Name: Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Leer hoe je hoge capaciteit adenovirale vectoren produceert voor gentherapie met behulp van homing endonucleases en helper virussen. Deze methode levert tot 35 kb therapeutisch DNA af zonder virale coderende sequenties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie EH 192/5-1 (A.E.), het EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), de UWH Forschungsförderung (E.S. en W.Z), en het promotieprogramma van de Universiteit Witten/Herdecke (P.B.). J.L. werd ondersteund door een beurs van de Chinese Scholarship Council en T.B. en M.G door de Else Kröner-Fresenius Stichting (EKFS).

<ol><li>Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus vectors for gene delivery.</a> Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+the+first+effective+in+vivo+gene+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector.</a> Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).</li>
<li>Morral, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+a+helper-dependent+adenoviral+vector+yield+supraphysiological+levels+of+alpha1-antitrypsin+with+negligible+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenovirus+vectors+elicit+intact+innate+but+attenuated+adaptive+host+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo.</a> J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).</li>
<li>Ehrhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-deleted+adenoviral+vector+results+in+phenotypic+correction+of+canine+hemophilia+B+without+liver+toxicity+or+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia.</a> Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).</li>
<li>Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+dependent+adenovirus+vectors%3A+progress+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects.</a> Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+recombinant+adenovirus+vector+by+an+improved+in+vitro+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.</a> Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+E1-+and+E1%2FE4-deleted+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).</li>
<li>Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+helper-dependent+vector+results+in+long-term+therapeutic+levels+of+human+coagulation+factor+IX+at+low+doses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo.</a> Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

De hier gepresenteerde protocol maakt zuivering van HCAdV vectoren gebaseerd op menselijke adenovirus type 5 gebaseerd op eerder beschreven procedures 4,12. De HCAdV genoom binnen pAdFTC plasmide mist alle adenovirus genen en alleen draagt ​​de 5&#39;- en 3&#39;-ITR&#39;s en het verpakkingssignaal. In deze strategie de HV AdNG163R-2 4 biedt alle benodigde genen voor een efficiënte virus productie in trans. Dit biedt een verpakking van maximaal 35 kb, die duidelijk outcompetes eerste en twe...

