Spot de juiste Tissue Every Time in Multi-weefsel Blocks
31 mei 2015
Het doel van het Specimen Orientation Tag (spot) is gefunctioneerd als leidraad ter te helpen bij individuele identificatie weefsel in meerdere weefsels paraffineblokken. Deze protocollen laten zien hoe dit is opgebouwd uit zachte, low-cost histologie materiaal en dient als een betrouwbare visuele marker in paraffineblokken en secties.
Het algemene doel van deze procedure is om een hulpmiddel te construeren om te helpen bij weefselidentificatie in paraffineblokken met meerdere weefsels. Dit wordt bereikt door eerst HistoGel te combineren met weefselmarkeringsverf om een felgekleurde gelplug te vormen. De tweede stap is om de gekleurde HistoGel-pluggen te verwerken en in te bedden volgens standaard weefselverwerkings- en inbeddingstechnieken.
Vervolgens wordt een biopsiepons gebruikt om de kleine cilinders te verwijderen. Dit zijn oriëntatietags of spotjes voor de specimen. De laatste stap is om de spot in een blok met meerdere weefsels in te bedden, waarbij de locatie van de spot en elk monster zorgvuldig worden gedocumenteerd voor gemakkelijke referentie.
Uiteindelijk biedt de spot een duidelijke visuele aanwijzing voor specimenoriëntatie en identificatie in weefselarrays en meervoudige weefselblokken. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals hechtingen of asymmetrische kernen is dat de spot het weefsel niet verandert en flexibiliteit biedt in de rangschikking van de monsters voor optimale analyse. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we verzoeken ontvingen van onderzoekers om weefselmonsters van meerdere dieren te combineren in een enkele paraffineblok om geld te besparen en de analyse te vereenvoudigen. Om de spots voor te bereiden, begint u met het toevoegen van 50 milligram biochemische kwaliteit BSA aan één milliliter weefselmarkeringsverf in een conische buis van 15 milliliter.
Vortex de mix gedurende ten minste één minuut totdat deze volledig is opgelost. Laad vervolgens negen milliliter hydroxyethyl aros verwerkingsgel in een conische buis van 15 milliliter en verwarm het in een magnetron op 30% vermogen. Geef de warmte in stappen van tien seconden totdat het gel volledig is gesmolten.
Combineer nu het gesmolten verwerkingsgel en de verf BSA-oplossing in een enkele conische buis van 15 milliliter en meng het grondig met een pipet. Vorm vervolgens de oplossing en breng deze over in een koelkast gedurende enkele uren om te laten stollen. Eenmaal geharde, verwijdert u het vaste dilataat in gel door het voorzichtig los te maken met een smalle spatel.
Snijd de plug in secties van vijf millimeter dik. Gebruik niet de afgeronde uiteinden. Breng drie tot zes secties over naar een histologiecassette en dompel ze onder in 70% Ethanol, ververs de 70% ethanoloplossing elke twee tot vier uur, en minstens drie keer gedurende 24 uur totdat de pluggen volledig zijn uitgedroogd.
Ze zullen een deel van de markeringsverf in de ethanoloplossing laten lekken. Het gebruik van verse ethanoloplossingen helpt aanvankelijk om wat van de overtollige verf weg te spoelen, wat resulteert in een schonere plug die minder snel kleur zal uitlekken. Breng vervolgens de cassettes over in 80% ethanol en vervolgens in 95% ethanol gedurende één uur in elk bad.
De verf kan uit de gelplug lekken, wat andere weefsels en de vloeibare reagentia in een geautomatiseerd weefselprocessor kan beïnvloeden. Daarom wordt handmatige uitdroging ten zeerste aanbevolen. Geautomatiseerde verwerking is evenwel even effectief.
Voltooi de uitdroging met drie wasbeurten in 100% ethanol gedurende een uur elk. Maak de monsters helder door ze drie keer gedurende één uur in elk bad in atische koolwaterstoffen of xyleen te dompelen. Infiltreer vervolgens de secties met drie baden van één uur.
