Name: Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer ischemie-reperfusieschade modelleren in geïsoleerde rattenharten met Langendorff-perfusie. Deze methode meet ventriculaire drukgeneratie om myocardiale functie te evalueren en moleculaire gebeurtenissen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze publicatie werd gesteund door de Zuid-Carolina Clinical &amp; Translational Research (SCTR) Instituut, met een academische huis aan de Medische Universiteit van South Carolina, NIH / NCATS Grant Number UL1 TR000062. Verdere ondersteuning werd verstrekt door VA merit award BX002327-01 aan DRM. DJH werd ondersteund door NIH / NCATS Grant Number TL1 TR000061 en door NIH Grant Number T32 GM008716. SEA werd ondersteund door NIH Grant Number T32 HL07260.

Alle hier genoemde procedures zijn door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Medische Universiteit van South Carolina. De hier beschreven experimenten acute, niet-overlevingsexperimenten. Als zodanig is er geen gebruik van oogzalf en een steriele operatiekamer is niet vereist. Euthanasie wordt bereikt door verbloeding bij het oogsten van het hart. 1. Experimentele Voorbereiding <ol><li> Het opzetten van ofwel een constante druk of constante stroom Langendorff perfusie Apparatus 4. </li><li> Bereid 4 L gemodificeerde Krebs Henseleit buffer (in mM: 112 NaCl, 5 KCI, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-glucose, 0,2 octaanzuur, pH = 7,4). <ol><li> Maak 10x voorraad buffers. <ol><li> Los NaCl, KCl, MgSO4, en K 2 HPO 4 in 3 L ultrapuur water. </li><li> Los CaCl2 in 500 ml ultrapuur water with 40 ml 1 N HCl. </li><li> Voeg langzaam CaCl 2-oplossing aan de buffer in 1.2.1.1. Voeg genoeg ultrapuur water om een ​​totaal aan 4 L. Laat roeren gedurende 1 uur voordat het filteren door middel van een 0,8 um filter. Bewaar bij 4 ° C. </li><li> Los NaHCO3 in 4 L ultrapuur water. Laat roeren 1 uur vóór filtratie door 0,8 pm filter. Bewaren bij 4 ° C </li></ol></li><li> Combineer 400 ml 10 x Krebs Henseleit-buffer met 400 ml 10 x 3 NaHCO buffer. Voeg genoeg ultrapuur water om een ​​totaal aan 4 L. Los glucose en octaanzuur onder roeren. Filteren door middel van 0,8 um filter. </li></ol></li><li> Bereid je voor het hart. <ol><li> Voeg 2 L gefiltreerde buffer een 4 L geplaatste fles 38 in boven de plugkraan bevestigd aan de aorta canule. Dit zal een perfusiedruk van 70-80 mmHg leveren aan het hart, dat is het aanbevolen perfusiedruk 4. </li><li> Plaats gas dispersie bubbler in de buffer in de fles. </li><li> Laat de buffer door het systeem, en zorg ervoor dat eventuele luchtbellen te verwijderen vanuit de slang. </li><li> Schakel gas (95% O2 / 5% CO 2) ten minste 30 minuten voor het hart te worden gebracht. Gebruik een gasstroom sonde en bloed gas analyzer om zuurstofverzadiging te controleren. </li></ol></li><li> Bereid chirurgische voorraden en ballon. <ol><li> Voor het oogsten van hart, bereidt een paar 6,75 &quot;chirurgische schaar, een paar 4,5&quot; schaar, twee paar hemostats, twee sets caramalt forceps, twee spuiten met 27 G naalden, 2 stuks 0-guage zijden hechtdraad (ongeveer 15 cm lang), een 16/01 inch weerhaken canule en een tracheale canule. </li><li> Om tracheacanule monteren, lijm een ​​kort stuk van 1/16 inch diameter plastic slang aan op een Y-connector. </li><li> Om ballon apparaat monteren: bevestig een maagsonde naald om een ​​stuk van 1/16 inch buis, bevestig vervolgens slang aan druksensor huisvesting. Een kleine spuit bevestigd aan de andere kant van de druk transducer woningen zullen inflatie en deflatie van de ballon mogelijk te maken. <ol><li> Snijd een vierkant van plastic omslag en plaats punt van een maagsonde naald in het centrum. Wikkel de plastic omslag rond de maagsonde naald. </li><li> Vul ballon met zoutoplossing en afhechten met twee hechtingen. Blaas de ballon om ervoor te zorgen dat er geen lekken. Het volume zoutoplossing binnen de opgeblazen ballon moet ongeveer 200 pl, maar kan variëren afhankelijk van de grootte van de rat. </li><li> Alternatief, gebruik dan een latex vinger bed in plaats van de plastic verpakking. Plaats maagsonde naald binnen vinger kinderbed, vullen met zoutoplossing en afhechten. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Harvest het hart <ol><li> Weerhouden een Sprague Dawley rat met een decapicone of andere handmatige terughoudendheid apparaat. Weeg rat. </li><li> Dien ketamine / xylazine mengsel (0,85 mg / kg ketamine en 0,15 mg / kg xylazine) via intraperitoneale injectie rat verdoven. Deze dosis verdoving voldoende verdoving voor bieden20-40 min, maar de procedure moet zo snel mogelijk na de anesthesie bevestigd worden voltooid. </li><li> Bevestig juiste mate van anesthesie door testen teen knijpen reflex. </li><li> Tracheotomie <ol><li> Verwijder pelt van half voorpoot naar de basis van de kaak, met behulp van hemostats om pelt en scharen verheffen tot incisie te maken. Houd de pels verheven om