Bij gentherapie toepassingen is het van groot belang cytotoxische en immunogene bijwerkingen veroorzaakt door expressie van virale proteïnen, het transgen zelf of binnenkomende virale eiwitten voorkomen. Adenovirusvectoren (AdV) worden veelvuldig gebruikt om vreemd DNA te introduceren in een grote verscheidenheid van cellen om het effect van transgenexpressie 1,2 onderzoeken. De meest geavanceerde versie van AdV wordt vertegenwoordigd door hoge capaciteit adenovirus vectoren (HCAdV) ontbreken alle virale coderende sequenties 3,4 en biedt daarmee een verpakking capaciteit tot 35 kb in combinatie met een lage immunogeniciteit en lage toxiciteit 5-8. Vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit ze laten leveren van grote of meerdere transgenen met een enkele dosis vector. Daarom, zij vertegenwoordigen een waardevol instrument voor de onderzoeksgemeenschap. In tegenstelling tot de eerste of tweede generatie AdV zonder de vroege genen E1 en / of E3 die eenvoudig kunnen worden geproduceerd met behulp van commerciële kits, vector genoom bouw en virus productie van HCAdV is complexer. Het systeem voor de constructie van HCAdV genomen is gebaseerd op het plasmide pAdFTC met een HCAdV genoom zonder alle virale coderende sequenties en shuttle plasmide pHM5 9-12. Elk gen van belang tot 14 kilobasen (kb) worden gekloneerd in de shuttle vector pHM5 waarbij de meervoudige kloneringsplaats geflankeerd door herkenning / splitsen plaatsen van de homing endonucleasen PI- Sce I I- Ceu I. Daarom kan een gekloneerd gen van interesse worden vrijgegeven door opeenvolgende PI- Sce I en I Ceu I digesteert voor daaropvolgende gerichte insertie in dezelfde restrictieplaatsen aanwezig in het genoom HCAdV in het plasmide pAdFTC. In pAdFTC de transgene insertieplaats tussen de PI- Sce I en I Ceu I splitsingsplaatsen wordt geflankeerd door DNA stuffer en de coderende adenovirale sequenties die vereist zijn voor genoom verpakken als de 5 &#39;en 3&#39; omgekeerde eindstandige herhalingen (ITR&#39;s)aan beide uiteinden en het verpakkingssignaal stroomafwaarts van het 5&#39;ITR. De extra DNA stuffer een optimale grootte van de uiteindelijke HCAdV genoom variëren van 27 tot 36 kb efficiënte verpakking tijdens virusproductie te waarborgen. Aangezien pAdFTC is een groot plasmide met tot 45 kb (afhankelijk van de grootte van het ingebrachte transgen) en het gebruik van homing endonucleases naar verhouding lange verwijzingen DNA herkenning vertoont sterke DNA bindende verscheidene opschonen stappen nodig tijdens de overdracht van het transgen uit pHM5 naar pAdFTC. Zorgvuldige behandeling vermijden van schuifkrachten wordt aanbevolen. De ITR&#39;s van de HCAdV genoom geflankeerd door NotI restrictie-enzym herkenningsplaatsen direct stroomopwaarts van het 5&#39;ITR en stroomafwaarts van de 3&#39;ITR 12. Daarom kan HCAdV worden vrijgegeven door Notl digest voor daaropvolgende transfectie van het virale genoom in de HCAdV producerende cellijn. Merk op dat het gebruik van het restrictie-enzym Notl voor relgemak van het virale genoom van het plasmide pAdFTC impliceert dat de ingebrachte transgen mist NotI DNA herkenningsplaatsen. De HEK293 cellen gebaseerde producerende cellen (116 cellen) stabiel uitdrukken Cre recombinase. Voor virus amplificatie 116 cellen zijn co-geïnfecteerd met een helper virus (HV) het verstrekken van alle AdV genen die nodig zijn voor replicatie en verpakken in trans 3,4. De HV is een eerste generatie AdV met een floxed verpakking signaal dat tijdens virusreplicatie door Cre recombinase tot expressie gebracht in 116-cellen 4 wordt verwijderd. Dit zorgt ervoor dat voornamelijk HCAdV genomen met een intacte inpaksignaal worden ingekapseld. Pre-amplificatie van het HCAdV wordt uitgevoerd door het uitvoeren van seriële passage in stappen 116 cellen gekweekt op oppervlakken in weefselkweekplaten. Na elke doorgang virusdeeltjes vrijkomen uit geïnfecteerde cellen door het uitvoeren van drie achtereenvolgende vries- dooi stappen. Bij elke passage steeds meer cellen worden besmet met1/3 cellysaat van de voorgaande passage. Tenslotte lysaat uit de laatste pre-amplificatiestap wordt gebruikt om producerende cellen gekweekt in suspensie in een spinner fles voor grootschalige amplificatie infecteren. Virionen gezuiverd uit de celsuspensie door het uitvoeren van ultracentrifugatie in een cesium chloride dichtheidsgradiënt 4,12. Met deze procedure lege deeltjes volledig geassembleerd deeltjes worden gescheiden in twee afzonderlijke banden. Om verder te concentreren de HCAdV deeltjes een tweede niet-geleidelijke ultracentrifugatie stap wordt uitgevoerd. Vervolgens werd de verkregen band met de HCAdV verzameld en gedialyseerd tegen een fysiologische buffer. Vector laatste voorbereidingen worden gekenmerkt met betrekking tot de aantallen absolute virusdeeltjes, besmettelijke deeltjes en HV besmetting niveaus. Absolute virale deeltjes kan worden bepaald door het lyseren van virusdeeltjes en meten van de absorptie bij 260 nm of door het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) 12. Besmettelijkheid van de purified virusdeeltjes kan worden bepaald door qPCR meten HCAdV genomen aanwezig in geïnfecteerde cellen 3 uur na infectie.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>restrictiedigest</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>restrictiedigest</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligatie</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>restrictiedigest</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>restrictiedigest</td></tr><tr><td>Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>defosforylering van gedigesteerde plasmiden</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>selectie van CRE expresserende 116 cellen</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Hek293T celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 celcultuurmedium&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaatbufferoplossing (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>wassen van cellen, hersuspensie van cellen</td></tr><tr><td>250-ml opslagfles</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>infectie van 116 cellen gekweekt in suspensie</td></tr><tr><td>500-ml PP Centrifugeerbuizen</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sedimentatie van cellen uit suspensiecultuur</td></tr><tr><td>Spinner fles</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>groei van 116 cellen in suspensie</td></tr><tr><td>Ultra Clear Ultracentrifugebuizen</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>dichtheidsgradiëntcentrifugatie</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>dichtheidsgradiëntcentrifugatie</td></tr><tr><td>SW-41 rotor</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>dichtheidsgradiëntcentrifugatie</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membraan</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>dialyseslang</td></tr><tr><td>klaar-voor-gebruik dialysecassettes&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>dialyse</td></tr><tr><td>one shot DH10B elektrocompetente E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>transformatie van ligatiereacties</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>isolatie van genomisch DNA</td></tr><tr><td>SuperFect Transfectie Reagens</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>transfectie van 116 cellen</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfectie van 116 cellen</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp;170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 touch&nbsp;</td><td>Biorad</td><td></td><td>qPCR-machine</td></tr><tr><td>Fenoel/Chloroform/Isoamyl alcohol&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>zuivering van DNA</td></tr><tr><td>Cesiumchloride</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>dichtheidsgradiëntcentrifugatie</td></tr><tr><td>natriumacetaat 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA-precipitatie</td></tr><tr><td>LB-medium&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>bacteriegroeimedium</td></tr><tr><td>ethanol&nbsp; 99,8% puur</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>DNA-precipitatie en wassen</td></tr><tr><td>SDS 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>lysisbuffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>lysisbuffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>dialysebuffer/ lysisbuffer</td></tr><tr><td>glycerol 99,5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>dialysebuffer</td></tr><tr><td>MgCl2 98,5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>dialysebuffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>optionele dialysebuffer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>optionele dialysebuffer</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>optionele dialysebuffer</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>optionele dialysebuffer</td></tr><tr><td>1,5-ml buizen</td><td>sarstedt</td><td>72,730,005</td><td>opslag van viruspreparaten bij -80 &deg;C</td></tr></tbody></table>

klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Adenovirale vectoren met hoge capaciteit (HCAdV) zonder alle virale coderende sequenties vertegenwoordigen een van de meest geavanceerde genoverdrachtsvectoren vanwege hun hoge verpakkingscapaciteit (tot 35 kb), lage immunogeniciteit en lage toxiciteit. Echter, voor veel laboratoria wordt het gebruik van HCAdV belemmerd door de gecompliceerde procedure voor vectorgenoomconstructie en virusproductie. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor efficiënte kloontechniek en productie van HCAdV beschreven op basis van het plasmide pAdFTC dat het HCAdV-genoom bevat. De constructie van HCAdV-genomen is gebaseerd op een kloondevectorsysteem dat gebruik maakt van homing endonucleasen (I-CeuI en PI-SceI). Elk gen van belang tot 14 kb kan worden subgekloond in de shuttlevector pHM5, die een meervoudig kloonsitus bevat dat wordt geflankeerd door I-CeuI en PI-SceI. Na het I-CeuI en PI-SceI-gemedieerde vrijgeven van het transgen uit de shuttlevector kan het transgen worden ingebracht in de HCAdV-kloondevector pAdFTC. Vanwege de grote omvang van het pAdFTC-plasmide en de lange herkenningsplaatsen van de gebruikte enzymen geassocieerd met sterke DNA-binding, is zorgvuldige behandeling van de kloondefragmenten noodzakelijk. Voor virusproductie wordt het HCAdV-genoom vrijgegeven door NotI-digest en getransfecteerd in een HEK293-gebaseerde produceercellijn die stabiel Cre-recombinase tot expressie brengt. Om alle adenovirale genen te bieden voor adenovirusamplificatie, is co-infectie met een helpervirus dat een pack-signaal bevat dat wordt geflankeerd door loxP-plaatsen vereist. Pre-amplificatie van de vector wordt uitgevoerd in produceercellen die op oppervlakken worden gekweekt en grootschalige versterking van de vector wordt uitgevoerd in spinnerkolven met produceercellen die in suspensie worden gekweekt. Voor viruszuivering worden twee ultracentrifugeringsstappen op basis van cesiumchloride-gradiënten uitgevoerd, gevolgd door dialyse. Hier worden tips, trucs en shortcuts gepresenteerd die in de afgelopen jaren zijn ontwikkeld tijdens het werken met dit HCAdV-vectorsysteem.

Hier representatieve voorbeelden voor klonering, amplificatie en zuivering van HCAdV preparaten worden getoond. Een overzicht van de kloneringsstrategie (figuur 1) en representatieve voorbeelden voor klonering en afgifte van de HCAdV genoom door restrictie-enzym digest worden voorzien (figuur 2). Een typische restrictiepatroon na de vrijgave van de GOI-expressiecassette van pHM5 door PI- Sce I en I I Ceu verteren en vervolgens met fenol...

