Optimalisatie van synthetische eiwitten: Identificatie van interpositioneel afhankelijkheden Indicating structureel en / of functioneel verbonden Residuen
14 juli 2015
Synthetische eiwitsequenties gebaseerd op consensusmotieven negeren doorgaans co-evolerende residuen, die interpositionele afhankelijkheden (IPD's) impliceren. IPD's kunnen essentieel zijn voor activiteit, en ontwerpen die ze negeren, kunnen resulteren in suboptimale resultaten. Dit protocol gebruikt StickWRLD om IPD's te identificeren en helpt bij het informeren van rationeel eiwitdesign, wat resulteert in efficiëntere resultaten.
Het algemene doel van deze procedure is om co-evolverende residuen in eiwitalignementen te identificeren die interpositionele afhankelijkheden of IPD's impliceren. Dit wordt bereikt door eerst de alignering in stick world te laden, een visuele analytics tool die een interactieve 3D-representatie van een eiwitalignering creëert en co-varierende residuen in stick world duidelijk weergeeft. Elke positie in de alignering wordt weergegeven als een kolom bestaande uit een stapel bollen, één bol voor elk van de mogelijke 20 aminozuren op die positie binnen de alignering, die in grootte afhankelijk zijn van de frequentie. De kolommen die elke positie vertegenwoordigen, zijn om een cilinder gewikkeld om IPD's te vertegenwoordigen.
Er worden lijnen getrokken tussen residuen die hoger of lager co-evolueren dan verwacht zou worden als de residuen op de posities binnen het programma van elkaar afhankelijk zouden zijn. De restwaarde wordt afgestemd totdat er een beheersbaar aantal randen is en vervolgens worden de randen van belang geïdentificeerd. Uiteindelijk wordt stick world gebruikt om residuen te identificeren die met elkaar co-evolueren.
Dergelijke functioneel vereiste coving residuen zijn geïdentificeerd in een ventilatiekinase. Een van de redenen waarom mensen moeite hebben met dit proces is vanwege de nieuwheid. Het is bijna evenzeer een kunstvorm als een wetenschap.
Het is belangrijk om stick world visueel te demonstreren omdat het een visuele analytics tool is en gebruikersinteractie vereist. Gebruik een computer met een Intel I vijf of beter processor met ten minste vier gigabytes van Bram die Mac OS 10 of Linux OS draait en is uitgerust met de Python bibliotheken vermeld in het tekstprotocol. Download Stick World als een zip archief dat alle relevante Python scripts bevat.
Download ook het FASTA twee stick script voor het converteren van standaard fasta DNA eiwitsequentie alignementen naar het stick world formaat. Pak het archief uit en plaats de resulterende stick world map en het FASTA twee stick script op het bureaublad. Maak vervolgens een alignering van de eiwitsequenties met behulp van elke standaard alignering software.
Sla de alignering op het bureaublad op. Kies een formaat. Open de terminal applicatie op de macro Linux computer en navigeer naar het bureaublad door CD tot slash desktop te typen en terug te keren in de terminal.
Typ de opdracht om de FASTA twee stick script uitvoerbaar te maken en typ vervolgens de opdracht om de script uit te voeren. Volg de instructies op het scherm die door de script worden gegeven om de naam van het invoerbestand en de gewenste uitvoernaam op te geven. Sla het uitvoerbestand op het bureaublad op.
Navigeer naar de stick world uitvoerbare map met behulp van de terminal applicatie van de Mac of Linux computer. Start stick world door Python dash 32 stick world demo PI in de terminal te typen. Controleer of het stick world data loader paneel zichtbaar is op het scherm. Laad vervolgens de geconverteerde eiwitsequentie alignering door op de knop eiwit laden te drukken.
Selecteer het gecreëerde bestand en druk op open. Stick world zal verschillende nieuwe vensters openen, waaronder stick world control en stick world open gl. Selecteer het stick world open GL venster. Kies reset view vanuit het open GL menu om de standaard stick world visualisatie weer te geven in een top down view door de cilinder, die de data in de resizeable open GL vensters weergeeft.
Er bestaan verschillende weergave opties in stick world. Selecteer de vakken voor kolom labels en bal labels in het stick world control paneel om waarden voor kolommen en ballen weer te geven. Schakel het vak voor kolom randen uit in het stick world control paneel om de lijnen van de kolom randen te verbergen.
Stel de kolom dikte in op 0,1 in het stick world control paneel om een dunne lijn door de kolommen te tekenen. Om het gemakkelijker te maken om door de 3D view te navigeren, druk op return om de wijziging te accepteren. Reset de view in het stick world open GL venster.
Druk vervolgens op de volledig scherm knop om de view te maximaliseren om binnen het programma te navigeren. Roteer de 3D stick world weergave door de linker muisknop ingedrukt te houden terwijl u de muis in een willekeurige richting beweegt. Zoom de 3D stick world weergave door de rechter muisknop ingedrukt te houden terwijl u de muis omhoog of omlaag beweegt.
Blader door de view door te pannen en te zoomen. Co-evolverende residuen die de drempelvereisten van zowel p als restwaarde overschrijden, worden verbonden door rand lijnen. Als er te veel of te weinig randen zijn die residuen verbinden, wijzig de restwaarde drempel tot er minder of meer randen zichtbaar zijn. Verhoog de restwaarde drempel op de stick world control paneel tot er geen IPD rand lijnen meer zichtbaar zijn en verlaag deze langzaam tot relaties verschijnen. Blijf de restwaarde verhogen tot er een voldoende aantal relaties zijn om te onderzoeken.
