Oprichting van een klinisch relevante

Het algemene doel van deze procedure is om een klinisch relevant model te creëren waarin wondherstel in de eigen micro-omgeving kan worden gevolgd. Dit wordt bereikt door eerst de lens uit het oog van een kippenembryo te verwijderen. De tweede stap is het maken van een kleine incisie aan de voorzijde van de lens.

Elueer vervolgens de lensvezelcelmassa hydrodynamisch. Daarna wordt het lenskapsel met het bijbehorende epitheel afgevlakt door extra incisies in het voorste kapsel te maken. De laatste stap is het vastzetten van de gewonde cultuur aan de weefselkweekschaal om het wondgenezingsproces te kunnen volgen terwijl dit plaatsvindt.

Uiteindelijk worden time-lapse microscopie, confocale microscopie en biochemische analyse gebruikt om mechanismen van wondherstel aan te tonen in een model dat de in vivo omgeving nauwkeurig nabootst. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van wondgenezing, zoals de manier waarop cellen gecoördineerd samen bewegen om de wond te sluiten. Bovendien kan deze methode inzicht bieden in het proces van wondherstel.

Het kan ook worden toegepast op studies naar wondgenezing bij ABER, in het bijzonder fibrose en littekenvorming. Begin met het plaatsen van drie Petri-schalen van 100 millimeter in een steriele laminaire flow-kast. Vul twee van de Petri-schalen tot de helft met tris-dextrosebuffer op kamertemperatuur en laat de derde leeg.

Verwijder vervolgens een vruchtbaar wit leghorn-kippenei van embryonale dag 15 uit de incubator van 37,7 °C en reinig de buitenkant van de schaal met 70% ethanol om deze te steriliseren. Breek daarna voorzichtig het ei en plaats de inhoud in de lege Petri-schaal van 100 mm. Decapiteer het embryo met een standaard pincet en een fijne schaar en plaats de kop in een van de schalen met TST-dextrosebuffer.

Verplaats de kop van het kiजembryo binnen 15 minuten naar een Petrischaaldeksel. Gebruik precisie-pincetten om de achterzijde van het oog samen te knijpen, waardoor er een kleine opening aan de achterzijde van het oog ontstaat. Pak vervolgens het glasachtig lichaam vast met de pincet en trek voorzichtig aan het glasachtig lichaam met een rollende beweging.

Het glazuig lichaam met de aangehechte lens zal losraken uit het oog. Plaats de lens en het glazuig lichaam in de overgebleven petrischaal met Tex extras Buffer. Laat de lenzen niet langer dan 30 minuten in de buffer blijven voordat u verdergaat met de dissectie.

Verplaats de lens vervolgens met precisiepincetten onder een dissectiemicroscoop naar een nieuw Petrischaaldéksel en borstel voorzichtig alle ciliaire lichaamsstelselcellen die samen met de lens zijn losgekomen weg met de punt van de pincet. Scheid daarna de lens van het glasvocht door het glasachtig lichaam los te knijpen van de verbinding met het posterieure lenskapsel. Zodra de lens is gescheiden, wordt deze overgebracht naar een druppel van 200 µL tris-dextrosebuffer in een weefkweekschaal van 35 mm, waarbij de lens zo wordt georiënteerd dat het anterieure aspect naar boven is gericht.

De voorzijde van de lens is gemakkelijk te identificeren aan de aanwezigheid van een dichte ring in het weefsel die de grens tussen het binnenste en het equatoriale gebied van het lensepitheel markeert. Maak met twee precisiepincetten een kleine incisie van ongeveer 850 microns lengte in het centrum van het voorste lenskapsel door het weefsel met één pincet in elke hand vast te pakken en voorzichtig in tegenovergestelde richtingen te trekken. Neem vervolgens een spuit van één milliliter met een naaldpunt van 27,5 gauge en vul deze met 300 microliters TST dextrose-buffer.

Steek de naaldpunt in de incisie die in het voorste lenskapsel is gemaakt en ongeveer halverwege in de lens. Druk vervolgens voorzichtig op de spuit om de TST-dextrosebuffer in de lens te injecteren. Vezelcelmassa.

Injecteer tussen de 50 en 200 µL buffer om de vezelcelmassa los te maken van het omringende epitheel en de lenskapsel. Injecteer nooit meer dan 300 µL. Verwijder de losgekomen vezelcelmassa via de anterieure incisieplaats uit de lens met behulp van precisiepincetten.

Het verwijderen van de vezelcelmassa van de aanhechting op het achterste kapsel creëert een zeer reproduceerbaar wondoppervlak op het basaalmembraan, omringd door het gewonde epitheel. Begin bij de kapselzak en maak vijf incisies in het voorste aspect van de lens tot aan de equator. Leg de resulterende vijf flappen van het lenskapsel met het aanhechtende epitheel plat op de kweekschaal, met de kapselzijde naar beneden en de celzijde naar boven.

Druk met de pincet zachtjes op elk punt van de ster om het kapsel aan de schaal te bevestigen. Dit veroorzaakt een kleine inkeping bij de vijf buitenste punten van het x explan, wat resulteert in een blijvende hechting aan de schaal. Verwijder vervolgens de tris-dextrosebuffer uit de 35 millimeter schaal en vervang deze door 1,5 milliliter voorverwarmde M1 99.

Medium aangevuld met 1% L-glutamine en penicilline. Streptomycine bedekte de schaal met de deksel en plaats deze in de incubator. Plaats de kweekschaal onder de dissectiemicroscoop en observeer de grens tussen de centrale migratiezone en de oorspronkelijke aanhechtingszone van de epitheelcellen.

Gebruik vervolgens twee precisiepincetten om de randen aan beide zijden van de demarcatielijn tussen de twee zones vast te pakken. Trek de oorspronkelijke aanhechtingszone voorzichtig langs de lijn om de twee zones eenvoudig te scheiden. Ga door met het scheiden van de twee zones rondom de gehele cultuur totdat de twee regio's volledig van elkaar gescheiden zijn.

Bestudeer de twee fracties met behulp van standaard moleculaire of biochemische analysetechnieken. Onmiddellijk na verwijdering van de vezelcelmassa worden een subpopulatie ment-verrijkte mesenchymale herstelcellen geactiveerd, die migreren naar de wondrand van het epitheel. Deze cellen bewegen zich snel naar het celvrije gebied van de endogene basaalmembraancapsule, de centrale migratiezone, om het genezingsproces te starten.

De wond; de hier beschreven techniek bereidt dit modelsysteem perfect voor om dit proces met een microscoop of videocamera te observeren. De wondgenezing verloopt snel en bedekt tegen de eerste dag in cultuur al een aanzienlijk deel van de wond. Tegen de derde dag is het wondgenezingsproces doorgaans voltooid, na de scheiding van de centrale migratiezone en de oorspronkelijke aanhechtingszones. Moleculaire verschillen tussen deze verschillende zones werden hier geanalyseerd.

De spiegels van focale adhesiekinase werden in de twee zones gemeten en de hoeveelheid gefosforyleerd focale adhesiekinase bleek verhoogd in de migratiespecifieke centrale migratiezone. Eenmaal beheerst, kan deze techniek voor gesimuleerde cataractoperaties in drie minuten worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een model voor een gesimuleerde cataractoperatie creëert die wondherstel in een natuurlijke micro-omgeving nauwgezet nabootst.