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van een gen-gedelete, high-capacity adenovirale vector voor de aflevering en expressie van therapeutische transgenen in levende cellen of organismen. Deze methode kan het vakgebied van de gentherapie helpen bij het afleveren van grote transgenen die niet in andere virale vectoren passen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat high-capacity adenovirussen verstoken zijn van virale genen.Met behulp van deze vectoren kan tot 35 kb aan vreemd DNA worden afgeleverd. De toepassing van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie voor erfelijke ziekten, omdat het helpt bij het afleveren van therapeutische constructen voor gen correctie of gen additie. Deze methode biedt een geavanceerd instrument voor de biodelivery van therapeutische transgenen en kan worden toegepast in celculturen alsovel als in levende organismen.Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien vectoramplificatie en vectorzuivering enige ervaring vereisen. Men moet de juiste handeling toepassen tijdens de vectorzuivering. Controleer een aliquot van een tienvoudig verdund gelineariseerd high-capacity adenovirus genoom expressieplasmid via gelelektroforese.Een fragment van 9 kilobase voor de pAd-FTC plasmid-backbone en een tweede DNA-fragment van 28 tot 36 kilobase voor het high-capacity adenovirus-genoom, inclusief het gen van belang, zouden detecteerbaar moeten zijn. Transfect vervolgens een 60 milometer schaal met one one six cellen bij een confluentie van 50 tot 80% met 5 µg van het gelineariseerde high-capacity adenovirus-genoom, volgens standaardprocedures. Verwijder 16 tot 18 uur na transfectie voorzichtig het medium en voeg 3 mL vers medium toe.Infecteer vervolgens de cellen met het helpervirus AdNG 163R2, waarbij vijf transducerende eenheden per cel worden toegepast. Incubeer in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Schud de plaat elke 20 minuten gedurende het eerste uur van incubatie om het helpervirus gelijkmatig over alle cellen te verdelen.Oogst de cellen 48 uur na infectie door ze met het kweekmedium uit de kweekschaal te spoelen. Bewaar een aliquot van 0,5 milliliter van de passage nul-cellen voor het isoleren van genomisch DNA. Vries vervolgens een aliquot van 2,5 milliliter passage nul-cellen herhaaldelijk in en ontdooi deze door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof.Of plaats de cellen 3 tot 4 keer in de vriezer op -80 °C en breng ze vervolgens over naar een waterbad van 37 °C. Meng de 2,5 mL lysaat met één milliliter vers medium en voeg helpervirus toe in een hoeveelheid van twee transformerende eenheden per cel. Aspireer het medium uit een schaal van 60 mm met 116-cellen bij een confluentie van 90 tot 95% en voeg het virale mengsel toe aan de cellen.Incubeer de cellen gedurende 48 uur zoals voorheen. Oogst vervolgens de cellen en herhaal de vries/dooi- en infectieprocedures twee keer om lysaten van passage één en passage twee te verkrijgen. Nadat het lysaat van passage twee is verkregen, mengt u de 2,5 milliliters lysaat met 17,5 milliliters vers medium en voegt u twee transformerende eenheden helpervirus per cel toe.Aspireer het medium uit een 150 millimeter schaal met 80 tot 100% confluente 116-cellen en infecteer de cellen met het virale mengsel. Oogst 48 uur na infectie het lysaat van passage drie met de zojuist getoonde procedure. Voeg om met deze stap te beginnen 900 milliliters voorverwarmd medium toe aan een spinner-kweekfles van drie liter.Verwijder het medium uit ten minste 10 individuele schalen van 150 millimeter met ONE-6-cellen bij een confluentie van 90 tot 100%. Spoel de cellen vervolgens af met 10 milliliter vers, voorverwarmd medium. Pipetteer dit meerdere keren op en neer om een homogene celсусpensie te verkrijgen.Breng de cellen vervolgens direct over naar de spinner-fles. Incubeer de spinner-fles op een magnetische roerder in een weefselkweekincubator gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2. Stel de magnetische roerder in op 70 RPM om aanhechting van cellen aan de glazen oppervlakken te voorkomen.Voeg 24 uur na het opzetten van de spinner-kweekfles 500 milliliter vers medium toe. Herhaal deze stap na nog eens 24 uur. Voeg 72 uur na het opzetten van de kweek één liter vers medium toe aan de fles, wat resulteert in een totaalvolume van drie liter celсусpensie.Oogst na 24 uur de suspensiecellen