Elektrofysiologische Motor Unit Number Schatting (MUNE) Meten Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse achterbeen Spieren
25 september 2015
We presenteren verfijnde protocollen waarmee in vivo opvolging van motoreenheid functie in de muis. Technieken om verbinding spier actiepotentiaal (CMAP) en de motor-eenheid nummer schatting (MUNE) in de muis achterste ledematen spieren geïnnerveerd door de nervus vagus te meten beschreven.
Het algemene doel van het volgende experiment is om het aantal functionele motorische eenheden dat de tricep Siri-spieren in de muis in vivo innerveert, te schatten. Dit wordt bereikt door eerst de maximale cmap-amplitude van de tricep Siri-spieren te meten. Als tweede stap worden 10 submaximale incrementele reacties verkregen, die vervolgens worden gemiddeld om de gemiddelde actiepotentiaalamplitude van een enkele motorische eenheid te geven.
Vervolgens wordt de cmap-amplitude gedeeld door de gemiddelde SUP-amplitude. Om muni te berekenen, bieden de resultaten een in vivo schatting van het aantal functionele motorische eenheden dat de tricep sury hin-limb-spieren innerveert. De elektrofysiologische schattingstechniek voor het aantal motorische eenheden of muni kan worden gebruikt om preklinische therapieën voor aandoeningen of verwondingen van het perifere zenuwstelsel te onderzoeken.
We hadden het idee voor deze methode voor het eerst tijdens het onderzoek van het Delta zeven muismodel voor spinale musculaire atrofie. In dit model treedt het op met een ernstig fenotype, en daarom moesten we de neonatale muis onderzoeken. Als zodanig kan deze techniek zowel bij neonatale muizen als bij volwassen muizen worden gebruikt.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang om reproduceerbare incrementele reacties te verkrijgen om een nauwkeurige schatting van het aantal functionele motorische eenheden mogelijk te maken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden voor muni-metingen en muizen, zoals die welke afhankelijk zijn van incrementele krachtmetingen, is dat deze techniek minimaal invasief is en in de loop van de tijd kan worden herhaald. De mogelijkheid om klinisch relevante, betrouwbare en herhaalde beoordelingen van de integriteit van motorische eenheden uit te voeren in modellen van motorneuronziekte en perifere zenuwletsel verhoogt het translationele potentieel van deze modellen en vergroot ons begrip van de determinanten van het onderhoud en de gezondheid van motorische eenheden.
Om cmap- en muni-opnames uit te voeren, plaatst u de actieve ringelektrode op de huid, boven de proximale delen van de achterpoot, de gastro-spier van een verdoofde muis. Plaats vervolgens de referentie-ringelektrode op de huid over het middelste deel van de voet om de impedantie te verminderen, bedek de huid en resterend haar onder de ringelektroden met gel om de contact tussen de elektrode en de huid te maximaliseren. Vermijd overmatige toepassing van elektrode-gel, omdat dit een elektrische brug tussen de elektroden kan veroorzaken en nauwkeurige opname voor stimulatie van de nervus ischiadicus kan voorkomen.
Plaats een geïsoleerde 28-gauge monopolaire naald als kathode in de proximale achterpoot. Vermijd het inbrengen van de stimulerende elektroden te dicht bij de nervus ischiadicus of te diep, omdat dit de nervus ischiadicus of een andere structuur kan verwonden. Plaats een andere geïsoleerde 28-gauge monopolaire naald als anode, meer proximal in het onderhuidse weefsel boven het heiligbeen. Plaats vervolgens een wegwerpbare oppervlakte-elektrode als aardelektrode op de contralaterale achterpoot of staart.
Haal in deze procedure de nervus ischiadicus cmap-reacties door de nervus ischiadicus te stimuleren met vierkante golfpulsen van 0,1 milliseconde.Duur. Verkrijg cmap-reacties met toenemende stimulatie-intensiteit van één tot 10 milliamps totdat de amplitude van de reactie niet langer toeneemt. Om supermaximale stimulatie te garanderen, verhoog de stimulatie tot ongeveer 120%van de stimulusintensiteit die wordt gebruikt om een maximale respons en een aanvullende respons te verkrijgen.
