Name: Oprichting van een klinisch relevante Ex Vivo Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer een klinisch relevant ex vivo model voor cataractchirurgie met kippenembryo's. Deze methode maakt real-time observatie van epitheliale wondherstel in het oog mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een toelage van de National Institutes of Health aan A.S.M. (EY021784).

Het volgende protocol voldoet aan de Thomas Jefferson University Institutional Animal Care en gebruik Comite richtlijnen en met de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Vision Research. 1. Setup en voorbereiding van Lenzen voor Ex Vivo Wound Cultuur <ol><li> Plaats drie 100 mm petrischalen in een steriele laminaire stroming kap. Vul twee petrischalen helft met Tris / Dextrose buffer (TD buffer; 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 0,7 mM Na 2PO 4, 5 mM D-glucose, 8,25 mM Tris Base, pH tot 7,4 met HCl) bij kamertemperatuur , waardoor de derde leeg. Pre-warm cultuur media (Media 199 aangevuld met 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine) tot 37 o C. Opmerking: De standaard wondgenezing kweekmedia serumvrij, zoals gebeurt in vivo; kan echter de wond herstel kweken met succes gekweekt in gedefinieerd medium omstandigheden die serum of andere factoren. </li><li> Verwijder vruchtbare embryonale day 15 witte leghorn kuiken ei van incubator (gehouden op 37,7 ° C met zachte wiegen) </li><li> Plaats geselecteerde ei in de laminaire stroming kap en schoon buiten shell met 70% ethanol uit een wassen fles. Voer alle procedures hierna onder aseptische omstandigheden in de laminaire stroming kap, met behulp van steriele oplossingen en instrumenten. </li><li> Crack ei en plaats de inhoud in de lege 100 mm petrischaal. Onthoofden embryo met behulp van standaard pincet en fijne schaar. Plaats de kippenembryo hoofd in een petrischaaltje met TD buffer en op de juiste gooi de rest van het embryo. Eventueel houdt het kippenembryo heads in TD buffer gedurende korte tijd niet langer dan 15 min. </li><li> Plaats de kippenembryo hoofd op een petrischaal deksel. Met behulp van hoge precisie tang, verwijder de lens samen met de bijgevoegde glasvocht van het oog in de volgende volgorde. Druk de achterkant van het oog met de tang om een ​​kleine opening in de achterkant van het oog te maken. </li><li> Vervolgens pakt u de glasvocht wet pincet en voorzichtig ruk aan het glasvocht met een rollende beweging, zal het glasvocht met de lens bevestigd worden verdreven uit het oog. Plaats lens / glasvocht in de resterende petrischaaltje met TD buffer. Laat de lenzen TD buffer blijft gedurende maximaal 30 min. </li><li> Verplaats de lens om een ​​nieuwe petrischaal deksel onder een dissectie microscoop. Vanaf dit punt voeren alle stappen onder een dissectie microscoop. Met hoge precisie pincet voorzichtig afborstelen elke corpus ciliare (gepigmenteerde cellen) die werden losgemaakt van de lens met de rand van de tang, waarbij de lens voorzichtig weefsel niet te beschadigen. Opmerking: Het verwijderen van het corpus ciliare verzekert dat celtypes die niet endogeen zijn voor de lens niet onder het wondherstel cultuur. </li><li> Scheid de lens van het glasvocht met hoge precisie tang door knijpen van de glasachtig lichaam van de associatie met het achterste lenskapsel. </li><li> Met behulp van hoge precisie tang overdracht van de lens in een kleine dalingTD buffer (ongeveer 200 ui) in een 35 mm weefselkweekplaat. </li></ol> 2. Het uitvoeren van Mock Cataract Surgery <ol><li> Richt de lens in het onmiddellijk TD buffer in de 35 mm schaal met de anteriore gedeelte van de lens naar boven. Opmerking: De voorste van de lens wordt gemakkelijk geïdentificeerd door de aanwezigheid van een dichte ring in het weefsel dat de grens tussen het voorste en het equatoriale gebied van het lensepitheel merkt. Daarentegen is er een afwezigheid van markeringen op de achterkant van het lenskapsel waaraan de lensvezel cellen gevoegd. </li><li> Met behulp van twee hoge precisie