het scheiden van de onderliggende spieren, waardoor een te snijden langs de pels en verwijderen. </li><li> Met behulp van hemostats, til klierweefsel en maak een horizontale incisie in de fascia inferieur aan het klierweefsel. Gebruik hemostats om incisie spreiden open, zorg niet te nick het jugularis aderen. </li><li> Met hemostats pinch spier bovenliggende trachea en met een schaar maken een dwarse incisie in de spier net onder de punt van de hemostats. Met hemostats, verspreid tissue elkaar om trachea onthullen. </li><li> Steek hemostats onder luchtpijp, clearing fascia terwijl vordert door voorzichtig vooruit en terugtrekken hemostats. </li><li>Zodra hemostats succes achter de luchtpijp worden geplaatst, knijp 0-0 zijden hechtdraad met hemostats en hemisect de luchtpijp met een kleine, scherpe schaar. </li><li> Plaats tracheacanule in de hemisected luchtpijp, hechtdraad trekt achter de luchtpijp, en bind de hechtdraad rond de gecanuleerde luchtpijp, het verankeren van de hechting aan de Y-lies van de canule met een chirurgen knoop. </li><li> Met behulp van een 27 G naald, injecteren 1.000 U / kg heparine in de halsader en laten circuleren gedurende 30 sec. </li></ol></li><li> Thoracotomie <ol><li> Verwijder pelt van half buik om mid-voorpoot regio door te knijpen met hemostats en snijden met een schaar. </li><li> Wordt ¾ inch dwarse incisie in de abdominale spierwand, net onder het diafragma. </li><li> Voeg een verticale insnijding van de buikwand en borstwand snijden langs het borstbeen. </li><li> Snijd het membraan terug bilateraal, vervolgens verspreid ribbenkast aan het hart, klem ribbenkast met hemostats om ervoor te zorgen het blijft verspreiden onthullen. </li&gt; <li> Met behulp van hemostats, verwijder voorzichtig thymus, het blootstellen van de opgaande aorta. </li><li> Plaag hemostats door de aorta lus, oprukkende en terugtrekken hemostats en voorzichtig verspreiden fascia aan puntje van hemostats door te laten. </li><li> Gebruik hemostats naar 0-0 zijden hechtdraad achter oplopende aorta trekken, das hechtdraad in een losse halve vierkante knoop. </li><li> Draai kraan om stroom van perfusie buffer, hemisect aorta beginnen en onmiddellijk steek de canule in de aorta lumen. Snel cinch een halve vierkante knoop en voltooien van de knoop, aanscherping grondig. </li><li> Gebruik een schaar om het hart te ontleden weg van de grote vaten, verwijder het hart van de borst en hechten aan perfusie kolom. </li><li> Trim overtollige longweefsel en laat het hart in evenwicht op de kolom voor ongeveer 15 minuten vóór het inbrengen van de ballon. Gebruik een normaal debiet van buffer door het hart van 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff perfusie en ischemie-reperfusie schade <ol><li> Plaatsing van LV pressure ballon <ol><li> Leeglopen ballon terwijl rollen in een kegelvorm en draai kraantje om ervoor te zorgen ballon blijft leeggelopen. </li><li> Accijnzen linker atrium met een kleine schaar om de toegang tot mitralisklep bloot. </li><li> Plaats de ballon door de linker atrium en mitralisklep in linker ventrikel. </li><li> Start druk monitoring software (LabChart Pro). </li><li> Blaas de ballon door het openen van kraan en voorzichtig toenemende hoeveelheid zout in de ballon tot diastolische druk lezen van micromanometer overschrijdt nul. </li><li> Om de lengte-spanning reactie te controleren, te blazen ballon langzaam naar een diastolische druk van 75 mmHg, langzaam leeglopen, herhaal een keer. </li><li> Stel diastolische druk tot 10 mmHg door regeling van de hoeveelheid zout in de ballon. Draai kraan om de ballon te verzegelen op dit niveau van de inflatie, en onderhouden gesloten druksysteem tussen LV ballon en druksensor. </li><li> Lagere hart in verwarmde kamer en deksel kamer met plastic. </li></ol></li><li> Advertentiebediening van ischemie-reperfusie schade <ol><li> Sluit de bodem van de verhitte kamer en laat ruimte te vullen met Effused buffer. </li><li> Als buffer hart is ondergedompeld, draaien kraantje om de stroom van buffer te stoppen in het hart, inducerende globale ischemie. Ischemie kan variëren afhankelijk van de doelen van het experiment. </li><li> Na 30 minuten van ischemie, draai kraan om stroom van buffer te herstellen in het hart, het initiëren van reperfusie. </li><li> Laat reperfusie van het hart voor 1 uur voordat beëindiging van het experiment. Gebruik variabele reperfusie tijden, afhankelijk van de doelen van het experiment. </li></ol></li><li> Beëindiging van Experiment en oogsten van Tissue <ol><li> Met zijpoort van plugkraan, dienen 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing bij 4 ° C in het hart met een snelheid van 10 ml / min aan het hart stil. </li><li> Verwijder het hart uit perfusie kolom, trim weg resterende atriale weefsel. </li><li> Plaats hart in een roestvrijstalen weefsel snijden matrix, bedek met Parafilm, en plaats bij -80 ° C gedurende 8 minuten, of totdat het