Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de distributie van DNA-reparatie-eiwitten rond dubbelstrengs DNA-breuken op nanoschaal in kaart te brengen. Dit is om de ultrastructuur van beschadigd chromatine dat een reparatie ondergaat te bestuderen met behulp van elektronenspectroscopische beeldvorming. Dit wordt bereikt door DNA-expressieconstructen te genereren die coderen voor fusie-eiwitten van DNA-schaderespons-eiwitten met behulp van een fluorescent eiwit en de mini-SOG-tag.

Als tweede stap worden constructen via transfectie in cellen geïntroduceerd, waarna de cellen worden beschadigd door middel van laser- of gammabestraling. Vervolgens ondergaan de bestraalde en gefixeerde cellen preparatiestappen voor elektronenmicroscopie, om de distributie van het met mini SOG gelabelde reparatie-eiwit zichtbaar te maken in de elektronenmicroscoop. De resulterende elektronspectroscopische imaging levert gedetailleerde beelden op die analyse van de chromatinultrastructuur en de relatie van specifieke eiwitten met DNA-reparatiefoci mogelijk maken.

Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van andere bestaande technologieën, zoals ImmunoGold-labeling, is dat deze niet afhankelijk is van de toegankelijkheid van antilichamen en dat het de structuren van belang zeer dicht labelt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de foto-oxidatie zeer gevoelig is voor pH, lichtintensiteit en zuurstofsaturatie. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen van foto-oxidatie, zuurstofsaturatie en belichting gevoelig zijn voor zeer kleine veranderingen; het is daarom belangrijk om te illustreren hoe de methode wordt uitgevoerd om deze te kunnen reproduceren.

Dr. Hilmar Fadden, een postdoc in mijn laboratorium, zal de methode voor u demonstreren. Cultiveer humane osteosarcoomcellen die stabiel de mini SOG en M-cherry gelabelde hersteleiwitten tot expressie brengen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Nadat de cellen vanuit een schaal van 10 centimeter zijn gesplitst, laat u de cellen groeien tot een confluentie van 80%.

Plaats de cellen vervolgens onder een fluorescentiemicroscoop en gebruik een steriele diamantpen om een klein gebied van ongeveer één vierkante millimeter af te bakenen dat cellen bevat die de eerder gemarkeerde ectopische eiwitten tot expressie brengen; sensitiseer de cellen door herx aan de oplossing toe te voegen zodat de uiteindelijke concentratie 0,5 µg/mL is, en plaats ze vervolgens in de incubator bij 37 °C gedurende 20 minuten. Bestraal de cellen daarna met een laser door gebruik te maken van de 405 nm solid-state laser van een confocale microscoop om DNA-schade te induceren; fixeer de cellen na de DNA-schade in het donker met één mL 4% paraformaldehyde in 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Was de cellen twee keer met vier milliliter 0,1 molar natrium-Cate-buffer bij een pH van 7,4. Behandel de gefixeerde cellen vervolgens gedurende 30 minuten met twee milliliter van een oplossing bestaande uit 50 millimolar glycine, vijf millimolar aminotriazool en 10 millimolar kaliumcyanide bij een pH van 7,4. Vervang de buffer door twee milliliter foto-oxidatiebuffer bij een pH van 7,4, die is bereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Incubeer het monster vervolgens in het donker op ijs, terwijl er zuurstof door de oplossing wordt geleid om deze zuurstofverzadigd te houden. Plaats daarna het schaaltje met de gefixeerde cellen voorzichtig op een inverted fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een 40 x olie-immersieobjectief en verplaats het naar het eerder omlijnde interessegebied. Exciteer de mini SOG-tag met blauw licht met behulp van filterkubussen voor groen fluorescent eiwit.

Zet de belichting voort, zelfs nadat de groene mini SOG-fluorescentie volledig is verdwenen, totdat het bruine foto-oxidatieproduct van de gepolymeriseerde dia-aminobenzidine zichtbaar wordt in het transmissiekanal. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 30 minuten met 1 mL 2% glutaraldehyde in 0,1 M natriumcitraatbuffer bij pH 7,4.

Fixeer vervolgens de celmembranen met 0,1 tot 0,5% osmiumtetroxide in 0,1 molar natrium-cacodylaatbuffer gedurende 20 minuten bij pH 7,4. Dehydrateer de cellen na fixatie via een reeks ethanolwasstappen. Incubeer de cellen vervolgens gedurende vier uur op een schudapparaat in een mengsel van 100% ethanol en acrylhars in een verhouding van één-op-één.

Verwijder vervolgens het mengsel en voeg 100% acrylhars toe aan de monsters voor nog eens vier uur. Om de hars te polymeriseren, snijdt u met een scheermesje de dop van een gelabelde microcentrifugebuis van twee milliliter af en bestrijkt u de rand met acrylharsversneller. Vul de buis voorzichtig voor ongeveer twee derde met LR witte hars met behulp van een pasta-pipetpunt.

Zorg ervoor dat de hars niet in contact komt met de versneller op de rand. Verwijder de hars die in de cellen van de schaal is geïnfiltreerd en plaats de schaal ondersteboven op de rechtopstaande microcentrifugebuis, zodat de breedte van de buis het glazen observatiewenster van het schaalgewicht bijna volledig opvult. Laat de versneller één tot twee minuten inwerken om de buis en het dekglas te verzegelen.