door centrifugatie gedurende tien minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 150 milliliter medium door ongeveer acht tot tien keer op en neer te pipetteren. Breng de cellen over naar een bewaarfles van 250 milliliter voorzien van een steriele magnetische roerstaaf.Co-infect de cellen vervolgens met het lysaat van passage drie en twee transformerende eenheden helpervirus per cel. In dit geval is het totale aantal cellen ongeveer 9 × 10⁸ cellen, waardoor er 1,8 × 10⁹ transformerende eenheden worden toegevoegd. Roer het cel-virusmengsel gedurende twee uur bij 60 RPM op een magnetische roerder in de weefselkweekincubator.Zorg ervoor dat de bewaarflacon niet volledig is afgesloten om luchtcirculatie mogelijk te maken. Twee uur na infectie wordt het totale volume van het cel-virusmengsel teruggeplaatst in de spinner-kweekfles van drie liter. Voeg 1850 milliliters vers, voorverwarmd medium toe en incubeer dit gedurende 48 uur bij 70 RPM in de weefselkweekincubator.Overbreng na 48 uur de cel-virussuspensie naar centrifugebuizen van 500 milliliter. Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 890 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het medium en resuspendeer de gepelletteerde cellen in een totaal volume van 28 milliliter DPBS.Bewaar de cel-virusсусpensie bij -80 °C tot de viruszuivering wordt uitgevoerd. Om het viraal lysaat voor cesiumchloride-gradiëntzuivering voor te bereiden, wordt de cel-virusсусpensie vier keer bevroren en ontdooid. Centrifugeer het viraal lysaat vervolgens 8 minuten bij 500 ×g bij kamertemperatuur.Verzamel vervolgens de supernatant die het adenovirus met hoge capaciteit bevat. Pipetteer voorzichtig en langzaam cesiumchloride-oplossingen in de buisjes in de volgende volgorde: 0,5 milliliters van de 1,5 grams per cubic centimeter oplossing, drie milliliters van de 1,35 grams per cubic centimeter oplossing en 3,5 milliliters van de 1,25 grams per cubic centimeter oplossing. Breng ongeveer 4,5 milliliters van de geklaarde vector-supernatant aan bovenop de 1,25 grams per cubic centimeter laag.Centrifugeer de gradiënten in een ultracentrifuge met een swing-out rotor bij 12 degrees Celsius gedurende ten minste twee uur bij 226, 000 times g om de virale deeltjes met een hoog-capaciteits adenovirusegenoom te scheiden van lege deeltjes en celresten. Na de centrifugatie vormt zich bovenaan de buizen een diffuse band van celresten. Daaronder kunnen twee witte banden worden waargenomen.De bovenste band bevat lege deeltjes, terwijl de onderste band het adenovirus met hoge capaciteit is. Verwijder voorzichtig de lagen celresten en lege deeltjes. Neem vervolgens één milliliter van de onderste banden uit elke buis.Breng het virus over naar een steriele buis van 50 milliliter. Voeg tot 24 milliliter cesiumchloride-oplossing van 1,35 gram per kubieke centimeter toe aan de verzamelde virusdeeltjes en meng voorzichtig. Vul de centrifugebuizen tot de rand met de cesiumchloride-virusoplossing van 1,35 gram per kubieke centimeter.Centrifuge vervolgens gedurende de nacht bij 226.000 ×g bij 12 °C in een ultracentrifuge met een swing-out rotor, waarbij een langzame acceleratie en deceleratie wordt gebruikt. Verwijder de bovenste lagen van de top met een pipet. Verzamel daarna het hoog-capaciteits adenovirus dat aanwezig is in de prominente onderste band met een nieuwe pipetpunt.Dialyseer ten slotte de verzamelde viruspartikels voor bufferuitwisseling. Titreer vervolgens de uiteindelijke preparatie volgens de gedetailleerde instructies in het geschreven protocol. Dit histogram toont de absolute aantallen partikels voor één enkele vectorpreparatie, zoals bepaald met drie verschillende methoden: OD-titer gemeten via optische dichtheid, infectietiter en helperviruscontaminatie gemeten via qPCR.De verhouding tussen het totaal aantal infectieuze, high-capacity adenovirusdeeltjes en de niveaus van helperviruscontaminatie gemeten via qPCR wordt hier weergegeven. Als er een fluorescent markergen in uw vector aanwezig is, kan fluorescentiemicroscopie worden uitgevoerd om de pre-amplificatie van de vector te monitoren en de infectiviteit van de uiteindelijke vectorpreparatie te karakteriseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u gen-gedeleteerde, high-capacity adenovirussen produceert.In het bijzonder hoe u uw transgen kunt invoegen en hoe u de vectoren kunt amplificeren en zuiveren.

