingen het mengsel bij kamertemperatuur in een badsonicator gedurende 10 minuten of totdat het duidelijk wordt op kleine unilamellaire vesicles (SUVs, dan 50 nm in diameter). </li></ol></li><li> Extrusie Method <ol><li> Neem de 10 ul van multilamellaire lipide schorsingen en voeg 150 ul van SLB buffer. </li><li> Breng de suspensie in een cryogene buis. </li><li> Bevries de lipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis gedurende een paar seconden in vloeibare stikstof. </li><li> Ontdooi delipidesuspensie door onderdompeling het cryogene buis in een waterbad bij kamertemperatuur of 37 ° C gedurende enkele minuten. Herhaal de vries-dooi treden minstens 10 keer. </li><li> Om de lipidesuspensie extruderen gebruik een polycarbonaat membraan met 200 nm poriegrootte (met poriegrootten zijn beschikbaar, zoals, 100 nm of 400 nm) en een commercieel extrudeerinrichting 26. Opmerking: Momenteel zijn er twee extrusie apparaten in de handel verkrijgbaar: handmatig extruder is beschikbaar voor kleine volumes (200 pl tot enkele ml). In dit geval wordt het monster geëxtrudeerd door het membraan door handmatig indrukken van de suspensie heen en weer tussen twee spuiten. Afhankelijk van de fabrikant, zou lipide fracties moeten worden gecombineerd om minimum volume van de set-up te bereiken. Voor grotere volumes (tot 50 ml) meer geavanceerde apparaten worden gebruikt, waarin de suspensie wordt gedwongen door het polycarbonaatmembraan met gecomprimeerd gas. Set-up en de extrusie-omstandigheden kan volgens de mod te veranderenel. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor gebruik. Dit protocol betreft de handleiding extruder voor kleine volumes. </li><li> Equilibreren de extruder in het water door het passeren van water door de extruder. Dompel het membraan in water. </li><li> Plaats het membraan tussen de beide zuigers, assembleren het apparaat en equilibreren buffer door het passeren van de buffer door de extruder, van de ene spuit naar de andere. Deze stap maakt bovendien het testen van de leakiness van het systeem. Als het lekt, demonteren en weer opnieuw het veranderen van de membraan. </li><li> Neem de lipidesuspensie via een spuit van de extruder (&#39;vuile kant&#39;). </li><li> Bevestig de spuit met de lipidesuspensie op een kamer en de lege injectiespuit op de tegenoverliggende kamer. </li><li> Duw de spuit op een einde. Laat de oplossing door het membraan en in de tegenoverliggende injectiespuit. Dit is de 1 ste pass. </li><li> Geef het door het membraan voor een totaal van 31 keer een dergelijkedat de oplossing terecht in de vijandelijke spuit (&quot;clean side&quot;). Opmerking: Controleer het membraan na extruderen. Wanneer het was gebroken, vervolgens extrusiewerkwijze niet succesvol en moet worden herhaald. </li><li> Leeg de spuit in een kleine buis. Grote unilamellaire vesikels (LUV&#39;s) zijn houdbaar 1-2 dagen als bij 4 ° C bewaard. </li></ol></li></ol></li><li> Voorbereiding van Mica en Coverslips <ol><li> Wash coverslips eerst in water en vervolgens in ethanol. Luchtdroog. </li><li> Neem mica schijven en loslaten van de buitenste laag met plakband. </li><li> Bevestig de mica schijf op het dekglaasje. Transparante optische lijmen zijn optimaal, zodat men de dubbellagen kunnen controleren met een fluorescentiemicroscoop. </li><li> Bevestig plastic cylinders (2,5 cm buitendiameter, 2 cm binnendiameter en 0,5 cm hoogte) met optische lijm / vet. Zorg ervoor dat alles is afgesloten en dat er geen lekken zijn. Gebruik vet wanneer willen hergebruiken de cilinders omdat ze gemakkelijk kunnen worden losgemaakt van the dekglaasje en gewassen. De afmetingen van de plastic cilinder afhankelijk van de grootte van de AFM cantilever houder en moeten dienovereenkomstig worden aangepast. </li></ol></li><li> Afzetting van Unilamellaire blaasjes op Solid Ondersteuning <ol><li> Pipet geheel liposoomoplossing direct op het mica. Voeg meer SLB buffer tot een volume van 300 pi te bereiken. </li><li> Voeg 0,9 gl 1 M calciumchloride-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 3 mM Ca2 + bereiken. