Optimalisatie van synthetische eiwitten: Identificatie van interpositioneel afhankelijkheden Indicating structureel en / of functioneel verbonden Residuen
14 juli 2015
Synthetische eiwitsequenties gebaseerd op consensusmotieven negeren doorgaans co-evolerende residuen, die interpositionele afhankelijkheden (IPD's) impliceren. IPD's kunnen essentieel zijn voor activiteit, en ontwerpen die ze negeren, kunnen resulteren in suboptimale resultaten. Dit protocol gebruikt StickWRLD om IPD's te identificeren en helpt bij het informeren van rationeel eiwitdesign, wat resulteert in efficiëntere resultaten.
Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van co-evoluerende residuen in eiwit-alignments die duiden op interpositionele afhankelijkheden of IPDs. Dit wordt bereikt door de alignment eerst te laden in stick world, een visual analytics-tool die een interactieve 3D-representatie van een eiwit-alignment creëert en co-variërende residuen in stick world duidelijk weergeeft. Elke positie in de alignment wordt weergegeven als een kolom bestaande uit een stapel sferen, waarbij elke sfeer een van de 20 mogelijke aminozuren op die positie binnen de alignment vertegenwoordigt; deze sferen zijn op een frequentie-afhankelijke wijze geschaald. De kolommen die elke positie representeren, zijn om een cilinder gewikkeld om de IPDs weer te geven.
Er worden lijnen getrokken tussen residuen die sterker of zwakker co-evolueren dan verwacht zou worden als de residuen op die posities binnen het programma afhankelijk waren. Het residu wordt afgestemd tot er een beheersbaar aantal randen is, waarna de relevante randen worden geïdentificeerd. Uiteindelijk wordt stick world gebruikt om residuen te identificeren die met elkaar co-evolueren.
Dergelijke functioneel vereiste coving-residuen zijn geïdentificeerd in een ventilate-kinase. Een van de redenen waarom mensen moeite hebben met dit proces is de nieuwheid ervan. Het is bijna net zoveel een kunstvorm als een wetenschap.
Het visueel demonstreren van Stick World is belangrijk omdat het een tool voor visuele analyse is en gebruikersinteractie vereist.Actie. Gebruik een computer met een Intel i5-processor of beter, met minimaal vier gigabytes RAM, waarop Mac OS 10 of Linux OS draait en die is uitgerust met de Python-bibliotheken die in het tekstprotocol worden vermeld. Download Stick World als een zip-archief dat alle relevante Python-scripts bevat.
Download daarnaast het FASTA two stick-script voor het converteren van standaard FASTA DNA-proteïne sequentie-alignments naar het stick world-formaat. Pak het archief uit en plaats de resulterende stick world-map en het FASTA two stick-script op het bureaublad. Maak vervolgens een alignment van de proteïne sequenties met behulp van een willekeurige standaard alignment-software.
Sla de alignment op het bureaublad op. Selecteer een formaat. Open de terminalapplicatie op de macro Linux-computer en navigeer naar het bureaublad door CD tilda slash desktop te typen en op enter te drukken in de terminal.
Typ het commando om het FASTA two stick-script uitvoerbaar te maken en typ vervolgens het commando om het script uit te voeren. Volg de instructies op het scherm van het script om de naam van het invoerbestand en de gewenste naam van het uitvoerbestand op te geven. Sla het uitvoerbestand op het bureaublad op.
Navigeer naar de map met uitvoerbare bestanden van Stick World via de terminalapplicatie van de Mac- of Linux-computer en start Stick World door Python -32 stick_world_demo.py in de terminal te typen. Controleer of het Stick World-gegevenslaadpaneel zichtbaar is op het scherm. Laad vervolgens de geconverteerde eiwitsequentie-alignering door op de knop 'load protein' te klikken.
Selecteer het gemaakte bestand en klik op openen; Stick World zal verschillende nieuwe vensters openen, waaronder Stick World Control en Stick World OpenGL. Selecteer het Stick World OpenGL-venster. Kies 'reset view' uit het OpenGL-menu om de standaard Stick World-visualisatie weer te geven in een bovenaanzicht door de cilinder, wat de data in de aanpasbare OpenGL-vensters representeert.
Er zijn verschillende weergave-opties beschikbaar in stick world. Selecteer de vakjes voor kolomlabels en ballabels in het controlepaneel van stick world om de waarden voor kolommen en ballen weer te geven. Deselecteer het vakje voor kolomranden in het controlepaneel van stick world om de lijnen van de kolomranden te verbergen.