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

De afgelopen 15 jaar hebben honden-adenovirus type 2 (CAV2)-afgeleide vectoren hun efficiëntie bewezen om cellen in vitro en in vivo te transduceren en worden ze veel gebruikt voor vaccinatie en gentherapie. Hier beschrijven we een procedure om CAV2-vectoren te construeren, produceren en zuiveren, wat leidt tot virale suspensies met een hoog titer.

Productie en zuivering van niet-Replicatieve Canine adenovirus type 2 afgeleide vectoren

Hier presenteren we een protocol om een proof-of-principle bivalente adenovirus type 5 (Ad5) vector genereren Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 door gebruik te maken van de Antigen Capsid-Incorporation strategie. Deze vector werd aangetoond kwalitatieve conditie vertonen het vermogen om Ad5-positieve sera in vitro, en de antigeniteit en immunogeniteit ontsnappen naar de opgenomen antigenen.

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Hier beschrijven we een efficiënte en reproduceerbare strategie om te produceren, titer en kwaliteitscontrole batches van adeno-associated virus vectoren. Het stelt de gebruiker om de voorbereiding van een vector met hoge-titer (≥1 x 1013 vector genomen/mL) en een hoge zuiverheid, in vitro of in vivo gebruiksklaar.

Productie, zuivering en kwaliteitscontrole voor Adeno-associated Virus gebaseerde vectoren

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor grootschalige productie van onderzoekskwaliteit AAV-vectoren met behulp van adherente HEK 293-cellen gekweekt in celstapels en affiniteitschromatografiezuivering. Dit protocol levert consequent &gt;1 x 1013 vectorgenomen /ml op, wat vectorhoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor grote dierstudies.

Productie van Adeno-geassocieerde virusvectoren in celstapels voor preklinische studies in grote diermodellen

Hier wordt een op suspensie HEK293-cel gebaseerd AAV-productieprotocol gepresenteerd, wat resulteert in minder tijd en arbeid die nodig is voor vectorproductie met behulp van componenten die beschikbaar zijn voor onderzoeksdoeleinden van commerciële leveranciers.

Productie van Adeno-geassocieerde vectorbatches met hoog rendement met behulp van HEK293-suspensiecellen

Naarmate het gebied van gentherapie zich blijft ontwikkelen, is er een groeiende behoefte aan innovatieve methoden die deze uitdagingen kunnen aangaan. Hier wordt een unieke methode gepresenteerd, die het proces van het genereren van AAV-vectoren met een hoge opbrengst en hoge zuiverheid stroomlijnt met behulp van een celfabrieksplatform, dat voldoet aan de kwaliteitsnormen voor in vivo studies.

Een gestroomlijnde en gestandaardiseerde procedure voor het genereren van adeno-geassocieerde virusvectoren met een hoge titer en hoge kwaliteit met behulp van een Cell Factory-platform

Ondanks de uitstekende mechanische en biochemische eigenschappen van spin zijde, kan dit materiaal worden geoogst in grote hoeveelheden op conventionele wijze. Hier beschrijven we een efficiënte strategie om kunstmatige spinnenzijde vezels, die is een belangrijk proces voor de onderzoekers bestuderen van spinnenzijde productie en het gebruik ervan als next-generation biomaterialen te laten draaien.

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

All-solid-state ion-selectieve elektroden (Assises) opgebouwd uit een geleidend polymeer (CP) transducer bieden een aantal maanden van de functionele levensduur in vloeibare media. Hier beschrijven we de fabricage en kalibratieproces van Assisen in een lab-on-a-chip-formaat. De ASSISE wordt gedemonstreerd van een buurt-Nernstian hellingsprofiel te hebben gehandhaafd na langdurige opslag in complexe biologische media.

Multianalytmethoden Biochip (MAB) op basis van All-solid-state Ion-selectieve elektroden (ASSISE) voor Fysiologisch Onderzoek

Leer hoe je hoge capaciteit adenovirale vectoren produceert voor gentherapie met behulp van homing endonucleases en helper virussen. Deze methode levert tot 35 kb therapeutisch DNA af zonder virale coderende sequenties.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Meer video's verkennen