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 minuten en vervolgens bij 65 ° C gedurende ten minste 10 min. Bedek altijd de dubbellagen met buffer. Contact met bubbels lucht en lucht zal vernietigen. Tijdens incubatie voeg meer buffer eventueel name als incuberen bij hogere temperaturen. Opmerking: Incubatie temperatuur varieert afhankelijk van de lipidemengsels en fasen vereist. Incubatie van ten minste 10 minuten is nodig ondersteund bilagen vormen, maar kan langer zijn, afhankelijk van de temperatuur en samenstelling. </li><li> Wassende bilaag met warm (65 ° C) SLB buffer 15-20 maal calcium en gefuseerde vesicles te verwijderen. Neem extra zorg tijdens de wasstappen om de bilaag onder buffer te houden en voorzichtig pipet de was- oplossing om te voorkomen dat het vernietigen van de bilaag. </li><li> Cool ondersteund bilayers op kamertemperatuur voordat AFM metingen. Dit is nodig om de verschillende fasen van het membraan en minimaliseren thermische drift in het apparaat. </li></ol></li></ol> 2. Atomic Force Microscopy Metingen 11,12 <ol><li> Imaging Opmerking: Voer atoomkrachtmicroscopie beeldvorming in contact modus of tikken mode. Beeldondersteund bilagen in oplossing; niet mogelijk oplossing verdampen omdat dit de dubbellagen zal vernietigen. Zoals men zou werken met buffer, in acht nemen veiligheidsmaatregelen om ervoor te zorgen dat elke AFM deel is beschermd tegen gemorste vloeistoffen. <ol><li> Selecteer een zachte cantilever (onder 0,2 N / m veerconstante wordt geadviseerd) en monteer het aan tHij AFM. De keuze van de cantilever stijfheid is van cruciaal belang voor kracht spectroscopie (en dit zal later worden besproken). </li><li> Monteer het monster op de AFM podium en ervoor te zorgen dat alle vibratie-isolatie modules zijn ingeschakeld. Wacht tenminste 15 min equilibreren en verminderen thermische drift van het systeem. Afhankelijk van de AFM set-up, kan tuning en imaging specificaties verschillen. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant. </li><li> Benader het monster met de AFM tip tot contact. </li><li> Omdat lipide bilagen gewoonlijk 4 nm in lengte, met de Z-bereik van het instrument dat de hoogste z-resolutie (bijvoorbeeld 1,5 pm) zal geven. </li><li> Selecteer een regio om de afbeelding. Om een ​​overzicht van de lipide bilaag, een 50 um x 50 urn of 25 urn x 25 urn regio zal een goed uitgangspunt om de afbeelding te krijgen. Als kleinere functies verschijnen, kan men het in kleinere gebieden (10 micrometer x 10 micrometer, of 2 micrometer x 2 pm). De keuze van het opnamegebied ook afhankelijk van de werkende range van de piëzo-elektrische scanner. Raadpleeg de handleiding voor dit instrument. </li><li> Zoals dubbellagen zijn erg kwetsbaar, passen het setpoint van de AFM tip tijdens de beeldvorming om de kracht op minimum en correct voor thermische drift te houden, terwijl het contact met het monster. In contact modus, het minimaliseren van het setpoint. In de tapping mode, het maximaliseren van de setpoint. </li><li> Proces beelden door het aanbrengen van elke scan lijn naar polynoom nivellering functies. Voer lijn verwijdering voor scans dat contact met het membraan met behulp van de eigen software van de AFM productiebedrijf verliezen. </li></ol></li><li> Force Spectroscopie <ol><li> Kalibreren van de cantilever de instructies volgens het protocol van de fabrikant. Kalibratie kan de omzetting van het elektrische signaal van de fotodiodes kracht (Figuur 1B). <ol><li> Kalibreren de gevoeligheid van de tip om afbuiging als z-piëzo-beweging (in eenheden van lengte) te meten in plaats van het elektrisch signaal in Volt. <br /&gt; Opmerking: AFM detecteert veranderingen in de vervorming van de cantilever met een laser gereflecteerd aan de achterkant van de cantilever. De laser bereikt een fotodiode die ruimtelijk de positie van de laserspot kan detecteren. Een verandering van de doorbuiging van de cantilever als het na contact met het monster buigt wordt gemeten door deze fotodiode als &quot;verticale afbuiging&quot;, en dit in de eenheden van spanning. Aangezien de cantilever wordt verplaatst door de z-piëzo, wordt de vertikale afbuiging in verband met de beweging in de z-piëzo. De verhouding tussen de verticale doorbuiging en z-beweging gevoeligheid genoemd en zet spanning op afstand. </li><li> Bereken de cantilever veerconstante met behulp van de thermische ruis frequentie methode, meestal opgenomen in het AFM software. In deze werkwijze plot de trillingsamplitude van lawaai wat betreft oscillatiefrequentie, waardoor een spectrale vermogensdichtheid plot. Dit perceel zal een piek rond de resonantiefrequentie te tonen. De frequentie waar de amplitude is de grootste is de resonantiefrequentie. Breng een Lorentziaanse functie