In gesmolten paraffine. Bewerk de verwerkte secties zoals gebruikelijk, en wanneer de blok op kamertemperatuur is, gebruik een dermale ponsnaald om spotkernen te maken. Eén blok kan kernen van 22 millimeter of zelfs meer van 1,5 millimeter maken.
Begin met het maken van een diagram om de gewenste locaties en identiteiten van alle individuele weefselstukken die samen moeten worden ingebedden en de locatie van de spot aan te geven. Bereid een kopie voor om bij de hand te houden. Succesvol gebruik van specimenoriëntatietags vereist een duidelijke en gemakkelijk te volgen biospecimen-map die nauwkeurig alle biospecimens, hun locatie en hun positie ten opzichte van de spot beschrijft.
Na het verwerken van de weefselstukken, rangschik ze op de inbeddingsstation. Volgens het weefseloriëntatiediagram is de juiste oriëntatie absoluut cruciaal. Het is ook van vitaal belang dat de spotkern hoger is dan alle weefselstukken die in de blok zullen worden ingebedden.
Na het voltooien van de weefselrangschikking, bewerk de spots. Houd elke spot rechtop met een pincet totdat de paraffine is gestold, zodat het niet omvalt. Een minuut of twee zou voldoende moeten zijn.
Voor een handmatig TMA-kit, vul de TMA-mal met gesmolten paraffine. Terwijl de mal afkoelt, bevestig de spots op een vergelijkbare manier aan de arraymarges. Snijd nu en kleurt de secties met de spot.
Met behulp van een standaardbenadering worden hier secties van vijf micrometer gemaakt. Om de secties op dia's te plaatsen, laat ze drijf in een waterbad van 40 graden Celsius, en breng ze vervolgens over naar positief geladen glazen dia's. Eenmaal aan de dia's gehecht, droog ze gedurende minstens 20 minuten bij 60 graden Celsius.
De dia's kunnen nu handmatig worden gekleurd of op een geautomatiseerd kleursysteem. Voor routine h en d kleuring, speciale kleurstoffen of immunohistochemie spots verschenen als een ronde felgekleurde. in de paraffineblok en in alle paraffinesecties.
Spots maakten het gemakkelijk om te oriënteren en weefsels te identificeren in blokken met meerdere weefsels met vergelijkbare uiterlijke weefsels van verschillende individuen en behandelingsgroepen. Wanneer gebruikt in een weefsel, maakten microarray spots het mogelijk dat elke kern werd gebruikt voor waardevolle weefselmonsters en spots konden gemakkelijk worden uitgekozen naast een weefselmicroarray-kern. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat nauwkeurige en duidelijke documentatie van het biospecimen en de spot in de blok essentieel is voor het succesvolle gebruik ervan.
Na het bekijken van deze video, zou
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De Specimen Orientation Tag (SpOT) is ontworpen om te helpen bij het identificeren van individuele weefsels binnen paraffineblokken met meerdere weefsels. Dit artikel beschrijft de constructie van de SpOT met behulp van toegankelijke histologische materialen, om ervoor te zorgen dat deze dient als een betrouwbare visuele markering.
Belangrijkste Componenten van het Onderzoek
Wetenschappelijk gebied
- Histologie
- Weefselverwerking
- Pathologie
Achtergrond
- Paraffineblokken met meerdere weefsels worden veelvuldig gebruikt in histologische studies.
- Nauwkeurige weefselidentificatie is essentieel voor onderzoek en diagnostiek.
- Traditionele methoden kunnen tekortschieten in visuele helderheid voor weefseldifferentiatie.
- SpOT biedt een kosteneffectieve oplossing voor het verbeteren van de weefselzichtbaarheid.
Doel van de studie
- Om een instrument te ontwikkelen voor een verbeterde weefselidentificatie in paraffineblokken.
- Om goedkope materialen te gebruiken voor de constructie van de oriëntatiemarkeringen.
- Om het inbeddingsproces te documenteren voor eenvoudige referentie.
Gebruikte methoden
- Het combineren van HistoGel met weefselmarkeeringskleurstof om een gekleurde gelplug te creëren.
- Het verwerken en inbedden van de gekleurde HistoGel-pluggen met behulp van standaardtechnieken.
- Het gebruik van een biopsietang om kleine cilinders uit de gel te extraheren.
