Name: Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Leer een gestroomlijnde methode voor het detecteren van klasse 1 integrons en antibiotica-resistentiegenen in levensmiddelen. Dit protocol combineert bacteriële kweek, PCR-screening en DNA-sequencing voor voedselveiligheidsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dankzij Michaela Hall, Larissa Bispo en Gustavo Tavares voor technische bijstand.

Levensmiddelen die rauw worden gegeten of licht gekookt zijn van de meeste zorg voor de gezondheid van de mens. Voorbeelden zijn salade groenten, fruit, schaal- en schelpdieren. 1. Sample Collection <ol><li> Verzamel monsters onder omstandigheden die verontreiniging te minimaliseren, en in afzonderlijke, schone zakken tijdens het transport. Eenmaal verzameld moeten de monsters worden bewaard bij 4 ° C en binnen 24 uur. </li></ol> 2. Verrijkte Cultuur Voorbereiding <ol><li> Fruit en groenten: <ol><li> Leg ongeveer 10 g materiaal in een duurzame plastic zak. Indien voor grotere materiaal, concentreren op de schil van het gewas. Voeg 90 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0 en werkwijze een paddle mixer gedurende 30 sec. Als alternatief, kan het materiaal met de hand worden geschud als een peddel blender is niet beschikbaar. </li><li> Verzamel de vloeistof in twee 50 ml Falcon buizen. Centrifugebuizen bij 4000 xg gedurende 7 min om pellet bacteriën. </li&gt; <li> Verwijder voorzichtig het supernatant en schorten de gepelleteerde bacteriën in 30 ml steriele Luria Bertani (LB) bouillon. </li><li> Incubeer op een schudinrichting O / N, die één buis bij 25 ° C en de andere bij 37 ° C. Culturen moeten 200 trillingen per minuut (opm) worden geschud. WINKEL kweken bij 4 ° C totdat ze nodig waren. </li></ol></li><li> Seafood: <ol><li> Ontleden de maag (oesters) spijsverteringskanaal (garnalen) met steriele pincet en pincet en plaats in een steriele 1,5 ml buis met 200 ui 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0. Maceraat het monster een homogenaat te creëren. </li><li> Doseer 5 ml LB-bouillon in twee steriele 5 ml buizen en enten elk met de zeevruchten homogenaat. </li><li> Incubeer op een schudinrichting O / N, die één buis bij 25 ° C en de overige 37 ° C. Culturen moet op 200 opm worden geschud. WINKEL kweken bij 4 ° C totdat ze nodig waren. </li></ol></li></ol> 3. Screening Cultures for integrons MgCl2 concentratie van 2,5 mM. Indien nodig, heeft Lorenz (2011) 24 PCR-optimalisatie en het oplossen van problemen methoden geschetst in een eerdere uitgave van dit tijdschrift. <ol><li> Gekookte DNA voorbereiding: <ol><li> Verdeel 100 ul van verrijkte cultuur in een steriele 0,5 ml PCR-buis. Verwarm het monster tot 99 ° C gedurende 10 min onder toepassing van een waterbad of verwarmingsblok. Snap chill op ijs gedurende 2 minuten. </li><li> Microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 5 min celresten te pelleteren. Keer terug naar het ijs. DNA monsters kunnen bij -20 ° C worden ingevroren totdat ze nodig, maar moet worden ontdooid op ijs. </li></ol></li><li> Screening voor klasse 1 integronen met behulp van PCR: OPMERKING: Gemengde culturen uit de O / N incubatie worden gescreend voor klasse 1 integronen met de HS463a / HS464 PCR-protocol (tabel 1). <ol><li> Ontdooi alle PCR-reagentia op het ijs, weg van alle mogelijke souRCE verontreinigend DNA. Make up 48 pi PCR mastermix per monster, waaronder negatieve controles (tabel 2). Doseer 48 pi PCR master mix aan elke buis, met behulp van barrière tips. </li><li> Voeg 2 pl ontdooide DNA individuele PCR-buizen met behulp van barrière tips. Run juiste programma in de PCR thermocycler. </li><li> Om de resultaten van de amplificatie beoordelen Electrophorese 7 pi PCR product op een 2% agarosegel gegoten en gerund in TBE buffer (90 mM TRIS-boraat, 2 mM EDTA). Neem een ​​molecuulgewicht merker, zoals een 100 bp ladder. </li><li> Voeg vlek de gel met DNA kleuring en visualiseren met een UV transilluminator. Controleer dat er geen versterking in de negatieve controle is geweest. Een sterke band bij ongeveer 470 bp voor een bepaald monster geeft aan dat de gemengde cultuur bevat bacteriën die een klasse 1 Integron dragen. Pure kolonies zal nu worden geïsoleerd van elke gemengde cultuur die een positieve PCR teruggekeerd. </li></ol></li></ol><ol><li> Seriële verdunningen en de