rond de piek automatisch berekenen van de veerconstante van de software. Enkele nuttige middelen voor de theorie van de thermische ruis methode worden gegeven in de referenties 27-30. </li></ol></li><li> Na het afbeelden van een gebied van de bilaag, selecteer een 5 urn x 5 urn gebied in de bilaag te dwingen spectroscopie. </li><li> Stel de AFM, zodat het duurt kracht bochten in een 16 x 16 raster van die regio. Dit resulteert in 256 van kracht curves per regio. De ruimte tussen twee aangrenzende punten moet genoeg om te voorkomen dat het membraanoppervlak wordt gesondeerd met een punt samenvalt met het volgende punt. Dit is afhankelijk van de tip radius. Een 100 nm afstand tussen twee punten zou ideaal zijn. Verdeel de 5 micrometer x 5 micrometer regio in 16 x 16-raster. Afhankelijk van de grootte van de fase, kan men een kleiner of een groter gebied te selecteren en aan te passen de rastergrootte. </li><li> Stel z-piëzo verplaatsing naar400 nm. Dit bepaalt het maximale bereik van de beweging van de z-piëzo. Het moet groot genoeg zijn om ervoor te zorgen dat de cantilever volledig verwijderd is teruggetrokken uit het monster tussen metingen. </li><li> Stel aanpak snelheid tot 800 nm / sec en trek snelheid tot 200 nm / sec. Gebruik naderingssnelheid tussen 400 tot 6000 nm / sec afhankelijk van de bilaag samenstelling en lipidefase te bestuderen 6,16. </li><li> Na het instellen van alle parameters, te verwerven kracht bochten, door op de &quot;run&quot; knop van de AFM software. </li><li> Sla kracht curves als kracht versus hoogte curves (een maat voor de z-piëzo-beweging). Dit houdt geen rekening met het buigen van de cantilever bij contact met het monster. Tijdens de verwerking van gegevens stap, de AFM software maakt correctie voor cantilever buigen tot kracht vs. tip-sample scheiding curves (figuur 1C), die de juiste waarden voor tweelaags dikte zal geven te krijgen. De correctiewaarden gebruikelijke wijze gedispergeerd in de kalibratie, die wordt opgeslagen met elke kracht curve. Bereken tip-sample scheiding door het aftrekken van de vertikale afbuiging van de piëzo beweging op een bepaald moment. Opmerking: De piek in de benadering krachtcurve (de krachtwaarde ondergaat zelfs als de cantilever beweging nog op de aanpak cyclus) is de doorbraak kracht van het membraan, terwijl het verschil tussen de positie van deze piek en de positie van het punt indien de kracht begint te stijgen weer geeft de dikte van het membraan. </li><li> Verwerven van minstens 500 kracht curves voor elke voorwaarde om goede statistieken te krijgen. Maak een histogram van de waarden met behulp van programma&#39;s zoals Origin of MatLab, en passen de histogrammen een Gaussische verdeling naar de top en de breedte van de distributie te krijgen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy%3A+Application+to+Biology+and+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li>
<li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+of+biological+complexes%3A+What+can+we+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Curr%2C+Opin.+Colloid+In%22%5BJournal%5D)">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li>
<li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRedondo-Morata%2C+L+%22Atomic+Force+Microscopy+in+Liquid%3A+Biological+Applications%22">Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications</a>. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. </a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li>
<li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li>
<li>Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li>
<li>Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li>
<li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers%3A+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li>
<li>Butt, H. -J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601(2002).</li>
<li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li>
<li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide%3A+a+combined+AFM+and+FCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li>
<li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide%3A+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li>