hart heeft een marshmallow-achtige consistentie. </li><li> Verwijder blok van diepvries en steek scheermesjes in moten matrix aan het hart snijden in 2 mm plakjes. Tissue blokken kunnen ook worden gekocht met andere dan 2 mm slice maten. </li><li> Verwijder plakjes één op een tijd en vallen in vloeibare stikstof te knipperen te bevriezen voor biochemische studies. Bewaar de derde ventriculaire slice van de apex voor infarct kleuring. </li><li> Verwijder weefsel uit vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C tot gebruik in biochemische experimenten. </li></ol></li><li> Infarct kleuring <ol><li> Incubeer de derde ventrikel slice in 10 ml van 1% g / v trifenyltetrazoliumchloride (TTC) bij 37 ° C gedurende 15 min. Opmerking: Incubatie in TTC kan worden uitgevoerd gedurende 15 of 30 min zonder verandering in effectiviteit 15. </li><li> Overdracht weefsel slice van TTC tot 10% gebufferde formaline en laat een nacht incuberen bij kamertemperatuur. Voor een optimaal resultaat, horents moet worden genomen van formaline en afgebeeld binnen 24 uur 4. </li><li> Foto gekleurd slice en gebruik software zoals ImageJ om infarctgrootte te schatten volgens het protocol van de fabrikant. Neem foto zo spoedig mogelijk na fixatie, omdat de verf vervagen in de tijd. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bainey, K. R., Armstrong, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+perspectives+on+reperfusion+injury+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction.</a> American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).</li>
<li>Beyersdorf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+controlled+reperfusion+strategies+in+cardiac+surgery+to+minimize+ischaemia%2Freperfusion+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage.</a> Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchugen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archives%22%5BJournal%5D)">Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+myocardial+protection+from+ischemic+arrest+by+intracoronary+tetrodotoxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).</li>
<li>Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+ischemia%3A+A+delay+of+lethal+cell+injury+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.</a> Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).</li>
<li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+Validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).</li>
<li>Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+class+I+but+not+class+IIb+histone+deacetylases+exerts+cardiac+protection+from+ischemia+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).</li>
<li>Yellon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+heat+stress+in+the+ischaemic+and+reperfused+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).</li>
<li>Khaliulin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+preconditioning+of+isolated+rat+hearts--a+potent+cardioprotective+mechanism+involving+a+reduction+in+oxidative+stress+and+inhibition+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temperature preconditioning of isolated rat hearts--a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).</li>
<li>Molojavyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+and+its+isomers+on+ischemic+preconditioning+in+the+isolated+rat+heart%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart).</a> Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).</li>
<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+langendorff-perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hour+reperfusion+is+enough+to+assess+function+and+infarct+size+with+TTC+staining+in+langendorff+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).</li>
<li>Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isolated+perfused+heart%3A+Characteristics+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).</li>
<li>Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA,, Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+coronary+function+in+the+langendorff-perfused+mouse+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model.</a> Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).</li>
<li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+blunts+ischemia%2Freperfusion+injury+by+inducing+cardiomyocyte+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy.</a> Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De geïsoleerde geperfuseerde rattenhart succes kan worden gebruikt om het effect van farmacologische interventie preconditionering bij cardiale ischemie reperfusie schade 9 bestuderen. Er zijn echter enkele essentiële stappen van de procedure die moet worden genormaliseerd om reproduceerbare resultaten. Een temperatuur van 37,4 ° C binnen het systeem kritisch, omdat zelfs milde hypothermie en hyperthermie cardiale voorbehandeling 10,11 veroorzaken. De totale tijd die verstrijkt vanaf de injectie va...