- Het inbedden van de geëxtraheerde labels in een multi-weefselblok met zorgvuldige documentatie.
Belangrijkste resultaten
- De SpOT dient effectief als visuele markering in paraffineblokken.
- De constructie van de labels is eenvoudig en kosteneffectief.
- Documentatie zorgt voor een gemakkelijke referentie voor weefselmonsters.
- De methode verhoogt de nauwkeurigheid van de weefselidentificatie.
Conclusies
- De Specimen Orientation Tag is een waardevol hulpmiddel voor histologische studies.
- Het verbetert de identificatie van weefsels in complexe monsters.
- De methode is toegankelijk en reproduceerbaar voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Betrouwbare weefselidentificatie in paraffineblokken met meerdere weefsels is cruciaal voor histologicale analyse met een hoge doorvoer, ter ondersteuning van experimentele uniformiteit en data-integriteit in discovery- en translationeel onderzoek. De Specimen Orientation Tag (SpOT) maakt een nauwkeurige oriëntatie en identificatie van individuele weefsels mogelijk, waardoor ambiguïteit wordt verminderd en reproduceerbare, schaalbare workflows worden ondersteund. Deze functionaliteit is essentieel voor biopharma-teams die het nut van monsters willen maximaliseren en operationele risico's in weefselstudies willen minimaliseren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige mapping van weefselmonsters van meerdere individuen mogelijk voor comparatieve analyse.
- Ondersteunt functionele validatie door de correcte weefseltoewijzing in blokken met meerdere monsters te waarborgen.
- Vermindert het risico op misidentificatie, wat het vertrouwen in biologische bevindingen in een vroeg stadium versterkt.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de bereiding van gestandaardiseerde multi-weefselblokken voor downstream histologische assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid door een persistente, zichtbare oriëntatiemarkering in alle secties te bieden.
- Maakt een efficiënt gebruik van waardevolle weefselmonsters mogelijk door de arraycapaciteit te maximaliseren zonder de identificatie in gevaar te brengen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt de uitlijning van weefselmonsters uit verschillende behandelingsgroepen of ziektemodellen binnen één enkel blok.
- Handhaaft de traceerbaarheid en integriteit van biospecimens voor biomarker- of pathologiestudies.
- Vermindert handmatige fouten, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang in preklinische pijplijnen ondersteunt.
Pipeline- & Workflowintegratie
SpOT integreert in de histologische workflow vanaf het inkapselen van monsters tot het snijden en de analyse, ter ondersteuning van de fasen van ontdekking, screening en translationeel onderzoek.
- Discoverybiologie: Verbetert hypothesetesten door nauwkeurige weefseltoewijzing en oriëntatie te garanderen.
- Screening: Levert assay-klare blokken met betrouwbare identificatie voor high-throughput analyse.
- Analytica: Maakt kwantitatieve vergelijking tussen monsters mogelijk door de traceerbaarheid van specimens te handhaven.
- Translationeel onderzoek: Behoudt de monsteridentiteit voor biomarker-validatie en studies naar ziektemodellen.
- Enterprise hergebruik: Biedt een schaalbare, kostenefficiënte oplossing die aanpasbaar is aan zowel arrayed als non-arrayed blokformaten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in weefselstudies.
- Operationele waarde: Standardiseert oriëntatie en identificatie, wat de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid verbetert.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door dataintegriteit en traceerbaarheid van monsters te waarborgen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door monster-misidentificatie en daarmee samenhangende fouten in downstream-processen te minimaliseren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist basiskennis van histologie voor de preparatie en inbedding van SpOT-markers.
- Vereist standaard laboratoriumapparatuur zoals biopsietangen, inbedstations en documentatiehulpmiddelen.
- Vereist nauwkeurige documentatie en mapping van weefsel- en SpOT-locaties voor reproduceerbaarheid tussen teams.
- Aanpasbaar aan zowel array- als niet-array-blokformaten, ter ondersteuning van diverse modelsystemen.
- Handmatige dehydratie wordt aanbevolen om het uitlogen van kleurstof te minimaliseren, hoewel geautomatiseerde verwerking mogelijk is.
