Generatie van Scalable, Metaalkleur High-breedteverhouding Nanocomposieten in een Biological Liquid Medium

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van lineaire micro- en nanocomposieten met een hoge aspectratio met behulp van koperbevattende startmaterialen en cysteïne. Dit wordt bereikt door eerst gesoniceerde koper-nanodeeltjes of kopersulfaat te combineren met cystine en water in een steriele, geventileerde kweekfles. De tweede stap van de synthese is het plaatsen van de gecombineerde componenten in de fles in een 5%CO2-incubator bij 37 °C gedurende ten minste zes uur.

Vervolgens wordt de kolf visueel geïnspecteerd en onderzocht met lichtmicroscopie. Om de mate van lineaire structuurvorming te bepalen, is de laatste stap het beëindigen van de synthese door de synthesekolf in een koelkast bij vier graden Celsius te plaatsen. Tot slot wordt digitale microscopie gebruikt om de gesynthetiseerde structuren te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektrodepositie, is dat deze synthese eenvoudig in vloeibare vorm kan worden opgeschaald en dat het proces onder fysiologische omstandigheden plaatsvindt.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van ziekten zoals kanker, omdat gesynthetiseerde structuren door cellen kunnen worden afgebroken, wat mogelijk een middel biedt voor de toediening van geneesmiddelen. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen we experimenten uitvoerden naar de potentiële toxiciteit van verschillende nanomaterialen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de laatste synthesestappen moeilijk aan te leren kunnen zijn.

Onjuiste procedures kunnen leiden tot geaggregeerde structuren of tot het volledig uitblijven van structuren. Om de zelfassemblagesynthese met koper-nanodeeltjes of CMP's uit te voeren, bereidt u een oplossing van koper-nanodeeltjes door ten minste twee milligram CMP's af te wegen. Draag tijdens deze stap wegwerphandschoenen om mogelijk contact van de CMP's met de huid te voorkomen.

Plaats de nanodeeltjes uit een lege steriele glazen vial van 16 milliliter in de vial die CMP's bevat. Voeg een geschikt volume steriel gedeïoniseerd water toe om een oplossing van twee milligram per milliliter te maken en vortex de oplossing 20 seconden om de nanodeeltjes te dispergeren voordat de synthese begint. Vul de vial niet voor meer dan de helft met water, omdat dit het proces zal remmen.

Bij het mengen door vortexen zullen CMP's snel naar de bodem van het vial zakken en zal de kleur donker lijken. Sonicate de CNP-oplossing gedurende 17 minuten bij kamertemperatuur om een maximale dispersie van CMP's te verkrijgen vóór aanvang van de synthese. Controleer periodiek of de CMP's door de sonicatie mengen; na een succesvolle sonicatie blijven CMP's gedurende ten minste 30 minuten in de oplossing gesuspendeerd en zal de oplossing donker van kleur zijn.

Weeg 7,29 milligram cystine af voor de synthese. Aangezien cystine niet direct oplosbaar is in water, brengt u de afgewogen cystine over van een antistatisch weegbakje naar het weegbakje met cysteine. Voeg een voldoende volume steriel een molaire natriumhydroxide toe, zodat de cystine volledig oplost om een oplossing van 72,9 milligram per milliliter te maken.

Los de cysteïne volledig op in 100 µL van één molair natriumhydroxide. Combineer vervolgens zeven µL van de opgeloste cysteïne met 6.643 µL steriel water in een steriele synthesefles. Plaats de fles met de gecombineerde oplossing gedurende 30 minuten bij 37 °C in de incubator, waarbij de dop van de fles geventileerd is om een effectieve menging te waarborgen.

Dit zal de cysteine-werkoplossing zijn. Resuspendeer de 2 mg/mL CNP-oplossing door 30 seconden te vortexen, aangezien de CMP's na de sonicatiestap voor een totaal synthesevolume van 7 mL zijn neergeslagen. Breng de cysteine-werkoplossing over naar een 25 cm² celkweekfles en voeg 350 µL van de geresuspendeerde CMP's toe.

Plaats de dop terug op de kolf en draai deze stevig vast. Nadat alle componenten voor de synthese zijn samengevoegd, wordt het mengsel in de kolf voorzichtig gemengd door deze vier tot vijf keer te zwenken. Plaats de kolf in de kooldioxide-incubator en ontlucht de kolf door de dop iets los te draaien, zodat er gasuitwisseling in en uit de kolf kan plaatsvinden.

Laat de synthese tijdens het proces ongeveer 24 uur in de incubator lopen. Tijdens de synthese kan men met behulp van microscopie en met het blote oog de vorming van sterk lineaire composieten waarnemen. Deze stap is cruciaal om te waarborgen dat er structuren worden gevormd en dat het zelfassemblageproces niet te lang doorgaat.

Beëindig de synthese van bio-composieten zodra er lineaire structuren in de kolf worden waargenomen door de synthesekolf stevig af te sluiten; label de kolf met de synthesecondities, inclusief de datum van de synthese en incubatie, en de tijd van de synthese vóór beëindiging. Bewaar het vat vervolgens in een koelkast, aangezien de gevormde structuren in deze vorm gedurende ten minste een jaar stabiel blijven. Om alternatievelijk de zelfassemblagesynthese uit te voeren met kopersulfaat, vervang dan de CMP's door kopersulfaatzout met behulp van een steriele techniek; los ten minste 2 mg kopersulfaat op in een voldoende volume steriel gedeïoniseerd water om een oplossing van 2 mg/mL te maken.