verspreiding platen: Opmerking: Om enkele kolonies te isoleren van het PCR-positieve gemengde kweken, wordt de gemengde kweek serieel verdund 10-voudig in natriumfosfaatbuffer, en vervolgens uitgeplaat op enkele kolonies te herstellen. <ol><li> Voeg 1 ml kweek gemengd met 9 ml van 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0 en mengen door omkeren. Voeg 1 ml van de verdunning tot een verdere 9 ml fosfaatbuffer en herhaal tot een seriële verdunning van 10 -8 bereikt. </li><li> Verdeel 100 ul van de 10 -4 tot 10 -8 verdunningen op LB agar, in tweevoud. Incubeer de platen O / N bij dezelfde temperatuur gebruikt voor de eerste gemengde kweek. De platen kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat ze nodig waren, maar het beste de enkele kolonies vrij snel verwerken. </li></ol></li><li> Enkele kolonie selectie en gekookte DNA voorbereiding: <ol><li> Pick enkele kolonies van de seriële verdunning platen, seaanvinken van vele verschillende types kolonie zijn, volgens de criteria zoals kolonie grootte, vorm en kleur. Gebruik steriele tandenstokers om enkele kolonies van de verspreiding plaat kiezen. </li><li> Raak de tandenstoker naar de kolonie, en vervolgens over in een PCR-buis met 100 ul steriel water. Bij grote aantallen kolonies te screenen, dan kolonies kunnen worden bereid in een microtiterplaat. Draai de tandenstoker tussen de vingers om een ​​aantal van de cellen los in het water. </li><li> Met dezelfde tandenstoker, enten een LB plaat met een streep van de kolonie. Grote aantallen kolonies kunnen worden opgeslagen geëtiketteerd platen als elke strook ongeveer 1 cm lang. Herhaal de stappen 1 tot 3 tot u een geschikt aantal isolaten hebt geselecteerd. </li><li> Incubeer de platen LB O / N, bij dezelfde temperatuur als die toegepast voor de eerste verrijkte cultuur. Kweken kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat ze nodig waren. </li><li> Voor het bereiden van DNA van de bacteriële suspensies, volg de stappen zoals outlined in paragraaf 3.1. Voor de screening van zuivere cultuur lysaten, voeren de HS463a / HS464 PCR zoals beschreven in paragraaf 3.2. Isolaten die terug positief PCR wordt gebruikt voor de bereiding van genomisch DNA (punt 5), en voor verdere analyse. </li></ol></li></ol> 5. Genomic DNA Winning van Integron-positieve Single Colonies behulp Bead Beating 25 <ol><li> Inoculeer 5 ml LB-bouillon met een monster van het zuivere kweek die in paragraaf 4.2. Incubeer O / N, schudden bij dezelfde temperatuur die werd gebruikt voor de eerste verrijkte cultuur. </li><li> Pellet cellen bij 4.000 xg gedurende 7 minuten, verwijder het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 1 ml CLS-TC oplossing in een Lysing Matrix E snel prep buis. Met een kraal kloppend machine verwerkt de monster bij 5,5 m / sec voor 30 sec. </li><li> Centrifugebuis bij 14.000 xg gedurende 5 min en herstellen 700 pl supernatant in een steriele buis van 1,5 ml. </li><li> Voeg 700 ul van binding matrix verdund 1: 5 met 6 M Guanidinium thiocyanaat en meng bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min, verwijder het supernatant. </li><li> Voeg 800 ul zout ethanol wassen (70% ethanol, 0,1 M natriumacetaat) en vortex totdat de pellet volledig geresuspendeerd. Was gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 1 min en gooi supernatant. Zorg ervoor dat alle supernatant werd verwijderd met behulp van een micropipet eventueel vervolgens aan de lucht drogen gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet matrix in 200 gl TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) door en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 3 min en overdracht 160 ul van het geëlueerde DNA in een steriele buis. Run een aliquot van het genomische DNA-extractie op een 2% w / v agarose gel om de opbrengst en de integriteit van de DNA-extractie controleren. De gezuiverde genomisch-DNA wordt opgeslagen bij -20 ° C en ontdooid op ijs indien nodig PCR-test. </li></ol> 6. Diagnostische PCR en DNA sequentiebepaling OPMERKING: Degenomisch DNA bereid in deel 5 zal worden gebruikt voor diagnostische PCR, en de positieve test voor klasse 1 integronen bevestigen. <ol><li> Dooi genomische DNA op ijs, kort vortex het DNA-monster en pols draaien op 14.000 xg gedurende 20 sec. Herhaal de PCR voor de klasse 1 integron-integrase-gen middels