Opheldering van de gebeurtenissen onderliggende cardiale respons op zowel ischemie en reperfusie zijn essentieel om de behandeling van myocardiaal infarct 1 en cardiale chirurgische procedures die vereisen aorta kruis-klemmen 2. Terwijl in vivo modellen van ischemie reperfusie schade toe nuttig eindpuntonderzoek, ze niet zo doeltreffend voor het bestuderen van de functionele effecten van ischemie reperfusie schade acuut in real time. Bovendien, in vivo reperfusie ischemie modellen produceren gewoonlijk aanzienlijke variabiliteit in infarctgrootte en directe afgifte van geneesmiddel aan het hart op het tijdstip van reperfusie is een uitdaging. Het gebruik van een Langendorff geïsoleerde hart voor het bestuderen ischemie reperfusie schade maakt real-time functionele beoordeling van farmacologische behandelingen, egale van geïnfarcteerd weefsel en onmiddellijke afgifte van geneesmiddel direct op het myocardium. Beschreven by Oscar Langendorff in 1895 3, het Langendorff geïsoleerde hart is een robuust model voor het bestuderen van ischemie-reperfusie schade, die is gebruikt bij ischemie-reperfusie onderzoek voor de laatste 40 jaar van 4,5. Hier zijn enkele wijzigingen aangebracht in het geïsoleerde hart optimaliseren voor functionele analyse. In situ canulatie van de aorta terwijl het hart klopt zodat het hart niet ervaren ischemische voorconditionering, die de resultaten van ischemie reperfusie proeven 6 zou wijzigen. Om dit te vergemakkelijken, wordt een tracheotomie uitgevoerd, waardoor ventilatie zorgen fysiologische stabiliteit van de rat tijdens de operatie. Het hart wordt vervolgens naar een glas watermantel spiraal kolom waardoor Krebs Henseleit buffer wordt geleverd via retrograde perfusie direct in de aorta bevestigd. Een zoutoplossing gevulde ballon in de linker ventrikel en verbonden met een drukopnemer, die zorgt voor real time meting van de druk vanuit het ventrikel eend berekening van meerdere functionele parameters. Aan het einde van het experiment wordt het hart gespoeld met koude zoutoplossing om krimp en flash ingevroren in vloeibare stikstof naar stroomafwaartse analyse van DNA, RNA en eiwit niveau mogelijk aanhouden. Aldus gewijzigd, de Langendorff doorbloed hart fungeert als een doeltreffend systeem voor de directe controle van de fysiologische effecten van farmacologische interventies op elk moment acuut tijdens de ischemie-reperfusie schade.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Octanoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medical Pressure Transducer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Peristaltic Pump</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Heated circulating water bath</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Flow Module</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modular Research Console</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline flow sensor</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Data Acquisition Device</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart data acquisition software</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in langendorff-geperfuseerde rat hearts