tang een kleine incisie (ongeveer 850μm) in het midden van het voorste lenskapsel, de dikke basaalmembraan dat de lens weefsel omgeeft, en de bijbehorende voorste lens epithelium, door vastgrijpen van het weefsel met een pincet in elke hand en zachtjes trekken in tegengestelde richtingen. </li><li> Verwijder de vezel celmassa, die het grootste deel van de lens weefsel dislod maaktGing het van de bijbehorende bijlagen aan de lens epitheel en omliggende lenskapsel door hydro-elutie (een aanpak gebruikt in de klassieke cataractoperatie, gemodelleerd in figuur 1A). </li><li> Vul een 1 ml spuit met een 27,5 G naald met 300 ul van TD buffer. Steek de naald in de incisie in de voorste lenskapsel, en ongeveer halverwege in de lens. </li><li> Druk voorzichtig de spuit injecteren van de TD buffer in de lens vezels cel massa. Injecteer tussen 50 en 200 pl TD, en nooit meer dan 300 pl. Let op de fiber cel massa zich los te maken van het epitheel en de lens capsule. </li><li> Met behulp van hoge precisie tang, verwijder de losgemaakte vezels cel massa van de lens via de anterieure incisie. Opmerking: Deze procedure laat de achterste lens basale membraan capsule waarop de vezel cellen werd bevestigd ontdaan van cellen en een gewonde lensepitheel net naast deze plaats. </li></ol> 3. preparing gewonden Lens voor Ex Vivo Cultuur <ol><li> Vlak de lens kapselzak die resulteert uit de cataractoperatie hierboven beschreven op de kweekschaal, cel naar boven door vijf delen in het anteriore gedeelte van de kapselzak. </li><li> Knip loodrecht op de oorspronkelijke incisie tot de equator van de lens. Vlak de resulterende vijf &quot;flaps&quot; van de lens capsule met aangehechte epitheel op de cultuur schotel capsule naar beneden, cel kant naar boven. Let nu de ex vivo gewonden lens moet op een ster of flowerlikevorm (zie figuur 1B) te nemen. </li><li> Om de capsule vast aan de schotel, drukt zachtjes met de tang op elk punt van de ster. Dit zal een kleine deuk bij de vijf meest buitenste punten van het explantaat te maken en leiden tot blijvende bevestiging aan de schotel. Opmerking: Het is mogelijk om de capsule beschadigd tijdens deze procedure en dus is het belangrijk om de capsule vast aan de schotel zo dicht mogelijk bij de uiteinden van de flaps mogelijk, alsmede de minste hoeveelheid bevestigingspunten maken mogelijk (gewoonlijk twee, maximaal drie per flap). </li><li> Verwijder de TD buffer van de 35mm schotel en het vervangen met 1,5 ml van voorverwarmde media. Bedek de 35mm schaal met deksel en plaats in de incubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 4. Scheiding van de Centrale Zone Migratie (CMZ), waarbij Re-epithelisatie van de Gewonde gebied van de Posterior Capsule zich voordoet, van de oorspronkelijke bijlage Zone (OAZ) van Lens epitheelcellen, voor de kwantitatieve analyse. Opmerking: De cellen beginnen onmiddellijk verplaatsen naar het gebied CMZ als reactie op letsel. Door de eerste dag in de cultuur genoeg cellen migreren over de CMZ voor moleculaire en biochemische analyses, na scheiding van de CMZ en de OAZ door micro-dissectie 23. Dit protocol omvat het verwijderen van een flap (OAZ) tegelijk uit het gewonde gebied van de capsule. <ol><li> Observeer een Demarcatie, duidelijk zichtbaar onder de microscoop ontleden, tussen de OAZ en CMZ (zie figuur 2A). Met behulp van twee hoge precisie tang te grijpen met beide forceps aan de rand van de OAZ / CMZ lijn, een net naast de andere aan weerszijden van de lijn (zie afbeelding 2A, B, pijl). </li><li> Met behulp van een hand / een tang aan de CMZ kant blijven vasthouden aan de gewonden cultuur, terwijl met de andere hand / tang, trek de OAZ langs de OAZ / CMZ lijn. De CMZ gemakkelijk scheidt van de OAZ langs deze lijn. Volg deze lijn rond de hele cultuur totdat de twee regio&#39;s volledig zijn gescheiden. </li><li> Bestudeer de gescheiden OAZ en CMZ fracties voor moleculaire analyse zoals RNA-Seq 24 of biochemische analyses, zoals western blot of co-immunoprecipitatie 23,25. </li></ol>