HS463a / HS464 (Tabel 1), hetgeen bevestigt dat het isolaat positief voor het 471 bp amplicon (paragraaf 3.2). </li><li> Identificatie van positieve kweken van soorten wordt bereikt door analyse van de kleine subeenheid rRNA-gen (16S rDNA). Versterken de 16S-gen met behulp van primers F27 / r1492 (Tabel 1). Controleer de PCR producten met behulp van elektroforese. Alle bacteriële doelstellingen moeten een 16S amplicon van ongeveer 1450 bp te genereren. </li><li> Sequentie het 16S rRNA-gen amplicon species te bepalen van identiteit, maar aangezien er waarschijnlijk meerdere positieve PCR vanaf stap 6,2, en veel van deze positieve zullen dezelfde bacteriesoort, zullen we eerst onderscheiden verschillende species using restrictiedigestie van het 16S PCR product. <ol><li> Digest een hoeveelheid van de 16S PCR met het restrictie-enzym Hinf 1. Elk enzym dat herkent 4 bp splitsingsplaatsen zal doen, maar Hinf 1 genereert good diversiteit afkomstig van 16S doelen en is een betrouwbare, goedkope enzym. </li></ol></li><li> Het opzetten van een 30 pl restrictiedigestie mastermix (tabel 2) in een steriele buis en voeg 20 ul-un purfied 16S PCR product. Incubeer in een 37 ° C waterbad O / N. Controleer het digest op een 2% agarosegel. </li><li> Ril de ontsluitingspatronen door Hinf 1. Isolaten met hetzelfde restrictie-16S profiel waarschijnlijk dezelfde soort zijn. Eerder dan sequencing elke 16S PCR-product, volgorde ten hoogste drie vertegenwoordigers van elke Hinf 1 restrictie patroon. </li><li> Zuiver het 16S PCR producten met behulp van een commerciële kit. Een enkelstrengs exonuclease kit kan worden gebruikt, maar kolommen gebaseerde of precipitatie methodes werken ook uninc verwijderenorporated primers en enkelstrengs DNA. Sequence de 16S amplicons met primer R910 (tabel 1), het opzetten van de reacties, zoals gespecificeerd door de sequencing faciliteit. </li><li> Gebruik de resulterende DNA-sequentie te ondervragen de NCBI DNA-databank met de BLASTN functie ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Meer dan 97% nucleotide-identiteit wordt meestal als soorten identiteit. </li></ol> 7. Mapping en karakterisering van integronen en Cassette Arrays OPMERKING: Klasse 1 integronen afkomstig uit menselijke gedomineerde ecosystemen zijn waarschijnlijk de meest voorkomende integronen in al uw monsters. Deze integronen allemaal een recente single origin, en daarom een sterk geconserveerde DNA-sequentie 5. <ol><li> Onderscheid tussen een klasse 1 integronen afkomstig van menselijke bronnen en die welke van nature in milieumonsters door het uitvoeren van eenPCR met primer set intI1F165 / intI1R476 10 (tabel 1). OPMERKING: Klasse 1 integronen van klinische of commensale bacteriën zal een ~ 300 bp product te genereren, terwijl de milieuklasse 1 integronen een product niet zal genereren. </li><li> Karakteriseren het klinische integronen door het versterken van de cassette array met primer set HS458 / HS459. Dit PCR zal het gebied tussen intI1 en geconserveerde segment van de 3 &#39;te versterken bij het ​​eindpunt van de meeste cassette arrays. Omdat het aantal en de identiteit van cassettes is variabel, zal de grootte van het PCR-product eveneens variëren. </li><li> Zuiver amplicons en de DNA sequentie met behulp van elk van de amplificatieprimers. Gebruik sequenties DNA-databanken met de BLASTN functie (ondervragen <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Zorg voor het benoemen van de cassettes te volgen gestandaardiseerde nomenclatuur 9, omdat veel gegevens deposities voor Integron gencassettes gebruiken inconsistente of onduidelijke namen. Bijzondere aandacht schenken aan nieuw gen cassettes, omdat deze nieuwe fenotypes kunnen coderen, waaronder genen die verlenen verhoogde overdraagbaarheid, pathogeniteit en virulentie 8,21. OPMERKING: Preklinische vormen van de klasse 1 Integron steeds circuleren in natuurlijke omgevingen. Met name die welke verband houden met actieve Tn 402 transposons zijn het meest interessant 26. De cassette arrays van deze integronen niet zal versterken met primer set HS458 / HS459, maar kan worden versterkt met de MRG284 / MRG285 primer set (tabel 1), het genereren van amplicons van variabele grootte afhankelijk van de cassette-inhoud. PCR producten worden gezuiverd en DNA-sequentiebepaling zoals beschreven in 7.2. </li></ol>