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

De biochemische gebeurtenissen rond ischemie-reperfusieletsel in de acute setting zijn van groot belang voor het bevorderen van nieuwe behandelingsopties voor myocardiale infarcten en hartcomplicaties van thoracale chirurgie. Het vermogen van bepaalde geneesmiddelen om het myocard voor te conditioneren tegen ischemie-reperfusieletsel heeft geleid tot meerdere klinische onderzoeken, met weinig succes. Het geïsoleerde hartmodel staat acute observatie van de functionele effecten van ischemie-reperfusieletsel in real-time toe, inclusief de effecten van verschillende farmacologische interventies die op elk tijdstip vóór of binnen de ischemie-reperfusieletselvenster worden toegediend. Aangezien korte periodes van ischemie het hart kunnen voorconditioneren tegen ischemische schade, wordt in situ aortacanuletie uitgevoerd om functionele beoordeling van niet-voorgeconditioneerd myocard mogelijk te maken. Een met fysiologische zout oplossing gevulde ballon wordt in het linker ventrikel geplaatst om real-time meting van drukgeneratie mogelijk te maken. Ischemische schade wordt gesimuleerd door het stopzetten van de perfusiebufferstroom, gevolgd door reperfusion. De duur van zowel ischemie als reperfusion kan worden gemoduleerd om biochemische gebeurtenissen op elk gewenst tijdstip te onderzoeken. Hoewel het geïsoleerde hartmodel van Langendorff geen rekening houdt met systemische gebeurtenissen die ischemie en reperfusion beïnvloeden, is het een uitstekend model voor de bestudering van acute functionele en biochemische gebeurtenissen binnen het venster van ischemie-reperfusieletsel, evenals het effect van farmacologische interventie op cardiale pre- en postconditionering. Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe in situ aortacanuletie en hartexcisie gevolgd door ischemie/reperfusieletsel in het Langendorff-model kunnen worden uitgevoerd.