Als er geen verdere toename in de cmap-grootte is, registreert u deze reactie als de maximale cmap. Noteer vervolgens de baseline tot piek en piek tot piek cmap-amplitudes in millivolt. Om de gemiddelde SUP-grootte te bepalen, gebruikt u de incrementele stimulatietechniek door de submaximale stimulatie te leveren terwijl de intensiteit in stappen van 0,03 milliamp wordt verhoogd om de minimale all-of-none-reacties te verkrijgen.
Als de initiële reactie niet optreedt met de stimulusintensiteit tussen 0,21 milliamps en 0,70 milliamps, pas dan de positie van de stimulerende kathode aan, dichter bij of verder weg van de positie van de nervus ischiadicus in de proximale dij. Haal de eerste incrementele reactie weergegeven hier. Zorg ervoor dat de latentie van de negatieve piek van de incrementele reactie ongeveer overeenkomt met de negatieve piek van de eerder verkregen maximale cmap-reactie.
Zorg ervoor dat de reactie stabiel is en zonder fractievorming door het observeren van drie consistente incrementele reacties in realtime en zorg ervoor dat de amplitude ten minste 25 microvolt is. Verkrijg vervolgens de tweede increment, zorg ervoor dat het increment stabiel is en zonder fractievorming door drie incrementele reacties in realtime te superponeren. Het tweede increment moet visueel duidelijk zijn en ten minste 25 microvolt groter zijn dan het vorige antwoord.
Verkrijg vervolgens het derde incrementele reactie en zorg ervoor dat het increment stabiel is en zonder fractievorming. Net als bij het tweede incrementele reactie dat eerder is getoond, moet het derde increment visueel duidelijk zijn en ten minste 25 microvolt in amplitude groter zijn dan het tweede reactie. Blijf incrementele reacties op deze manier verwerven totdat een totaal van 10 incrementele reacties zijn geregistreerd.
Beoordeel de incrementen om ervoor te zorgen dat de amplitude van elke individuele incrementele reactie kleiner is dan een derde van de som van alle 10 incrementen. Gebruik vervolgens de 10 incrementele waarden om de gemiddelde SUP-amplitude te geven. De berekende waarden voor de 10 incrementele reacties worden weergegeven.
De gemiddelde SUP-grootte wordt bepaald door de 10 incrementen te berekenen of door de laatste increment door 10 te delen. Bereken vervolgens muni door de maximale piek-tot-piek cmap-amplitude te delen door de gemiddelde SM-amplitude. Om een toepassing van deze technieken te illustreren, hebben we het effect van nervus ischiadicus-verplettering op de motorische eenheidfunctie onderzocht.
In deze figuur worden reacties bij een volwassen controlemuis en een volwassen muis 11 weken na nervus ischiadicus-verplettering vergeleken. Er zijn geen verschillen in gevoeligheid tussen opnames. Na nervus ischiadicus-verp
Overzicht
Dit artikel beschrijft elektrofysiologische technieken voor het registreren van samengestelde spieractiepotentialen (CMAP) en het schatten van het aantal motoreenheden (MUNE) in de achterpotspieren van muizen in vivo. De beschreven methoden maken minimaal invasieve, reproduceerbare beoordelingen van de integriteit van motoreenheden mogelijk, wat translationeel onderzoek faciliteert dat relevant is voor modellen van neuromusculaire ontwikkeling, degeneratie en letsel.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Elektrofysiologie
- Neurowetenschappen
- Spierfysiologie
Achtergrond
- CMAP en MUNE zijn gevestigde technieken voor het beoordelen van de functie van motorische eenheden in klinische en onderzoeksomgevingen.
- Deze methoden bieden inzicht in neuromusculaire gezondheid, ontwikkeling en degeneratie.
- Het translationele potentieel is groot, aangezien vergelijkbare technieken worden gebruikt bij menselijke diagnostiek.
- Betrouwbare, minimaal invasieve en reproduceerbare metingen zijn noodzakelijk voor preklinische studies.
Doel van de studie
- Het presenteren van een protocol voor het registreren van de CMAP en het schatten van de MUNE in de spieren van de achterpoten van muizen.
- Het mogelijk maken van functionele beoordeling van motorische eenheden in zowel neonatale als volwassen muizen.
- Het faciliteren van preklinische evaluatie van therapieën voor neuromusculaire aandoeningen en letsels.