<li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+future+of+scanning+probe+microscopy%3A+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques%2C+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+Systems%2C+Lipid+Rafts%2C+and+Cell+Membranes1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Bioph.+Biom%22%5BJournal%5D)">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rafts+defined%3A+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li>
<li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).</li>
<li>Butt, H. -J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).</li>
<li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).</li>
<li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).</li>
<li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li>
<li>Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+physical+journal.+E%2C+Soft+matter%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li>
<li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li>
<li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li>
<li>Rigaud, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

SLBs samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) gevormd op mica na vesicle adsorptie en scheuren geïnduceerd door calciumchloride. Deze lipidepreparaat gescheiden in Ld en L o fasen. De Lo fase verrijkt met cholesterol en sfingomyeline en is minder vloeibaar / viskeus (figuur 1A) dan Ld fase 11. De scheiding van Lo van Ld fase manifesteert als cirkelvormige structuren boven de omringende (Figuur 1B, C) ​​verhoogd. D...

Atomic Force Microscopy (AFM) genereert een beeld van een oppervlak door het scannen van een gebied van het monster met een vrijdragende ligger met een zeer scherpe punt 1. De beweging van de cantilever sondes het oppervlak topologie van het monster. AFM is op grote schaal toegepast om biologische moleculen - zoals eiwitten, DNA en membranen vanwege zijn veelzijdigheid analyseren gefixeerde monsters in lucht of bijna-natieve toestand in vloeibare 2-5. Afgezien van de hoge-resolutie beeldvorming vermogen in het nanobereik, de AFM cantilever werkt als een veer interactiekrachten (adhesie en afstoting) en mechanische eigenschappen van het monster 5,6 sonde. Dit staat bekend als kracht spectroscopie. In deze modus wordt de eerste probe nadert het monster en een kracht uitoefent op, dan wordt teruggetrokken totdat het contact verliest met het monster (Figuur 1A). De gegenereerde curven kracht als functie van de afstand van de cantilever voor zowel appvoorn en intrekken. Verschillende eigenschappen inclusief de elasticiteitsmodulus de stijfheid van een materiaal te meten, en adhesie krachten kunnen worden afgeleid. Ondersteunde lipide bilagen zijn biologische modelmembranen liggen boven op een vaste drager - gewoonlijk mica, borosilicaatglas, kwartsglas of geoxideerd silicium 7. Ze worden bereid met behulp van verschillende technieken zoals blaasje depositie, Langmuir-Blodgett methode en de spin-coating 8,9. AFM beeldvorming wordt gebruikt om de vorming van deze ondersteunde dubbellagen 10 volgen en sonde verschillende structuren gevormd door membranen met verschillende samenstellingen 11-15. Het uitvoeren van kracht spectroscopie op ondersteunde bilayers resulteert in een piek in de aanpak curve. Deze piek geeft de kracht nodig om de bilaag doorboren, en heet doorbraak kracht. De dubbellaag dikte kan ook worden gemeten met de krachtcurve 6. De typische doorbraak kracht van dubbellagenrange tussen 1-50 nN 6. Deze eigenschappen zijn afhankelijk van lipiden verpakking (vloeibare of gelfase) en structuur (acyl ketenlengte en mate van onverzadiging) en veranderd door membraan-actieve middelen 16. De theorie achter de breuk is uitgelegd 17 en andere experimentele parameters zoals cantilever zachtheid, tip radius en aanpak van de snelheid ook van invloed op de doorbraak kracht 15,16,18. Force spectroscopie werd gebruikt om de eigenschappen van verschillende lipide fasen 11,19, preparaat-afhankelijke veranderingen 12,20, en effecten van andere biomoleculen, zoals peptiden analyseren op de stabiliteit van het membraan 21. De vlakke oriëntatie ondersteunde bilagen voordelig te combineren AFM met andere methoden zoals oppervlakte plasmon resonantie 22 en fluorescentiemicroscopie 11,19 beter te karakteriseren structuur en eigenschappen van de membranen. Deze gedetailleerde video protocol is bedoeld om ondersteund lipidendubbellagen bereiden met behulp van blaasje afzetting en analyseren ze met de AFM en de kracht spectroscopie. Hoewel vesicles met verschillende grootte worden gebruikt om dubbellagen bereiden dit protocol is gericht op