De linker ventriculaire ballonapparaat maakt real-time monitoring van de druk die wordt ontwikkeld door de opdrachtgever linker ventrikel (figuur 1). Zoals eerder 7 beschreven, kan deze drukspoor worden gebruikt om veel van de parameters van ventriculaire functie te berekenen. Deze berekeningen kunnen worden gemaakt in de basislijnfase en de reperfusiefase, gemiddeld over meerdere sporen binnen elke groep en vergeleken om te bepalen of de farmacologische interventie resulteerde in cardiale vo...

Het geïsoleerde rattenhart is een duurzaam model voor ischemie-reperfusieletsel. Hier beschrijven we het proces van het oogsten van het kloppende hart van een rat via in situ aortacanuletie, Langendorff-perfusie van het hart, gesimuleerde ischemie-reperfusieletsel en infarctkleuring om de omvang van het ischemische letsel te bevestigen.

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Het algemene doel van deze procedure is om ischemie-reperfusieschade ex vivo te modelleren. Dit wordt bereikt door eerst een rat te anesthetiseren en de borstkas te openen om de aorta in C2 te canuleren, om zo ischemische preconditioning van het myocardium te voorkomen. Vervolgens wordt het hart verwijderd en aangesloten op een Alanor-perfusieapparaat.De laatste stap is het veroorzaken van een ischemie-reperfusieschade door de bufferstroom gedurende een bepaalde periode te stoppen en vervolgens de doorstroming te herstellen. Uiteindelijk wordt de ventriculaire drukgeneratie gebruikt om het effect van ischemie-reperfusieschade op de myocardfunctie aan te tonen. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen binnen het vakgebied van cardiale ischemie-reperfusie te beantwoorden, zoals welke moleculaire gebeurtenissen plaatsvinden tijdens de dynamische eerste uren van een ischemie-reperfusieschade.Begin met het berekenen van de benodigde hoeveelheid anestheticum nadat is bevestigd dat de rat is geanestheseerd. Start de tracheotomie door eerst de huid te openen vanaf het midden van de vier poten tot aan de basis van de kaak. Gebruik hemostaten om de huid opzij te houden, zodat de musculatuur bloot komt te liggen.Til vervolgens met hemostaten het klierweefsel op en maak met een schaar een inferieure incisie in de fascia. Spreid het blootgelegde weefsel met een ander paar hemostaten. Wees voorzichtig om de vena jugularis niet te beschadigen.Maak nu met een schaar en met behulp van hemostaten een transversale incisie in de spier boven de trachea. Gebruik vervolgens de hemostaten om de trachea bloot te leggen; positioneer de hemostaten zorgvuldig onder de trachea en verwijder tijdens dit proces de fascia. Knijp daarna met de hemostaten een 0,0 zijden hechtdraad achter de trachea.Gebruik vervolgens een schaar om te hemisecteren. Disseceer de trachea in de trachea. Voer de trachealkanule in en zet deze vast met de hechting, niet de hechting aan de Y-splitsing van de kanule.Injecteer nu met een spuit met een naald van 27 gauge 1000 units heparine per kilogram in de vena jugularis. Wacht 30 seconden voordat u doorgaat met de thoracotomie. Begin de thoracotomie door de huid tussen de middenbuik en het midden van de vierde rib te verwijderen met behulp van hemostaten en scharen.Maak vervolgens een incisie van driekwart inch in de buikwand, net onder het diafragma. Zet de incisie verticaal voort langs het sternum. Snijd daarna het diafragma bilateraal door om de ribbenkast bloot te leggen.Spreid nu de ribbenkast en klem deze opzij met hemostaten, zodat het hart zichtbaar wordt. De canulatie van de aorta is de meest kritieke stap van de procedure. De canule moet nauwkeurig worden ingebracht en snel worden vastgebonden om te voorkomen dat het hart een korte periode van ischemie ondergaat, wat de resultaten van de daaropvolgende ischemie-reperfusie zou beïnvloeden.Experiment met hemostaten. Verwijder voorzichtig de thymus om toegang te krijgen tot de aorta ascendens. Maneuver de hemostaten via de aortaloop door de fascia.Haal vervolgens een 00 zijden hechtdraad door de opening en maak