Stel de kolomdikte in op 0.1 in het stick world-controlepaneel om een dunne lijn door de kolommen te trekken. Om de navigatie in het 3D-overzicht te vergemakkelijken, drukt u op enter om de wijziging te accepteren. Reset het overzicht in het stick world open GL-venster.
Klik vervolgens op de knop voor volledig scherm om het beeld te maximaliseren en door het programma te navigeren. Roteer de 3D-stickworld-weergave door de linkermuisknop ingedrukt te houden terwijl u de muis in een willekeurige richting beweegt. Zoom in of uit op de 3D-stickworld-weergave door de rechtermuisknop ingedrukt te houden terwijl u de muis omhoog of omlaag beweegt.
Blader door de weergave door te pannen en in te zoomen; co-evoluerende residuen die aan de drempelwaarden voor zowel p als residu voldoen, zijn via verbindingslijnen met elkaar verbonden. Als er te veel of te weinig verbindingen tussen residuen zichtbaar zijn, pas dan de drempelwaarde voor het residu aan om minder of meer verbindingen te tonen. Verhoog de drempelwaarde voor het residu via de bediening van de stick world totdat er geen IPD-verbindingslijnen meer worden weergegeven, en verlaag deze vervolgens langzaam totdat er relaties verschijnen. Blijf de drempelwaarde voor het residu aanpassen totdat er een voldoende aantal relaties aanwezig is om te bestuderen.
Identificeer relaties die betrekking hebben op residuen van bekend belang of residuen die in de alignment ver van elkaar afliggen door de opdrachttoets en linkermuisknop te gebruiken; selecteer vervolgens alle relevante verbindingen. Het bedieningspaneel voor de stick world geeft de kolommen aan en verbindt specifieke residuen. Doorgetrokken lijnen vertegenwoordigen positieve associaties.
Terwijl gestreepte lijnen negatieve associaties vertegenwoordigen. Druk op de knop 'output edges' in het controlepaneel van de stick world om een plat tekstbestand van alle zichtbare randen in de juiste map op te slaan, inclusief de gewrichtsresiduen en hun werkelijke residuele waarden. Een groot cluster van interpositionele afhankelijkheden of IPD's, waaronder een associatie tussen drie knopen bestaande uit glycine op positie 1 32, tyrosine op positie 1 35 en een proline op positie 1 41, is op de voorgrond zichtbaar.
Hier is het perspectief gekanteld om de gebruiker iets boven de cilinder te positioneren, waardoor een IPD zichtbaar wordt tussen een histamine op positie 1 36 en een methionine op positie negenentwintig, gescheiden door een afstand van eenhonderdzeven residuen. Omgekeerd detecteert een uit A-P-A-M-H-M-M afgeleid motief van hetzelfde domein deze niet als specifiek gelijktijdig voorkomende motiefvariantie en definieert het de algemene groeperingen volgens een biologisch niet-ondersteund schema. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dit op twee verschillende manieren te proberen.
Begin met een hoog residu en werk naar beneden, of begin met een laag residu en werk naar boven; op die manier kunt u de ruimte op twee verschillende manieren verkennen.
Overzicht
Dit protocol maakt gebruik van StickWRLD om co-evolverende residuen in eiwit-alignments te identificeren, waarbij de nadruk ligt op interpositionele afhankelijkheden (IPD's) die cruciaal zijn voor de eiwitactiviteit. Door IPD's te integreren in eiwitontwerp, kunnen onderzoekers efficiëntere resultaten bereiken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Eiwitontwerp
- Bioinformatica
- Structurele biologie
Achtergrond
- Co-evoluerende residuen duiden op interpositionele afhankelijkheden (IPDs).
- Het negeren van IPDs kan leiden tot suboptimale eiwitontwerpen.
- StickWRLD is een visuele analysetool voor de analyse van eiwituitlijningen.
- Het begrijpen van IPDs is essentieel voor rationeel eiwitontwerp.
Doel van de studie
- Om co-evoluerende residuen te identificeren die wijzen op IPD's.
- Om de efficiëntie van eiwitontwerpprocessen te verhogen.
- Om het nut van StickWRLD bij het visualiseren van eiwit-alignments aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Laad proteïne-alignments in StickWRLD.
- Visualiseer co-evoluerende residuen met behulp van 3D-representaties.
- Pas residudrempels aan om significante relaties te identificeren.
- Exporteer gegevens over de geïdentificeerde IPD's voor verdere analyse.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van significante IPD's in eiwitsequenties.