<ol><li>Walker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+precursors+for+the+mesenchymal+cells+involved+in+injury+response+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+laboratory+automation%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).</li>
<li>Khalil, A. A., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+leader+cells+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Determinants of leader cells in collective cell migration.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).</li>
<li>Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+basement+membrane+after+corneal+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Disruption of the basement membrane after corneal debridement.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+of+the+epithelium+in+experimental+corneal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds.</a> Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).</li>
<li>Sherrard, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium+in+vivo%3A+its+response+to+mild+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma.</a> Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).</li>
<li>Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+the+fibrotic+repair+phenotype+in+cornea%3A+implications+for+surgical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).</li>
<li>Escamez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).</li>
<li>Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+growth+factor+expression+is+reduced+and+delayed+during+wound+healing+in+the+genetically+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse.</a> The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).</li>
<li>Tarin, D., Croft, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin.+II.+Dermo-epidermal+interrelationships%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships.</a> Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).</li>
<li>Croft, C. B., Tarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin+I.+Epithelial+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour.</a> Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).</li>
<li>Winstanley, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+reaction+in+the+healing+of+excised+cutaneous+wounds+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+comparative+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog.</a> Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).</li>
<li>Wormstone, I. M., Wride, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+lens%3A+a+classic+model+for+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).</li>
<li>Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsular+opacification%3A+a+problem+reduced+but+not+yet+eradicated%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated.</a> Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).</li>
<li>Walker, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+attempts+to+reduce+posterior+capsule+opacification+after+cataract+surgery--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review.</a> Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).</li>
<li>Schmidbauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22International+ophthalmology+clinics%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification.</a> International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).</li>
<li>Menko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+vimentin+in+regulating+repair+function+during+healing+of+the+lens+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium.</a> Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).</li>
<li>Chauss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-specific+mitochondrial+dynamic+regulatory+networks+are+revealed+by+global+transcriptional+analysis+of+the+developing+chicken+lens%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens.</a> G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).</li>
<li>Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+N-Cadherin+linked+c-Src+and+fyn+kinases+in+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).</li>
<li>Sieg, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+integrates+growth-factor+and+integrin+signals+to+promote+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration.</a> Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).</li>
<li>Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Required+role+of+focal+adhesion+kinase+%28FAK%29+for+integrin-stimulated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).</li>
<li>Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion+kinase--a+regulator+of+cell+migration+and+invasion%29%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+life%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion).</a> IUBMB life. 53, 115-119 (2002).</li>
<li>Zhao, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+and+its+signaling+pathways+in+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis.</a> Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).</li>
<li>Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional-specific+alterations+in+cell-cell+junctions%2C+cytoskeletal+networks+and+myosin-mediated+mechanical+cues+coordinate+collectivity+of+movement+of+epithelial+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury.</a> Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Ferguson, M. W., O'Kane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scar-free+healing%3A+from+embryonic+mechanisms+to+adult+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).</li>
<li>Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+inflammation%3A+embryos+reveal+the+way+to+perfect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).</li>
<li>Nodder, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+embryology%22%5BJournal%5D)">Wound healing in embryos: a review.</a> Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Hier wordt een techniek beschreven voor het bereiden van een kweekmodel voor wondherstel dat het uitvoeren van een ex vivo cataractoperatie op kippenembryo-lenzen na hun verwijdering uit het oog omvat. Het lensepitheel reageert op deze klinisch relevante wond met een herstelproces dat nauw aansluit bij dat welke in vivo plaatsvindt en kenmerken deelt met wondherstel in andere epitheelweefsels2,4. Hoewel het protocol eenvoudig en gemakkelijk te volgen is, vereist het uitvoeren van een oefening...