een losse overhandse knoop. Start nu de stroom van de perfusiebuffer door de canule. Dissekeer vervolgens de aorta en voer de canule onmiddellijk in het lumen van de aorta in.Zet de canule vast door de knoop aan te trekken en deze af te maken tot een platte knoop. Dissekeer het hart met een schaar weg van de grote vaten. Verwijder het hart zodra het is vrijgemaakt en bevestig het aan de perfusiekolom.Snijd het overtollige longweefsel weg. Na ongeveer 15 minuten zal het hart geëquilibreerd zijn met de normale bufferstroom van tussen 10 en 20 milliliters per minuut. Zodra het hart is aangepast aan de kolom, kan de ballon worden ingebracht.Laat eerst de ballon leeglopen door deze in een kegelvorm op te rollen. Sluit de flow naar de ballon af zodra deze is geleegd. Access vervolgens de mitralisklep door het linkeratrium van het hart te excideren.Ten derde wordt de ballon via de mitralisklep in de linkerventrikel ingebracht. Begin nu met het monitoren van de systolische en diastolische druk met de lab chart pro-software en pomp de ballon op totdat de druk groter is dan nul. Controleer vervolgens de lengte-spanningsrespons.Blaas de ballon langzaam op totdat de druk 75 millimeter kwik bereikt. Laat hem vervolgens langzaam leeglopen en herhaal dit. Verlaag de druk terug naar 10 millimeter door de hoeveelheid zoutoplossing in de ballon aan te passen.Zet vervolgens de ballon vast bij deze druk en houd een gesloten druksysteem tussen de ballon en de transducer in stand. Laat tot slot het hart in een verwarmde kamer zakken en sluit deze af met vershoudfolie. De kamer moet worden afgesloten zodat deze wordt gevuld met een gefuseerde buffer.Zodra het hart is ondergedompeld, wordt de bufferstroom gestopt. Dit induceert een globale ischemie voor de benodigde duur. In dit geval 30 minuten.Stop na 30 minuten de ischemie door de bufferstroom naar het hart te herstellen en de kamer te ontkoppelen. Laat de reperfusie voortduren voor de gewenste periode en beëindig vervolgens het experiment, wat in dit geval na een uur reperfusie via de zijpoort van de stopkraan zal zijn. Dien gedurende één minuut 10 milliliters ijskoud PBS toe.Dit zal het hart stilleggen. Verwijder vervolgens het hart uit de kolom en trim alle resterende atriumweefsels weg. Dep het hart droog, plaats het in een snijmatrix en bedek het met perfil.Bevries het hart bij -80 °C gedurende acht minuten of totdat het de consistentie van een marshmallow heeft. Snijd het hart met scheermesjes in secties van 2 mm, of, indien gewenst, verwijder elke plak individueel en bevries deze in vloeibare stikstof. Voor biochemische studies moeten de bevroren plakken vervolgens worden bewaard bij -80 °C.Houd voor de infarctkleuring één plakje onbevroren in vloeibare stikstof. Met het beschreven protocol maakt het apparaat voor de linker ventrikelballon real-time monitoring mogelijk van de druk die wordt opgebouwd door de samentrekkende linker ventrikel.In een gezond hart varieert de ontwikkelde druk van 70 tot 130 millimeter kwik. Na een ischemisch insult is de ontwikkelde druk verlaagd en de einddiastolische druk verhoogd wanneer dieren worden toegediend. Indien een preconditioneringsmiddel, zoals de klasse 1 en 2 B HDAC-remmer saha, vóór de excisie wordt toegediend, kan de basisdruk variëren en worden de effecten van ischemie-reperfusieschade verminderd.Andere maatregelen voor de functie van de linker ventrikel kunnen ook direct worden verkregen of worden berekend uit de softwareoutput. Bij het onderzoeken van het beschadigde hart met TTC, dat metabool actief weefsel rood kleurt, bleek dat de harten die waren blootgesteld aan ischemie-reperfusieschade aanzienlijk minder metabool waren, wat erop wijst dat ze na deze procedure geïnfarceerd weefsel bevatten. Technieken zoals real-time kwantitatieve PCR, Western blotting en massaspectrometrie kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden zoals: wat zijn de biochemische en genetische effecten van ischemie, reperfusieschade en medicamenteuze behandeling op het hart?