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets relevant te onthullen.

De identificatie van integronen en de bijbehorende gen cassettes is potentieel een belangrijke stap in het voorspellen van de opkomst van nieuwe opportunistische pathogenen, tracking paden voor ziekteverwekkers in de menselijke voedselketen, en het identificeren van nieuwe weerstand en virulentiedeterminanten 8,21,26. Het doel van dit artikel was om een ​​gestroomlijnde aanpak voor het screenen van monsters voor klasse 1 integronen, het karakteriseren van de cassette arrays en het identificeren van de soorten...

De ontdekking van antibiotica was een van de grootste wetenschappelijke prestaties van de 20 ste eeuw. Echter, het gebruik en misbruik van antibiotica heeft geleid tot de snelle evolutie van antibiotica resistente bacteriën, en die nu een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in de 21e eeuw poseren. De opkomst van bacteriestammen resistent tegen de meeste behandelingen verhoogt de mogelijkheid we betreden een tijdperk waarin antimicrobiële geneesmiddelen zijn niet langer effectief 1,2. De genetische machines die antibiotica-resistentie is een oud systeem, die dateren van vóór de mens en antibiotische selectie druk door miljoenen jaren 3. Mobiele genetische elementen, zoals plasmiden, transposons, genomische eilanden, integratieve conjugatieve elementen en integronen kan verspreiden antibiotica resistentiegenen (ARG), zowel binnen als tussen bacteriesoorten 4. Hiervan hebben integrons een centrale rol in de verspreiding van ARG gespeeld, ondanksfeit dat ze vertrouwen op plasmiden en transposons voor de mobilisatie en het inbrengen in bacteriële genomen 5. Integronen vastleggen gencassettes via een integron-integrase, en vervolgens tot expressie cassettes middels een integron gecodeerd promoter 6,7 (figuur 1). Integron gen cassettes zijn kleine mobiele elementen bestaande uit enkele open reading frames (ORF), waarvan de producten kan resistentie tegen antibiotica of ontsmettingsmiddelen 8. Klasse 1 integronen zijn de integronen meest hersteld van klinische isolaten 5, waar ze gezamenlijk hebben verworven meer dan 130 verschillende antibioticumresistentiegen cassettes 9. De verspreiding van klasse 1 integronen in-menselijke geassocieerd commensale en pathogene bacteriën genereert afvalstromen mens dat een groot aantal van deze genetische elementen 10 bevatten. Naar schatting 10 19 bacteriën die klasse 1 integronen bevatten, worden vrijgegeven via zuiveringsslib elk jaar in het Verenigd Koninkrijk 11. Het is daarom niet verwonderlijk dat klasse 1 integronen verlenen antibioticaresistenties worden nu gedetecteerd in microbiota van wilde vogels, vissen en andere inheemse dieren 12-14. Vrijgeven integronen terug in het milieu vormt een belangrijke bedreiging voor de volksgezondheid, omdat de verwerving van nieuw gen cassettes en complexe herschikkingen met andere mobiele elementen blijft optreden, met name in zuiveringsinstallaties en andere waterlichamen 15-18. De natuurlijke omgeving wordt dan een vruchtbare werven voor nieuwe weerstand determinanten en opportunistische pathogenen 19,20. Novel-Integron met bacteriën en nieuwe gegeven argumenten terug omcirkelen in de menselijke gemeenschap via besmet water en voedsel 21,22. Bewaking van het milieu ARGs is een belangrijke strategie voor het begrijpen en beheren van resistentie tegen antibiotica in de toekomst 23. In het bijzonder moet aandacht worden besteed aan levensmiddelen die rauw worden gegeten oflichtvaardig gekookt, omdat deze presenteren de grootste bedreiging voor de overdracht van nieuwe mobiele elementen en ziekteverwekkers. In dit protocol, een gestroomlijnde benadering voor het detecteren, identificeren en karakteriseren van klasse 1 integronen en bijbehorende gencassettes in levensmiddelen worden beschreven (Figuur 2). Met een combinatie van kweken en polymerase kettingreactie (PCR), kan integrons snel worden gedetecteerd in complexe bacteriële en individuele isolaten. Werkwijzen voor het identificeren van de soorten bacteriën en de conformatie en identiteit van het Integron geassocieerde gencassettes gegeven. De werkwijze is geschikt voor een breed scala van plantaardige en dierlijke voedingsmiddelen en voorbeelden zijn werkstromen voor elk van deze soorten voedsel.