Identificeer relaties die residuen van bekend belang of residuen die distaal zijn van elkaar binnen de alignering betreffen met behulp van command plus linker muisknop, selecteer eventuele randen van belang. Het stick world control paneel geeft de kolommen aan en verbindt specifieke residuen. Volle lijnen vertegenwoordigen positieve associaties.
Terwijl gestippelde lijnen negatieve associaties vertegenwoordigen. Druk op de output randen knop op het stick world control paneel om een platte tekst geformatteerd bestand van alle zichtbare randen in de juiste directory op te slaan, inclusief de verbindingsresiduen en hun actuele restwaarde. Een grote cluster interpositionele afhankelijkheden of IPD's, inclusief een associatie van drie knooppunten tussen een histidine op positie 1 32, tyrosine positie 1 35 en een proline op positie 1 41, is zichtbaar op de voorgrond.
Hier is de view scheef gemaakt om de gebruiker iets boven de cilinder te plaatsen, waardoor een IPD tussen een histamine op positie 1 36 en een methionine op positie twintig negen honderd zeven residuen verwijderd wordt onthuld. Omgekeerd detecteert het A-P-A-M-H-M-M motief van dezelfde domein deze niet als specifiek co-voorkomende motief variantie en definieert ook de algemene groeperingen in een biologisch ondersteunde schema. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om het op twee verschillende manieren te proberen.
Begin met een hoge restwaarde en werk je een weg naar beneden, of begin met een lage restwaarde en werk je een weg naar boven, en op
Overzicht
Dit protocol gebruikt StickWRLD om co-evolerende residuen in eiwit-aligneringen te identificeren, waarbij interpositionele afhankelijkheden (IPD's) worden gemarkeerd die cruciaal zijn voor eiwitactiviteit. Door IPD's op te nemen in eiwitdesign kunnen onderzoekers efficiëntere resultaten bereiken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwit Design
- Bioinformatica
- Structurele Biologie
Achtergrond
- Co-evolerende residuen geven interpositionele afhankelijkheden (IPD's) aan.
- Het negeren van IPD's kan leiden tot suboptimale eiwitdesigns.
- StickWRLD is een visueel analysetool voor eiwit-aligneringsanalyse.
- Het begrijpen van IPD's is essentieel voor rationeel eiwitdesign.
Doel van de studie
- Om co-evolerende residuen te identificeren die IPD's impliceren.
- Om de efficiëntie van eiwitdesignprocessen te verbeteren.
- Om de bruikbaarheid van StickWRLD in het visualiseren van eiwit-aligneringen te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Laad eiwit-aligneringen in StickWRLD.
- Visualiseer co-evolerende residuen met behulp van 3D-representaties.
- Pas residuele drempels aan om significante relaties te identificeren.
- Geef gegevens over geïdentificeerde IPD's uit voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van significante IPD's in eiwitsequenties.
- Visualisatie van co-evolerende residuen door interactieve 3D-modellen.
- Demonstratie van de belangrijkheid van IPD's in eiwitfunctionaliteit.
- Succesvolle toepassing van StickWRLD bij het analyseren van eiwit-aligneringen.
Conclusies
- Het opnemen van IPD's in eiwitdesign kan de activiteit verbeteren.
- StickWRLD dient als een effectief hulpmiddel voor het visualiseren van eiwitinteracties.
- Het begrijpen van co-evolutie is cruciaal voor rationeel eiwitengineering.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying interpositional dependencies (IPDs) in protein sequences enables more accurate synthetic protein design by revealing evolutionarily conserved residue relationships that influence folding, stability, and function. Ignoring these covariations risks generating non-viable consensus sequences that lack biological relevance. StickWRLD provides a visual analytics approach to detect such dependencies, supporting rational engineering of therapeutic proteins with improved predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Reveals functionally linked residues that may indicate critical structural or catalytic sites in target proteins.
- Operational Value: Enables hypothesis-driven interrogation of residue covariation to de-risk target mechanisms early in discovery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Identifies co-evolving residue pairs that can inform the design of stabilized protein variants for assay robustness.
- Operational Value: Supports development of standardized protein inputs with preserved functional interfaces for reproducible screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links sequence covariation to structural motifs that may correlate with functional domains relevant to disease mechanisms.
- Operational Value: Facilitates translation of IPD-informed designs into preclinical models by preserving native-like residue interactions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by informing target validation through mechanistic insight and enabling lead optimization via structure-guided design informed by evolutionary covariation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by highlighting residue networks that may underlie protein function or allosteric regulation.
- Screening: Enables preparation of protein variants with conserved interaction surfaces, improving target engagement consistency in assays.
- Analytics: Generates quantitative edge data (residual values) between co-evolving residues to rank and prioritize structural hypotheses.
- Translational Research: Connects evolutionary patterns to structural continuity, aiding in the design of proteins with preserved function across models.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable visual analytics platform for iterative protein design across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein design by accounting for evolutionarily constrained residue interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized visualization and threshold-adjusted detection of co-evolving pairs.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by improving the biological plausibility of synthetic proteins early in development.
- Portfolio Impact: Enables risk-informed prioritization of protein engineering candidates based on structural and functional residue dependencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein sequence alignment and evolutionary analysis.
- Needs a workstation with Python 3.2+, OpenGL support, and specified libraries to run StickWRLD.
- Demands standardized input alignments and consistent threshold settings for reproducible IPD detection across teams.
- Involves manual inspection of 3D visualizations to identify biologically relevant residue interactions.
- Limited by the quality and depth of the input multiple sequence alignment, which affects covariation signal strength.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Software Download & Installation and Preparation of Alignment
2:52
Launching and Using StickWRLD
4:37
Finding, Selecting, and Saving Interpositional Dependencies (IPDs)
5:52
Results: StickWRLD Visualization of the Adenylate Kinase Lid Domain Protein
6:41
Conclusion