De klinisch significante, mock staaroperatie, ex vivo epitheliale wondgenezing model beschreven is ontwikkeld om een instrument voor het onderzoeken van de mechanismen die de reparatie van epitheelweefsels regelen in respons op een verwonding verschaffen. Belangrijkste voordelen die werden nagestreefd bij het ​​creëren van deze model inbegrepen 1) het verschaffen van omstandigheden die nauw gerepliceerd in vivo respons op verwonding in een kweek, 2) gemak van het moduleren van de regulerende elementen van de reparatie, en 3) het vermogen om het beeld reparatieproces in zijn geheel, in real time. De uitdaging was daarom een ​​cultuurmodel waarin mogelijke was studeren creëren en manipuleren epitheliale wondheling in natieve micro de cellen. De beschikbaarheid van deze wond-repair model opent nieuwe mogelijkheden voor de identificatie van de endogene signalen signalen van matrixeiwitten, cytokines en chemokines dat het reparatieproces te regelen. Bovendien is het model geschikt voor het onderzoeken hoe eenn epitheel kan bewegen als collectief vel opnieuw epithelium aan het wondgebied 2,3, en voor het bepalen van het geslacht van mesenchymale cellen leider aan de wondrand die functioneren richten van de collectieve migratie van epitheel 4 gewonden. Dit model verschaft een platform waarmee therapeutische doeltreffende wondgenezing kan bevorderen en de afwijkende wondheling 5 identificeren. Er zijn al een aantal beschikbare wond-reparatie modellen, zowel in de cultuur en in vivo, waarin het grootste deel van wat bekend is over de wond reparatieproces vandaag hebben geleverd. In dierlijke modellen letsel, zoals cornea 6-12 en 13-17 huid, is er de mogelijkheid om de reactie van het weefsel te bestuderen verwonding in het kader van de reparatie mediatoren die betrokken kan zijn bij het ​​proces, en de bijdragen van de vaatstelsel en het zenuwstelsel. Er zijn echter beperkingen aan het manipuleren van de experimentale aandoeningen in vivo, en het is nog niet mogelijk imaging studies verrichten van reparaties respons in vivo continu in de tijd. Daarentegen zijn de meeste in vitro opgewikkelde reparatie cultuurmodellen, zoals scratch wond, kan gemakkelijk worden gemanipuleerd en tijd gevolgd maar missen de omgevingscontext bestuderen wondheling in het in vivo weefsel. Terwijl ex vivo modellen bieden het voordeel van het bestuderen van de schade reparatieproces continu in de tijd in verband met micro de cellen gekoppeld aan het vermogen om de moleculaire regulatoren van de reparatie te moduleren op enig tijdstip in het proces, zijn er weinig modellen die deze passen parameters. Hier wordt beschreven een werkwijze om zeer reproduceerbare ex vivo epitheliale wondgenezing culturen die reactie van een epitheliaal weefsel van een fysiologische verwonding reproduceren genereren. Met behulp van de kippenembryo lens als een tissue bron, een ex vivo mock cataract operatie wordt uitgevoerd. De lens is een ideale weefsel te gebruiken voor deze studies aangezien het self-contained binnen een dikke basaal membraan capsule, avasculaire, niet geïnnerveerd, en vrij van eventuele bijbehorende stroma 18,19. In de menselijke ziekte, cataractchirurgie richt gezichtsverlies vanwege vertroebeling van de lens, en omvat het verwijderen van de lensvezel celmassa, die het grootste deel van de lens omvat. Na cataractchirurgie zicht wordt hersteld door het inbrengen van een kunstmatige intraoculaire lens. De cataract chirurgische procedure door het verwijderen van vezels cellen induceert een verwonding respons in de aangrenzende lensepitheel, die reageert door re-epithelisatie van het achterste gebied van het lenskapsel dat bezet was door de vezel cellen. In cataract chirurgie, zoals in de meeste wondheling respons treedt er soms een afwijkende fibrotische resultaat van de wondgenezingsreactie, op de opkomst van myofibroblasten, die bekend is in het lens Posterior Capsule Ondoorzichtig 20-22. Om de staaroperatie wondgenezing model te genereren, is een staaroperatie procedure nagebootst in lenzen verwijderd uit het kippenembryo oog op een fysiologische letsel te produceren. Microchirurgische verwijdering van lensvezel cellen resulteert in een zeer constante cirkelvormige wond midden van de lens epitheelcellen. Deze cel populatie blijft stevig aan de lens basaal membraan capsule en wordt verwond door de chirurgische procedure. De epitheliale cellen migreren naar de Denuded gebied van de endogene basale membraan naar de wond, onder leiding van een populatie van vimentine rijk mesenchymale cellen in het reparatieproces zogenaamde leader cellen 1 genezen. Met dit model kunnen de respons van een epithelium om schade eenvoudig kunnen worden gevisualiseerd gevolgd met de tijd in de context van de micro cellen. De cellen kunnen worden geraadpleegd door wijziging van de expressie of activatie van moleculen verwachting een rol spelen in wondheling. Een krachtige eigenschap van this model is de mogelijkheid te isoleren en studiemigratie-specifieke veranderingen in het kader van wondgenezing. Het vermogen om grote aantallen voldoen ex vivo kweken wondgenezende leeftijd bereiden studies is een ander voordeel van dit model. Zo, dit modelsysteem biedt een unieke gelegenheid om te plagen elkaar mechanismen van wondheling en test therapeutica voor hun effect op de wondgenezing proces. De ex vivo mock staaroperatie model zal naar verwachting brede toepasbaarheid hebben, die een cruciale bron voor het bestuderen van mechanismen van letsel reparatie.