kleine en grote unilamellaire vesicles. Ondersteunde dubbellagen die fase scheiden in vloeibare besteld (L o) en vloeibare ongeordende (L d) fasen werden gekenmerkt 11,15. Het membraan bestaat uit di-oleoyl-fosfatidylcholine (DOPC), sfingomyeline (SM), en cholesterol (Chol) en 2: 2: 1 ratio. Deze samenstelling modellen de lipide vlotten, die worden voorgesteld om zich te gedragen als platforms van belang voor eiwit mensenhandel en sorteren, cell signaling en andere cellulaire processen 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Komt als lyofilisaatpoeder in verzegelde flesjes. Los al het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20&nbsp;&deg;C. Bezoek <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;view=article&amp;id=1679&amp;Itemid=398">hier</a> voor meer informatie over opslag en hantering.</td></tr><tr><td>Sphingomyeline (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Komt als lyofilisaatpoeder in grote verzegelde kunststof containers. Los een punt van de spatel van het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20&nbsp;&deg;C. Bezoek <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;view=article&amp;id=1679&amp;Itemid=398">hier</a> voor meer informatie over opslag en hantering.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Komt als lyofilisaatpoeder in grote verzegelde kunststof containers. Los een punt van de spatel van het poeder op in chloroform bij opening. Bewaar extra als gedroogde lipidefilms, onder inert atmosfeer, bij -20&nbsp;&deg;C. Bezoek <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;view=article&amp;id=1679&amp;Itemid=398">hier</a> voor meer informatie over opslag en hantering.</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl), 99,8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloridedihydraat (CaCl2), moleculaire biologie kwaliteit</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, moleculaire biologie kwaliteit</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksel, 24&nbsp;x&nbsp;60&nbsp;mm, 1&nbsp;mm dikte</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optische lijm</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Vloeibare lijm die hard wordt wanneer uitgehard onder langgolf UV-licht.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blokken</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Dit zijn mica stukken met minstens 1 vierkante inch oppervlakte en een dikte variërend van 0,006 inch tot 0,016 inch. Ze worden door het bedrijf op een specifieke maat gesneden voor verzending. Kleine mica schijven kunnen uit de mica blokken worden geponst met behulp van de punch and die set.&nbsp; Behandel mica altijd met handschoenen of pincetten.</td></tr><tr><td>Laboratoriumapparatuurvet</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposomenextruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Als alternatief kunt u ook kijken naar aanbiedingen van Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Zelfklevende tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Geen verwarming, Frequentie: 35 kHz, Ultrasone piekuitgang: 160 W, HF-vermogen: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Gegevensblad</a>)</td></tr><tr><td>Silicionitride AFM Cantilever&nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Elke cantilever heeft vier tips en hun nominale tipradius is 20 nm (met mogelijk maximum bij 60&nbsp;nm). Op basis van de specificaties, gebruiken we tip D met een resonantiefrequentie van 18 kHz, en een nominale veerconstante van 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II gemonteerd op Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging en force spectroscopie van ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomaire krachtmicroscopie (AFM) is een veelzijdige, hoogwaardige beeldvormingstechniek die de visualisatie van biologische membranen mogelijk maakt. Het heeft voldoende vergroting om membraansubstructuren en zelfs individuele moleculen te onderzoeken. AFM kan fungeren als een krachtsonde om interacties en mechanische eigenschappen van membranen te meten. Ondersteunde lipide dubbellagen worden conventioneel gebruikt als membraanmodellen in AFM-studies. In dit protocol laten we zien hoe ondersteunde dubbellagen worden bereid en hoe hun structuur en mechanische eigenschappen met behulp van AFM worden gekarakteriseerd. Dit omvat de dikte van de dubbellaag en de doorbraakkracht.