De kopersulfaatkristallen lossen bij deze concentratie gemakkelijk op, maar vortex de vial indien nodig en controleer visueel of alle kristallen zijn opgelost na de bereiding van het kopersulfaat. Voer de synthese uit zoals zojuist gedemonstreerd, maar vervang de CMP's door het kopersulfaat. Karakteriseer biocomposieten afgeleid van CMP's en van kopersulfaat via witlichtmicroscopie en elektronenmicroscopie voor de karakterisering en inspectie van de biocomposieten.

Voor parasynthese via witlichtmicroscopie wordt een omgekeerde microscoop gebruikt. Composieten zullen binnen enkele minuten na het plat leggen van de kolf naar het bodemoppervlak van de kolf zakken en kunnen vervolgens in focus worden gebracht. Gebruik de bright-field instelling van de microscoop om het contrast tussen bio-composieten en het vloeibare medium te maximaliseren; composieten afgeleid van CMP's en kopersulfaat zullen beide helder tot opaak van kleur zijn, maar ongereageerde CNP-aggregaten zullen een zeer donkere kleur hebben.

Gebruik geïnverteerde witlichtmicroscopie om de efficiëntie van de synthese voor een bepaald experiment te beoordelen. Documenteer bijvoorbeeld de aanwezigheid of afwezigheid van niet-reactieve CMP's in de synthese. Colven waarin bio-composieten zijn verkregen uit CNP's, afkomstig uit colven met verschillende parameters zoals incubatietijd ofsonicatieduur.

Individuele CMP's zijn te klein om met een lichtmicroscoop te observeren, maar niet-reactieve CNP-aggregaten zullen verschijnen als ronde, donkere objecten. Dit staat in contrast met de succesvol gesynthetiseerde CNP-composieten, die een hoge aspectratio, een lineaire vorm en uiteenlopende lengtes zullen hebben. Vermijd het te lang voortzetten van de synthese voor beëindiging, aangezien dit zal leiden tot sterk vertakte structuren van het type zee-egel, die na vorming moeilijk te dispergeren zijn in individuele structuren.

Gebruik daarnaast geïnverteerde witlichtmicroscopie om de efficiëntie van de synthese voor een gegeven experiment met kopersulfaat te beoordelen. Aangezien kopersulfaat bij gebruik van dit protocol volledig in oplossing gaat, zal de oplossing minder donker lijken dan de oplossing uit de synthese met CMP's.

Documenteer de grootte en omvang van kopersulfaatcomposieten door kolven met verschillende synthesecondities, zoals de synthesetijd vóór beëindiging, met elkaar te vergelijken. Om de biocomposieten eerst te concentreren via parasynthese, voegt u zes milliliter van ofwel CNP-afgeleide structuren of kopersulfaat-afgeleide structuren toe aan een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer 10 minuten bij 500 ×g en kamertemperatuur om een pellet te vormen voor kleinere volumes.

Voeg 500 µL van de structuren in oplossing toe aan buisjes van 0,6 mL, centrifugeer bij 2000 ×g en kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten om een pellet te vormen. Plaats de structuren in steriel gedeïoniseerd water en soniceer gedurende ten minste 10 minuten om ze opnieuw te suspenderen. Door dit proces in de loop van de tijd worden de structuren gefragmenteerd en neemt de gemiddelde lengte af.

Documenteer veranderingen in composietgroottes bij verschillende sonicatietijden met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop en digitale camera; our representative results laten zien dat bij de ontdekking van biocomposieten in celkweekmedia gedurende 82 uur aanvankelijk gelijkmatige dispersies van CMP's aggregeren tot microstructuren. In de loop van de tijd worden partikels geklaard en vormen zich grotere aggregaten. Uiteindelijk verschijnen er grotere aggregaten met lineaire structuren die ekineutige structuren vormen.

De transformatie van CMP's naar lineaire biocomposieten wordt getoond. CMP's werden gecombineerd met cysteïne en water, uitgaande van initiële homogene dispersies van CMP's. Aggregaten vormen microstructuren na drie uur; tussenstructuren vormen zich na zes uur.

Structuren met een hoge aspectratio worden gevormd voor elektronenmicroscopie. De karakterisering van de gesynthetiseerde biocomposieten wordt getoond; transmissie-elektronenmicroscopie laat het CNP-startmateriaal zien met de vorming van lineaire composieten, waarbij de start-CMP's rond zijn, zoals aangetoond door scanning-elektronenmicroscopie of SEM. Nano- en microkenmerken van composieten gevormd uit CMP's en cysteïne worden getoond via SEM.

Kenmerken van composieten gevormd uit kopersulfaat en cysteïne worden ook weergegeven via SEM Energy dispersive X-ray spectroscopie. De elementanalyse van startmaterialen en gesynthetiseerde lineaire componenten wordt getoond. Startende CMP's vertonen een prominente koperpiek zonder zwavel.

Biocomposieten van CMP's en cystine vertonen de verschijning van zwavel- en koolstofpieken als gevolg van het gebruik van cystine als uitgangspunt voor kopersulfaat. Het materiaal vertoont pieken voor koper en zwavel. Biocomposieten van kopersulfaat en cystine vertonen de verschijning van pieken voor koolstof als gevolg van het cystine. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in 12 tot 24 uur worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de voortgang van de synthese zowel visueel als via de microscoop te bewaken, zodat de gesynthetiseerde structuren niet te sterk aggregeren. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals fluorescente markering van de structuren, worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de vraag of de gesynthetiseerde structuren aan cellen binden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het voorbereiden van reagentia voor synthese, het correct combineren hiervan, het bewaken van het verloop van de synthese, en het concentreren en modificeren van structuren na de synthese.