Gebruikte methoden
- Plaatsing van oppervlakte-elektroden op het achterbeen en de voet van de muis.
- Stimulatie van de nervus ischiadicus met behulp van geïsoleerde monopolaire naalden en blokgolven.
- Acquisitie van maximale CMAP-responsen door de stimulusintensiteit te verhogen tot supramaximale niveaus.
- Incrementele stimulatie om 10 submaximale responsen te verkrijgen voor de berekening van het gemiddelde single motor unit potential (SMUP).
- Berekening van de MUNE door de maximale CMAP-amplitude te delen door de gemiddelde SMUP-amplitude.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een nauwkeurige schatting van functionele motorische eenheden in vivo mogelijk.
- De techniek is toepasbaar op zowel neonatale als volwassen muizen, inclusief ziektemodellen zoals spinale musculaire atrofie.
- Na een crush-letsel van de nervus ischiadicus is de MUNE significant verlaagd, terwijl de CMAP-amplitude mogelijk slechts een geringe afname vertoont als gevolg van collaterale sprouting.
- De methode is minimaal invasief, reproduceerbaar en kan in minder dan 20 minuten worden voltooid.
Conclusies
- Deze elektrofysiologische benadering maakt een betrouwbare, herhaalde beoordeling van de integriteit van motoreenheden bij muizen mogelijk.
- De techniek vergroot de translationele relevantie door menselijke klinische protocollen te spiegelen.
- Wijdverbreide adoptie kan de betrouwbaarheid tussen laboratoria verbeteren en een effectieve translatie van preklinische bevindingen naar klinische therapieën ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Elektrofysiologische schatting van het aantal motorische eenheden (MUNE) met gebruik van het samengestelde spieractiepotentieel (CMAP) in de achterpotspieren van muizen biedt een minimaal invasieve, kwantitatieve benadering voor het beoordelen van de neuromusculaire integriteit in vivo. Deze techniek maakt hoogwaardige, reproduceerbare metingen mogelijk die overeenstemmen met klinische protocollen bij mensen, wat de translationele continuïteit van preklinische modellen naar humane studies ondersteunt. De snelle, reproduceerbare resultaten faciliteren een robuuste targetvalidatie en mechanische risicoreductie in onderzoekslijnen voor neuromusculaire ziekten en letsels.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt functionele analyse van de integriteit van motorische eenheden in ziekterelevante muismodellen mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de input van motorneuronen naar spierstelsels te kwantificeren.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij de validatie van neuromusculaire targets en padanalyse.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, kwantitatieve elektrofysiologische resultaten voor de ontwikkeling van assays.
- Maakt reproduceerbare, minimaal invasieve metingen mogelijk die geschikt zijn voor longitudinale studies.
- Ondersteunt het screenen van therapeutische interventies gericht op het behoud of de regeneratie van motorische eenheden.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Lijnt preklinische muisgegevens uit met humane klinische elektrofysiologie voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Maakt continuïteit mogelijk in de modellering van neuromusculaire ziekten, van neonatale tot volwassen stadia.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor de voortgang van neuromusculaire therapie-pipelines.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor functionele beoordeling mogelijk wordt vanuit vroege targetvalidatie tot preklinische effectiviteitsstudies in neuromusculaire modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert de functie van motoreenheden om de integriteit van neuromusculaire banen en ziektemechanismen te verduidelijken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve CMAP- en MUNE-uitkomsten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytica: Biedt statistische metingen van het aantal motoreenheden en de amplitude van actiepotentialen voor het vergelijken van condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen preklinische muisgegevens en humane klinische eindpunten voor de afstemming van biomarkers.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een herbruikbaar, gestandaardiseerd platform voor neuromusculaire functionele beoordeling over verschillende studies heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit in neuromusculair onderzoek.
- Operationele waarde: Maakt snelle, gestandaardiseerde en reproduceerbare metingen mogelijk met minimale invasiviteit.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste functionele gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van neuromusculaire therapeutische kandidaten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologische registratie en neuromusculaire anatomie.
- Specialistische instrumentatie voor zenuwstimulatie en signaalacquisitie is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan zowel neonatale als volwassen muismodellen voor ontwikkelings- en ziektestudies.
- Zorgvuldige plaatsing van de elektroden en beheer van de impedantie zijn cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