De informatie die wordt geleverd door AFM-beeldvorming en krachtspectroscopie helpt bij het definiëren van de mechanische en chemische eigenschappen van membranen. Deze eigenschappen spelen een belangrijke rol in cellulaire processen zoals het handhaven van celhomeostase tegen omgevingsstress, het samenbrengen van membraaneiwitten en het stabiliseren van eiwitcomplexen.

Ondersteunde lipide bilagen samengesteld DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) werden afgebeeld in AFM (figuur 2 AC). Door de lipidensamenstelling SM / Chol-rich Lo en DOPC-rijke Ld fasen waargenomen. De hoogte van het profiel van de AFM beeldvorming kan belangrijke informatie over het membraan structuur. Door naar het hoogteprofiel kan de dubbellaag dikte gemeten in aanwezigheid van defecten in het membraan (Figuur 2B) of het hoogteverschil tussen de L o / Ld</...

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de fysische eigenschappen van fasescheidende membranen in beeld te brengen en te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst dilio, fosfatidylcholine, fgo, myeline en cholesterol in een verhouding van twee op twee op één te mengen om een fasescheidend lipidemengsel te vormen. Vervolgens worden de ondersteunde lipide dubbellagen geprepareerd door de liposoomsuspensie op een MICA-oppervlak aan te brengen met behulp van atoomkrachtmicroscopie.Vervolgens wordt het oppervlak van de dubbellaag gescand, waardoor een topografisch beeld ontstaat waarin structurele kenmerken zoals de hoogte kunnen worden gemeten. Daarna wordt er krachtspectroscopie uitgevoerd op specifieke gebieden van de dubbellaag om de fysische eigenschappen van de dubbellaag te onderzoeken, in het bijzonder de doorbraakkracht en de membraandikte. Uiteindelijk tonen de resultaten, op basis van FM-beelden en krachtcurves, verschillen in eigenschappen tussen verschillende lipidefasen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals fluorescentiemicroscopie is de verhoging van de resolutie en de aanvullende eigenschappen die een FM kan onderzoeken in het monster. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de biofysica, zoals de structuur van biologische membranen en eiwitten die in dergelijke membranen zijn ingebed. Bovendien kunnen we ook kijken naar de fysische eigenschappen van het membraan en monitoren hoe veranderingen in de samenstelling of de toevoeging van membraanactieve stoffen deze eigenschappen kunnen beïnvloeden.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de fragiele aard van het monster. Dit heeft gevolgen voor de monstervoorbereiding, de hantering, de keuze van de cantilevers en de condities voor FM-imaging en spectroscopie. Begin met het oplossen van DOPC, sphingomyeline en cholesterol in chloroform in de gewenste concentraties. Combineer vervolgens 18,38 µL DOPC, 17,1 µL sphingomyeline en 11,3 µL cholesterol om een oplossing te maken met één mg aan totale lipiden en een molaire ratio van respectievelijk twee op twee op één.Meng een oplossing door te vortexen, droog het mengsel met een inert gas zoals stikstof en droog het vervolgens verder onder vacuüm gedurende ten minste één uur. Los daarna de gedroogde lipiden op in 100 µL PBS tot een concentratie van 10 mg/mL. Vortex het mengsel krachtig gedurende ongeveer één minuut.Om een troebele suspensie te verkrijgen die multilamellaire vesikels bevat. Zorg ervoor dat er geen lipidefilms aan de wanden van het vial achterblijven. Neem 10 µL van de multilamellaire lipidesuspensie en voeg 150 µL ondersteunde lipide-dubbellaagbuffer toe.Meng vervolgens de oplossing, breng deze over naar een klein glazen vial van twee milliliter met dop en sluit deze af met parafilm. Sonicate het mengsel bij kamertemperatuur in een sonicatiebad gedurende 10 minuten. Gedurende deze tijd moet de oplossing helder worden, wat resulteert in kleine unilamellaire vesicles met een diameter van ongeveer 50 nanometers.Was de glazen dekglasjes in water, gevolgd door ethanol, en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Neem vervolgens de mica-schijfjes en verwijder de buitenste laag met behulp van plakband. Bevestig de mica-schijf aan een dekglasje met een druppel transparante, optisch heldere lijm.Bevestig vervolgens plastic cilinders aan de MICA met vacuümvet en zorg ervoor dat er geen lekken zijn. Pipetteer de volledige liposoomoplossing direct op de mica en voeg nog 140 µL ondersteunde lipide-dubbellaagbuffer toe om een volume van 300 µL te bereiken. Voeg daarna 0,9 µL van een 1 M calciumchloride-oplossing toe om een eindconcentratie van 3 mM calcium te bereiken, incubeer de monsters gedurende twee minuten bij 37 °C en vervolgens gedurende ten minste 10 minuten bij 65 °C; verwarm tijdens deze stap ook de ondersteunde lipide-dubbellaagbuffer voor tot 65 °C.Voeg indien nodig buffer toe om te voorkomen dat het monster uitdroogt. Het afdekken van de monsterkamer met een dekglas helpt ook om het monster gehydrateerd te houden. Spoel het monster vervolgens voorzichtig 10 tot 15 keer met de voorverwarmde supported lipid bilayer buffer om het calcium en de niet-gefuseerde vesicles te verwijderen.Neem tijdens de wasstappen extra zorg om te voorkomen dat de dubbellaag na de wasstappen uitdroogt. Koel de ondersteunde dubbellagen af tot kamertemperatuur. Stel vóór de metingen met de atoomkrachtmicroscoop de atoomkrachtmicroscoop of een FM in om beeldvorming van de lipidedubbellaagen in een oplossing uit te voeren.Voeg, met gebruik van de contactmodus conform de specificaties van de fabrikant, buffer toe aan het monster om ervoor te zorgen dat dit gedurende het gehele experiment in de buffer ondergedompeld blijft. Monteer het monster op de AFM-tafel en controleer of alle trillingsisolatiemodules zijn ingeschakeld. Wacht ten minste 15 minuten zodat het systeem kan equilibreren en de thermische drift kan afnemen.Benader vervolgens het monster in contactmodus met een zachte AFM-cantilevertip totdat er contact is gemaakt. Aangezien dubbellagen zeer fragiel zijn, moet het setpoint van de AFM-tip tijdens beeldvorming in contactmodus worden geminimaliseerd om de kracht minimaal te houden en te corrigeren voor thermische drift, terwijl het contact met het monster behouden blijft. Zodra de beeldvorming is voltooid, worden de beelden verwerkt door elke scanlijn aan polynoom-nivelleringsfuncties aan te passen.Voer lijnverwijdering uit voor scans waarbij het contact met het membraan verloren gaat. Kalibreer de cantilever met de eigen software van de fabrikant van de AFM door het protocol van de fabrikant te volgen, om de juiste omzetting van het elektrische signaal naar een krachtmeting te bepalen. Selecteer na het afbeelden van een gebied van de dubbellaag een regio van vijf micron bij vijf micron in de dubbellaag om krachtspectroscopie uit te voeren.Stel de AFM's zo in dat er krachtcurves worden opgenomen in een rooster van 16 bij 16 in dat gebied, wat resulteert in 256 krachtcurves per gebied. Stel vervolgens de Z-piezo verplaatsing in op 400 nanometers. Dit bepaalt het maximale bewegingsbereik van de z-piezo en zorgt ervoor dat de cantilever tussen de metingen door volledig is teruggetrokken van het monster.Stel vervolgens de benaderingsnelheid in op 800 nanometers per seconde en de terugtreksnelheid op 200 nanometers per seconde. Stel daarnaast de maximale doelforce in voor elke krachtcurve, in dit geval 12 nano Newton. Nadat alle parameters zijn ingesteld, kunnen de krachtcurves worden verkregen door op de run-knop van de AFM-software te drukken.Veramel ten minste 500 krachtcurves voor elke conditie om goede statistieken te garanderen, maak een histogram van de waarden en fit deze histogrammen vervolgens aan een Gaussische distributie om de piek en de breedte van de distributie te bepalen. Vanwege de lipidensamenstelling die in deze studie wordt gebruikt, worden er twee hoofdgebieden in het membraan gevormd. Er is een vloeibaar geordend gebied dat is samengesteld uit fing, myelien en cholesterol, en een vloeibaar ongeordend gebied dat hoofdzakelijk is samengesteld uit DOPC.Het hoogteprofiel van de AFM-beeldvorming kan belangrijke informatie over de membraanstructuur verschaffen door het hoogteprofiel te analyseren. De dikte van de dubbellaag kan worden gemeten door gebruik te maken van de aanwezigheid van defecten in het membraan. De hoogtemap kan ook worden gebruikt om het hoogteverschil tussen de geordende en ongeordende fasen te meten.De krachtcurven die zijn afgeleid uit de krachtspectroscopie-modus worden gebruikt om de doorbraakkracht te meten door de krachtwaarde op de piek van de krachtcurve te bepalen, zoals hier wordt getoond. Daarnaast kan de membraandikte worden afgeleid door de afstandswaarde van de piek van de krachtcurve af te trekken van de afstandswaarde op het moment dat de krachtcurve opnieuw begint te stijgen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de B-laagoplossing te behouden en de FM-assemblage constant te monitoren om te corrigeren voor de effecten van thermische drift en D-accumulatie op de tip na het volgen van deze procedure.Andere methoden, zoals confocale fluorescentiemicroscopie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals over membraandynamica. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u ondersteunde lipidenbilagen bereidt en hoe u een FM gebruikt om de fysieke eigenschappen van deze bilagen te beelden en te onderzoeken.