- Visualisatie van co-evoluerende residuen via interactieve 3D-modellen.
- Demonstratie van het belang van IPD's voor de eiwitfunctionaliteit.
- Succesvolle toepassing van StickWRLD bij het analyseren van eiwitalignments.
Conclusies
- Het integreren van IPD's in eiwitontwerp kan de activiteit verhogen.
- StickWRLD dient als een effectief instrument voor het visualiseren van eiwitinteracties.
- Inzicht in co-evolutie is cruciaal voor rationele eiwitengineering.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het identificeren van interpositionele afhankelijkheden (IPD's) in eiwitsequenties maakt nauwkeuriger synthetisch eiwitontwerp mogelijk door evolutionair geconserveerde residu-relaties te onthullen die de vouwing, stabiliteit en functie beïnvloeden. Het negeren van deze covariaties brengt het risico met zich mee dat er niet-levensvatbare consensussequenties worden gegenereerd die biologische relevantie missen. StickWRLD biedt een visuele analytische benadering om dergelijke afhankelijkheden te detecteren, wat de rationele engineering van therapeutische eiwitten met een verbeterd voorspellend vertrouwen ondersteunt.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onthult functioneel gekoppelde residuen die kunnen wijzen op kritieke structurele of katalytische sites in doeleiwitten.
- Operationele waarde: Maakt hypothese-gestuurd onderzoek naar residue-covariatie mogelijk om risico's met betrekking tot doelmechanismen in een vroeg stadium van de ontdekking te beperken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Identificeert co-evoluerende residu-paren die kunnen bijdragen aan het ontwerp van gestabiliseerde eiwitvarianten voor een robuustere assay.
- Operationele waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van gestandaardiseerde eiwit-inputs met behoud van functionele interfaces voor reproduceerbare screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt sequentie-covariatie aan structurele motieven die kunnen correleren met functionele domeinen die relevant zijn voor ziekte-mechanismen.
- Operationele waarde: Faciliteert de vertaling van IPD-geïnformeerde ontwerpen naar preklinische modellen door native-achtige residu-interacties te behouden.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode is geïntegreerd in de ontdekkingsworkflow door targetvalidatie te informeren via mechanistisch inzicht en door lead-optimalisatie mogelijk te maken via structuurgestuurd ontwerp op basis van evolutionaire covariatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistisch minimaliseren van risico's door residue-netwerken te belichten die ten grondslag kunnen liggen aan de eiwitfunctie of allosterische regulatie.
- Screening: Maakt de preparatie van eiwitvarianten met geconserveerde interactie-oppervlakken mogelijk, waardoor de consistentie van target engagement in assays wordt verbeterd.
- Analytics: Genereert kwantitatieve edge-data (residuele waarden) tussen co-evoluerende residuen om structurele hypothesen te rangschikken en prioriteren.
- Translational Research: Verbindt evolutionaire patronen met structurele continuïteit, wat helpt bij het ontwerp van eiwitten met een behouden functie over verschillende modellen heen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar visueel analyseplatform voor iteratief eiwitontwerp over meerdere targets en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in eiwitontwerp door rekening te houden met evolutionair beperkte residu-interacties.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde visualisatie en drempelwaarde-gecorrigeerde detectie van co-evoluerende paren.
- Strategische waarde: Vermindert het risico op falen in een laat stadium door de biologische plausibiliteit van synthetische eiwitten vroeg in de ontwikkeling te verbeteren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-geïnformeerde prioritering van eiwitengineering-kandidaten mogelijk op basis van structurele en functionele residu-afhankelijkheden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitsequentie-alignment en evolutionaire analyse.
- Necessiteert een workstation met Python 3.2+, OpenGL-ondersteuning en specifieke bibliotheken om StickWRLD uit te voeren.
- Vereist gestandaardiseerde input-alignments en consistente drempelinstellingen voor reproduceerbare IPD-detectie tussen teams.
- Omvat handmatige inspectie van 3D-visualisaties om biologisch relevante residu-interacties te identificeren.
- Beperkt door de kwaliteit en diepte van de input multiple sequence alignment, wat de sterkte van het covariatie-signaal beïnvloedt.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Software Download & Installation and Preparation of Alignment
2:52
Launching and Using StickWRLD
4:37
Finding, Selecting, and Saving Interpositional Dependencies (IPDs)
5:52
Results: StickWRLD Visualization of the Adenylate Kinase Lid Domain Protein
6:41
Conclusion