<table><tbody><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Gebruik op 140 mM in TD Buffer</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Gebruik op 5 mM in TD Buffer</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>Gebruik op 0.7 mM in TD Buffer</td></tr><tr><td>D-glucose (Dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td>Gebruik op 0.5 mM in TD Buffer</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Gebruik op 8.25 mM in TD Buffer</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Gebruik om pH TD buffer naar 7.4 te brengen</td></tr><tr><td>Media 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>Gebruik op 1% in Media199</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Corning/CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>Gebruik op 1% in Media199</td></tr><tr><td>100 mm petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Filter Unit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>Gebruik om Media te steriliseren</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet (2 stuks nodig)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Celkweekschaal</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1 ml SlipTip met precisieglijnaald</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Overige benodigdheden: Algemene dissectie-instrumenten, vruchtbare witte leghorn kippeneieren, controleer e-incubator (bevochtigd, 37,7&deg;C), laminaire flow kap, binoculaire stereovisie dissectiemicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oprichting van een klinisch relevante<em&gt; ex vivo</em&gt; mock cataract surgery model voor het onderzoeken van epithelial wound repair in een inheems microenvironment

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Het grootste belemmerende element voor het begrijpen van hoe een epitheelweefsel wondherstel uitvoert, is de beperkte beschikbaarheid van modellen waarin het mogelijk is om het wondreactie te volgen en te manipuleren ex vivo in een omgeving die nauw aansluit bij die van epitheelweefselbeschadiging in vivo. Dit probleem werd aangepakt door een klinisch relevant epitheel ex vivo letsel-herstelmodel te creëren op basis van cataractchirurgie. In dit kweekmodel kan de reactie van het lensepitheel op wondvorming live worden gevolgd in de oorspronkelijke micro-omgeving van de cellen, en de moleculaire bemiddelaars van wondherstel kunnen eenvoudig worden gemanipuleerd tijdens het herstelproces. Om de kweek voor te bereiden, worden de lenzen uit het oog verwijderd en wordt een kleine incisie gemaakt in het voorste deel van de lens waaruit de binnenste massa lensvezelcellen wordt verwijderd. Deze procedure creëert een cirkelvormige wond op de achterste lenscapsule, de dikke basementmembraan die de lens omringt. Dit wondgebied waar de vezelcellen waren bevestigd, bevindt zich direct naast een continue monolaag van lensepitheelcellen die tijdens de chirurgische procedure verbonden blijft met de lenscapsule. Het gewonde epitheel, het celtype waaruit vezelcellen tijdens de ontwikkeling zijn afgeleid, reageert op de verwonding door de verwijdering van vezelcellen door collectief over het wondgebied te bewegen, geleid door een populatie vimentinerijke herstelcellen waarvan de mesenchymale voorlopers endogeen zijn voor de lens1. Deze eigenschappen zijn typisch voor een normale epitheel wondgenezingsreactie. In dit model is, net als in vivo, wondherstel afhankelijk van signalen die worden geleverd door de endogene omgeving die uniek wordt gehandhaafd in dit ex vivo kweeksysteem, wat een ideale gelegenheid biedt voor de ontdekking van de mechanismen die de herstel van een epitheel na wondvorming reguleren.

Ex Vivo model gemaakt om de wond genezingsproces studeren in inheemse micro-omgeving van de cellen &#39; Om de mechanismen die betrokken zijn bij het ​​reguleren van wondheling van een epitheel binnen inheemse micro de cellen &#39;te onderzoeken, werd een klinisch relevante ex vivo mock staaroperatie model gecreëerd. Dit model is gemaakt van lensdoek biedt vele voordelen vanwege zijn intrinsieke eigenschappen: 1) de lens een onafhankelijk orgaan omgeven met dichte basale me...

Hier wordt de oprichting beschreven van een klinisch relevant ex vivo model voor een nabootste cataractoperatie dat kan worden gebruikt om mechanismen van het letselrespons van epitheelweefsels binnen hun oorspronkelijke micro-omgeving te onderzoeken.