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate protein-phosphoinositide interactions in a microfluidic pattern using the pH modulation assay, using pH-sensitive fluorescent dye tagged to phosphatidylethanolamine lipid of a supported lipid bilayer, called a microfluidic platform. The modulations in pH after protein binding to phospholipid cause fluorescence quenching.

pH Modulation Assay on Supported Lipid Bilayers to Detect Protein-Phosphoinositide Interactions

We presenteren een werkwijze voor het bereiden mica ondersteunde lipide bilagen voor hoge resolutie microscopie. Mica is transparant en plat op atomaire schaal, maar zelden gebruikt in de beeldvorming als gevolg van de behandeling van problemen; onze voorbereiding leidt zelfs afzetting van het mica plaat, en vermindert de gebruikte bilaag bereiding materiaal.

Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We presenteren een experimenteel protocol naar een ondersteunde lipidebilaag op vaste substraten te vormen zonder gebruik van lipide blaasjes. We tonen een eenstaps werkwijze op een lipide dubbellaag op siliciumdioxide en goud en ondersteunde membranen met cholesterol verrijkte domein voor verschillende biologische toepassingen te vormen.

Biomembraan Fabrication door de Solvent-geassisteerde lipidedubbellaag (SALB) Methode

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Hier presenteren we een protocol om enkele, SNARE-bemiddelde fusie gebeurtenissen tussen liposomen en ondersteund dubbellagen in microfluïdische kanalen met gepolariseerde TIRFM, met 'single molecule gevoeligheid en ~ 15 msec tijdsresolutie te detecteren. Lipide en oplosbare lading afgifte kan gelijktijdig worden gedetecteerd. Liposoom grootte, lipide diffusie, en fusie porie eigenschappen worden gemeten.

SNARE-gemedieerde Fusie van Single proteoliposomen met Tethered Ondersteund dubbellagen in een microfluïdische Flow Cell gecontroleerd door gepolariseerde TIRF Microscopie

We presenteren een methode voor het bereiken van sub-nanometer resolutie beelden met amplitude-modulatie (tapping mode) atomic force microscopy in vloeistof. De methode wordt gedemonstreerd op de commerciële atomic force microscopen. We leggen de grondgedachte achter onze keuzes van de parameters en suggereren strategieën voor het oplossen van optimalisatie.

Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Het kwantificeren van het contactoppervlak en de kracht die door een atoomkrachtmicroscoop (AFM) sondepunt op een monsteroppervlak wordt uitgeoefend, maakt mechanische eigenschapsbepaling op nanoschaal mogelijk. Best practices voor het implementeren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie in lucht of vloeistof op zachte en harde monsters om elastische modulus of andere nanomechanische eigenschappen te meten, worden besproken.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanische eigenschapsmetingen op nanoschaal in lucht en vloeistof

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer AFM-beeldvorming en krachtspectroscopie van ondersteunde lipidendubbellagen voor biophysica. Deze methode onthult membraandikte, doorbraakkracht en fasegedrag van biologische membranen.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Meer video's verkennen