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Gebruikt in alle PCR's</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A uit runderpancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Gebruikt in alle PCR's</td></tr><tr><td>HinFI restrictie-enzym</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Wordt gebruikt om 16S rDNA PCR-producten te verteren. Enzym wordt geleverd met optimale buffer en BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Wordt gebruikt als maatstandaard op alle agarosegels</td></tr><tr><td>GelRed DNA-kleurstof</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>VOORZICHTIG: Persoonlijke bescherming moet worden gedragen bij het hanteren van dit materiaal</td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanaat</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>VOORZICHTIG: Persoonlijke bescherming moet worden gedragen bij het hanteren van dit materiaal</td></tr><tr><td>CLS-TC-oplossing</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspenderingsoplossing die wordt gebruikt aan het begin van de genomische DNA-extractie</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep-buizen</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Buis die nodig is voor mechanische vernietiging van bacteriële celwanden. Deze code wordt gebruikt voor verpakkingen van 500 buizen, kleinere hoeveelheden zijn beschikbaar.</td></tr><tr><td>Bindingsmatrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Verdund 1:5 met 6 M guanidiniumthiocyanaat en gebruikt in de genomische DNA-extractiemethode.</td></tr><tr><td>Fast Prep-machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Aantal beschikbare opties</td><td>MP Biomedicals heeft een aantal FastPrep-machines beschikbaar om te kopen. Bezoek <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> voor meer informatie</td></tr></tbody></table>

screening levensmiddelen voor klasse 1 integrons en gene cassettes

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibioticaresistentie is een van de grootste bedreigingen voor de gezondheid in de 21ste eeuw. De verwerving van resistentiegenen via laterale genoverdracht is een belangrijke factor in de verspreiding van diverse resistentiemechanismen. Onder de DNA-elementen die laterale overdracht vergemakkelijken, zijn de klasse 1-integrons grotendeels verantwoordelijk voor de verspreiding van antibioticaresistentiedeterminanten onder gramnegatieve ziekteverwekkers. In totaal hebben deze integrons meer dan 130 verschillende antibioticaresistentiegenen verworven en verspreid. Met het voortgezette gebruik van antibiotica zijn klasse 1-integrons alomtegenwoordig geworden in commensaal en pathogeen micro-organismen van mensen en hun gedomesticeerde dieren. Als gevolg hiervan zijn ze nu te vinden in alle menselijke afvalstromen, waar ze nieuwe genen blijven verwerven en het potentieel hebben om via de voedselketen terug te keren in de mens. Dit protocol beschrijft een gestroomlijnde benadering voor het detecteren van klasse 1-integrons en hun geassocieerde resistentiegencassettes in levensmiddelen, met behulp van cultivering en PCR. Met behulp van dit protocol zouden onderzoekers in staat moeten zijn om: monsters te verzamelen en voor te bereiden om verrijkte culturen te maken en te screenen op klasse 1-integrons; enkele bacteriekolonies te isoleren om integron-positieve isolaten te identificeren; bacteriesoorten te identificeren die klasse 1-integrons bevatten; en deze integrons en hun geassocieerde gencassettes te karakteriseren.