Oprichting van een klinisch relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Het algemene doel van deze procedure is om een klinisch relevant model te creëren waarin wondherstel in de eigen micro-omgeving kan worden gevolgd. Dit wordt bereikt door eerst de lens uit het oog van een kippenembryo te verwijderen. De tweede stap is het maken van een kleine incisie aan de voorzijde van de lens.Elueer vervolgens de lensvezelcelmassa hydrodynamisch. Daarna wordt het lenskapsel met het bijbehorende epitheel afgevlakt door extra incisies in het voorste kapsel te maken. De laatste stap is het vastzetten van de gewonde cultuur aan de weefselkweekschaal om het wondgenezingsproces te kunnen volgen terwijl dit plaatsvindt.Uiteindelijk worden time-lapse microscopie, confocale microscopie en biochemische analyse gebruikt om mechanismen van wondherstel aan te tonen in een model dat de in vivo omgeving nauwkeurig nabootst. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van wondgenezing, zoals de manier waarop cellen gecoördineerd samen bewegen om de wond te sluiten. Bovendien kan deze methode inzicht bieden in het proces van wondherstel.Het kan ook worden toegepast op studies naar wondgenezing bij ABER, in het bijzonder fibrose en littekenvorming. Beg

establishment-clinically-relevant-ex-vivo-mock-cataract-surgery-model

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Dit manuscript beschrijft hoe incisie-achtige letsels gemaakt op gekweekte epitheliale cel monolayers gunstig model wond genezing in vitro, waardoor voor beeldvorming door confocal of laser scanning microscopie, en die kan voorzien van kwalitatief hoogwaardige kwantitatieve en kwalitatieve gegevens voor het bestuderen van zowel cel gedrag en de mechanismen die betrokken zijn bij migratie.

Methoden voor de beoordeling van epitheliale cel migratie tijdens het In Vitro wondgenezing op basis van microscopie

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Hier demonstreren we een geoptimaliseerde techniek voor het beoordelen van wondherstel met behulp van ex vivo menselijke huid in combinatie met een whole-mount kleuringsbenadering. Deze methodologie biedt een preklinisch platform voor de evaluatie van mogelijke wondtherapieën.

Menselijke Ex vivo wondmodel en whole-mount staining benadering om huidherstel nauwkeurig te evalueren

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Het huidige protocol demonstreert de verschillende stappen die betrokken zijn bij het verwonden van het hoornvlies van een embryonaal kuiken in ovo. De regenererende of volledig herstelde hoornvliezen kunnen worden geanalyseerd op regeneratief potentieel met behulp van verschillende cellulaire en moleculaire technieken na de verwondingsprocedure.

Onderzoek naar littekenloze weefselregeneratie bij embryonale gewonde kikkererwtenhoorns

Dit artikel beschrijft een protocol om het proces te vereenvoudigen en de bereiding van autoloog geconditioneerd serum (ACS) goedkoper te maken. Er zijn geen speciale spuiten of glasparels met een oppervlaktecoating nodig. Bovendien heeft het gemodificeerde ACS (mACS) concurrentievoordelen ten opzichte van conventioneel autoloog serum in de hoornvlieswondgenezing van muriene ogen ex vivo.

Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel

Dit artikel beschrijft een methode om wonden te creëren in het epitheel van een levende Clytia hemisphaerica medusa en wondgenezing in beeld te brengen met een hoge resolutie in vivo. Daarnaast wordt een techniek gepresenteerd om kleurstoffen en medicijnen te introduceren om signaalprocessen in de epitheelcellen en extracellulaire matrix tijdens wondgenezing te verstoren.

Karakterisering van epitheliale wondgenezing in vivo met behulp van het Cnidarische modelorganisme Clytia hemisphaerica

Deze methode modelleert staarchirurgie in vivo door lensvezelcellen van volwassen muizen te verwijderen en de kapselzak met bevestigde lensepitheelcellen (LEC's) achter te laten. De letselrespons wordt vervolgens op verschillende tijdstippen na de operatie beoordeeld aan de hand van moleculaire en morfologische criteria.

Modellering van staaroperaties bij muizen

Leer een klinisch relevant ex vivo model voor cataractchirurgie met kippenembryo's. Deze methode maakt real-time observatie van epitheliale wondherstel in het oog mogelijk.

Oprichting van een klinisch relevante Ex Vivo Mock Cataract Surgery model voor het onderzoeken van Epithelial Wound Repair in een Inheems Microenvironment (Video) | JoVE Journal

Oprichting van een klinisch relevante

Meer video's verkennen