Keer de buis vervolgens om zodat de hars in de buis nu de cellen bedekt. Plaats de schaal met de buis in een oven op 60 °C en laat deze 12 uur uitharden. Wanneer het blok is uitgehard, haal dan de schaal met de vastgehechte, met hars gevulde microcentrifugebuis uit de oven en scheid de microcentrifugebuis van de schaal.

Gooi de schaaltje met glazen bodem weg en snijd de microcentrifugebuis voorzichtig open met een scheermesje om het blok vrij te maken. Trim het blok met een scheermesje zodat alleen het gebied van één vierkante millimeter overblijft dat het gebied bevat dat eerder met de diamant- of wolfraampen is gemarkeerd. Monteer het blok vervolgens in een ultramicrotoom en trim het blok met een trimmes tot de cellen zijn bereikt.

Schakel vervolgens over naar een diamantmes en snijd ultradunne secties van ongeveer 50 nanometers door de cellen. Neem de secties op high transmission 300 mesh grids. Plaats de grids daarna in een carbon coer en coat de secties met ongeveer 0,2 tot 0,4 nanometers koolstof om ze te helpen stabiliseren onder de elektronenbundel van de transmissie-elektronenmicroscoop.

Plaats de roosters in een transmissie-elektronenmicroscoop die is uitgerust met een energiefilter. Inspecteer de cellen op de coupes met de normale transmissiemodus bij lage vergroting en vergelijk deze met eerder gemaakte fluorescentiebeelden. Zodra een kern met een DNA-beschadigingsspoor of DNA-reparatiefoci is gevonden, schakelt u over naar de energiefiltermodus en registreert u het monster met een diktekaart.

Registreer vervolgens de post-edge afbeeldingen van de fosforkarting bij een elektronendynamisch energieverlies van 175 eV met een spleetbreedte van 20 eV. Registreer daarnaast pre-edge afbeeldingen bij een energieverlies van 120 eV, eveneens met een spleetbreedte van 20 eV voor de stikstofkarting. Registreer post-edge afbeeldingen bij 447 eV met een spleetbreedte van 35 eV en pre-edge afbeeldingen bij 358 eV.

Ook met een sleufbreedte van 35 elektronvolt. Open de elementaire verhoudingskaarten in een beeldbewerkingsprogramma zoals deze. Kopieer de stikstofkaart naar het rode kanaal en de fosforkaart naar het groene kanaal van een RGB-afbeelding.

Superponeer en lijn de kaarten vervolgens uit. Exporteer het samengestelde beeld als een bestand in het tagged image file format en open het beeld daarna in een beeldbewerkingsprogramma dat met lagen kan werken. Pas vervolgens het dynamisch bereik van elk kanaal aan door de minimum- en maximumwaarden in het beeld te schalen naar een dataset van acht bit.

Trek vervolgens de fosforinhoud af van de stikstofkaart in het lagenvenster. Zet de afbeelding om naar een geïndexeerde kleur en maak in de CMYK-kleurruimte een gele opzoektabel voor de kaart die de verdeling van de nucleïnezuren weergeeft en een cyaan opzoektabel om de kaart van niet-chromatine-eiwitten weer te geven. Maak daarna een nieuwe afbeelding aan en importeer de kaarten die de verdeling van fosfor en niet-chromatine-eiwitten tonen als afzonderlijke lagen.

Gebruik de transparantiemodus van het scherm om beide lagen over elkaar heen te zien. Hier worden elektronenspectroscopische ratio-kaarten uit een celkern getoond, die de locaties van fosfor en stikstof weergeven wanneer de twee ratio-kaarten over elkaar heen worden gelegd in de RGB-kleurruimte. Een afbeelding zoals hier getoond, wordt op deze manier verkregen.

Gele structuren representeren nucleaire eiwitten die de aanwezigheid van zowel fosfor als stikstof weerspiegelen. Hier wordt elektronenspectroscopische imaging gebruikt om de veranderingen in de foci-structuur te bekijken na gamma-bestraling in U2 OS-cellen. De stabiel expresserende M cherry-gelabelde hersteleiwitten in de bovenste rij zijn beelden van cellen die niet zijn bestraald.

De tweede rij toont cellen die drie uur na bestraling zijn gefixeerd. De derde rij toont cellen die zes uur na bestraling zijn gefixeerd. De elektronenspectroscopische beeldvorming onthult dat de structuur van de foci in de loop van de tijd lijkt te reorganiseren, aangezien de relatieve hoeveelheid 53 BP1-proteïne in de focus, aangeduid door de toename van het stikstofsignaal, lijkt toe te nemen, terwijl het chromatine, aangeduid door het fosforsignaal, een meer perifere positie inneemt.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bestraalde cellen die mini-so repair-eiwitten tot expressie brengen, kunt prepareren om de ultrastructuur van chromatine in DA-repairfoci te analyseren middels elektronenspectroscopische beeldvorming. Vergeet niet dat het werken met natriumca-correlaatbuffer, kaliumcyanide en osmiumoxide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het werken in een zuurkast en het dragen van handschoenen, bij het uitvoeren van deze procedure.