Screening van gemengde culturen en bacteriële isolaten van intI1 Primerpaar HS463a / HS464 PCR kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de klasse 1 integron-integrase gen, intI1 (figuur 1) te detecteren. Deze primer set werkt goed voor het detecteren intI1 in gemengde culturen, en wordt ook gebruikt om bacteriële kolonies geoogst uit platen uitgespreid (figuur 2) te screenen. Positieve isolaten moet een sterke band te genereren bij 471 bp me...

Dit protocol beschrijft de detectie van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in levensmiddelen.

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gestroomlijnde aanpak te bieden voor het detecteren van klasse 1 integrons en hun bijbehorende gencassettes in voedingsmiddelen. Dit wordt bereikt door eerst een verrijkte bacteriële kweek te maken van het gekozen voedingsmiddel. De tweede stap is het screenen van de kweek op de aanwezigheid van klasse 1 integrons met behulp van PCR en het isoleren van enkele kolonies uit de integron-positieve mengkweek.Nadat de individuele kolonies zijn gescreend op de aanwezigheid van integrons, wordt genomisch DNA uit deze kolonies geprepareerd voor diagnostische PCR's om bacteriële soorten te differentiëren en de aanwezigheid van gencassettes aan te tonen. De laatste stap is het zuiveren van de PCR-producten en het indienen hiervan voor DNA-sequentieanalyse. Uiteindelijk wordt DNA-sequentieanalyse gebruikt om gencassettes binnen een klasse 1 integron te karakteriseren en de soort waarin ze zich bevinden te identificeren.Antibioticaresistentie is een van de grootste problemen waar de medische behandeling in de 21e eeuw voor staat. Een van de manieren waarop we antibioticaresistentie kunnen beheersen, is door antibioticaresistentiegenen in het milieu

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Salmonella spp. /Shigella spp. zijn gemeenschappelijke ziekteverwekkers toegeschreven aan diarree. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. PCR in real time te gebruiken in combinatie met begeleide cultuur.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Conjugatie bemiddelt horizontale genoverdracht door plasmide-DNA over twee verschillende cellen te mobiliseren, waardoor de verspreiding van nuttige genen wordt vergemakkelijkt. Dit werk beschrijft een veelgebruikte methode voor de efficiënte detectie van conjugatieve plasmideoverdracht, gebaseerd op het gebruik van differentiële markers in het conjugatieve plasmide, donor en ontvanger om transconjugatie te detecteren.

Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

Campylobacter is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastro-enteritis door voedsel. Ondanks het feit dat bedrijven maatregelen nemen om de prevalentie in hun faciliteiten te verminderen, bereiken besmette producten consequent de consument. De techniek die in de afgelopen twaalf jaar is ontwikkeld, richt zich op de beperkingen van bestaande methoden voor het isoleren en detecteren van Campylobacter spp. uit rauw vlees.

Detectie en isolatie van Campylobacter spp. uit rauw vlees

Deze studie stelt een reeks standaard operationele procedures (SOP's) vast voor het efficiënt screenen en isoleren van darmbacteriën die in staat zijn om C-glycosiden te splitsen.

Screening en isolatie van C-glycoside-splitsende darmbacteriën

Leer een gestroomlijnde methode voor het detecteren van klasse 1 integrons en antibiotica-resistentiegenen in levensmiddelen. Dit protocol combineert bacteriële kweek, PCR-screening en DNA-sequencing voor voedselveiligheidsonderzoek.

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Meer video's verkennen