Invoer van In Vitro Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Het algemene doel van deze procedure is om de snelle preklinische ontdekking van klinisch relevante varianten van één nucleotide te faciliteren die functioneel kunnen leiden tot resistentie tegen verschillende klassen van therapieën. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oncologie, zoals welke genmutaties kunnen bijdragen aan functionele resistentie tegen therapieën in de praktijk die uiteindelijk kunnen leiden tot verbetering van therapieën en alternatieve klinische behandelingsstrategieën voor geneesmiddelresistente patiënten. Het grote voordeel van deze techniek is dat aangezien we de opkomst van spontane mutaties faciliteren en een onbevooroordeelde screeningstechnologie toepassen op resistente klonen, er een grotere kans is dat deze varianten de terugval van gerichte therapieën in de kliniek aansturen.

Het demonstreren van de procedure zal door een zeer getalenteerde onderzoeker uit mijn laboratorium worden gedaan. Om de GI 50 voor cellijnen te beoordelen. Bereid een assayplaat voor door cellen in niet-transparante heldere onderkant 96-well platen in 100 microliters celmedium te zaaien volgens de hier getoonde kaart.

Bereid op een vergelijkbare manier een controleplaat voor, voeg cellen toe aan de blauwe putjes en alleen medium aan de witte putjes. Na het incuberen van de platen gedurende een nacht bij 37 graden Celsius, brengt u het luminescente celviabiliteitsreagens in evenwicht met kamertemperatuur en mengt u voorzichtig door te kantelen. Om een homogene oplossing te verkrijgen, voegt u 80 microliter reagens toe aan de putjes van de controleplaat en schudt u de inhoud gedurende 30 minuten.

Om cellyse te induceren. Gebruik een luminometer met een belichting van 0,1 tot 1,0 seconden en een detectiegolflengte van 560 nanometer om de luminescentie op te nemen. Vervolgens, om de testverbindingen aan de assayplaten toe te voegen, maakt u een reeks van één op vier verdunning van verbindingen in DMSO, beginnend met een 2000 micromolar concentratie voor een totaal van 10 verdunning.

Voeg vervolgens de seriaal verdunde verbindingen toe aan medium om een ​​verbindingsmediummix te maken met een 10x eindconcentratie. Bewaar de verbindingsplaat bij min 20 graden Celsius voor gebruik op dag drie van de assay. Voeg vervolgens 10 microliter van de verdunde verbindingen toe aan cellen in triplicaat zodat de hoogste dosis 10 micromolar is.

Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius. Op dag drie, bereidt u een 400 microliter een X verbindingsmediummix voor met behulp van de verbindingsplaten die drie dagen eerder zijn bereid. Draai de assayplaten om en verwijder het medium en droog het af op autoclaafpapierhanddoeken twee tot drie keer.

Voeg een x verbinding toe aan de blauw geschaduwde put en voeg 100 microliter medium toe aan de omtrekputjes om verdamping te voorkomen. Op dag zes, beoordeelt u het relatieve aantal levensvatbare cellen door luminescentiemetingen te nemen zoals eerder in de video is gedemonstreerd. Bereken vervolgens de GI 50 waarden met behulp van software zoals PRISM met behulp van de berekende GI 50 waarden. Zet cellen op voor geneesmiddelresistentie-assays.

Indien u met een cytostatisch middel werkt, zaait u cellen bij 30 tot 40% confluëntie in 150 millimeter vierkante kweekschotels. Als u met een toxisch middel werkt, ziet u de cellen bij 70 tot 80% confluëntie. Na het bepalen van de initiële verbindingsconcentraties volgens het tekstprotocol, behandel de cellen met de testverbindingen voor hoogtoxische verbindingen, die celdood veroorzaken in een zesdaagse viabiliteitsassay.

Begin met de GI 50 en verhoog de concentratie elke twee tot drie weken incrementeel totdat robuuste resistentie wordt waargenomen. Om enkele celklonen te isoleren, gebruik fasecontrastmicroscopie bij 40x vergroting om de kweekschaal te onderzoeken en levensvatbare clusters van cellen op de bodem van de schaal te identificeren. Gebruik een pen om klonen te markeren die van gemiddelde grootte zijn en goed geïsoleerd zijn van andere kolonies om klonen te plukken met behulp van een P 200 pipetteerder.

Verwijder het groeimedium uit de schaal en gebruik één XPBS om alle zwevende cellen weg te spoelen. Til met de pipettentip klonen op en breng ze over in de putjes van een 48-wellplaat met 50 microliter 0,25% Trypsin. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee minuten. Voeg vervolgens 200 microliter vers medium toe met de helft van de concentratie van verbinding om een ​​optimale herstel van cellen mogelijk te maken.

Om de klonen te isoleren met behulp van drie millimeter klonering discs, plaats de discs in een 10 centimeter weefselkweekschaal met vijf milliliter 0,25% tripsin EDTA gedurende twee minuten. Vervolgens aspireert u het medium uit de schaal met de resistente klonen en legt u de klonen over met de trips en geweekte klonering discs. Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee minuten, afhankelijk van hoe gemakkelijk de klonen van de platen kunnen worden opgetild.

Vervolgens gebruikt u steriele pincetten om de klonering discs op te pakken en over te brengen in 48-well platen met 200 microliter vers medium, en laat u de concentratie van verbinding voorzichtig pipetteren om de cellen van de klonering discs los te maken en incubeer bij 37 graden overnacht. Verwijder de volgende dag de klonering discs, incubeer de cellen en beoordeel vervolgens voor geneesmiddelresistentie. Volgens het tekstprotocol, zoals hier getoond, HCT een 16 cellen behandeld gedurende een lange periode met cytotoxisch. Verbinding nummer één leidde tot de spontane opkomst van resistente klonen die tijdens de behandeling bleven groeien.

De klonen werden gepikt met behulp van een pipetterman. In deze figuur toonden resistente klonen één tot drie allemaal significante resistentie tegen verbinding nummer één en zijn nauwe analoog verbinding nummer twee, terwijl alle klonen gevoeligheid vertoonden voor een niet-gerelateerd cytotoxisch middel. Velcade. Na bevestiging van fenotypische resistentie werd GDNA geïsoleerd en ingediend voor volledige exoomsequentieanalyse.</