induction-assessment-ischemia-reperfusion-injury-langendorff-perfused

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

De rat model van acuut myocard infarct (AMI) is nuttig om het gevolg van een MI op cardiale pathofysiologische en fysiologische functie te bestuderen.

Acuut myocardinfarct in ratten

We introduceren een chirurgische methode experimentele ischemie / reperfusie (I / R) letsel veroorzaken simuleren myocardiaal infarct (MI) in muismodellen die zorgt voor meer duidelijkheid in positionering van de ligatie van de LAD (LAD) om de reproduceerbaarheid te verhogen MI van experimenten in muizen.

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Coronaire stroomreserve (CFR), wordt gedefinieerd als de verhouding van de maximale coronaire bloedtoevoer naar de rust coronaire bloedstroom. We presenteren een protocol voor het evalueren van CFR bij ratten via echografie, die de mogelijkheid biedt om cardiovasculaire risicofactoren te voorspellen bij afwezigheid van obstructieve coronaire ziekte.

Evaluatie van coronaire stroom reserve na myocardiale ischemie reperfusie bij ratten

Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode die myocardinfarct of myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen kan induceren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader door middel van micromanipulatie.

Inductie van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen

Myocardiale ischemie-reperfusie model van rattenhart wordt verbeterd door gebruik te maken van een zelfgemaakt retractor, polyvinylchloride buis, en een unieke knoopmethode. Elektrocardiogram, trifenyltetrazoliumchloride en histologische kleuring en procentuele overlevingsanalyseresultaten toonden aan dat de verbeterde modelgroep hogere succes- en overlevingskansen heeft dan de reeds bestaande modelgroep.

Verbeterd knaagdiermodel van myocardiale ischemie en reperfusieletsel

De huidige studie demonstreert een zeer reproduceerbaar diermodel van acute regionale myocardischemie en reperfusieletsel bij konijnen met behulp van een linker mini-thoracotomie voor overlevingsgevallen of een middellijnsternotomie voor niet-overlevingsgevallen.

Model van ischemie en reperfusieletsel bij konijnen

Dit artikel toont de haalbaarheid aan van het bereiken van langere perfusietijden (4 uur) van muizenharttransplantaten zonder functieverlies door tijdens Langendorff een lagere (30-35 mmHg) dan fysiologische (60-80 mmHg) perfusiedruk te gebruiken.

Gemodificeerde Langendorff-perfusie voor verlengde perfusietijden van harttransplantaten van knaagdieren

Dit protocol beschrijft het proces van voorbereiding op reperfusie van occlusie van de middelste hersenslagader via de gemeenschappelijke halsslagader.

Een gemodificeerd modelpreparaat voor reperfusie van occlusie van de middelste cerebrale slagader

Een krachtige model voor de peri-operatieve en intensive care gerelateerde acute nierschade wordt gepresenteerd. Met behulp van het hele lichaam hypoperfusie veroorzaakt door een hartstilstand is het mogelijk om bijna een kopie van de histologische en functionele veranderingen van de klinische AKI.

Normotherme hartstilstand en cardiopulmonale reanimatie: een muismodel van ischemie-reperfusie schade

Leer ischemie-reperfusieschade modelleren in geïsoleerde rattenharten met Langendorff-perfusie. Deze methode meet ventriculaire drukgeneratie om myocardiale functie te evalueren en moleculaire gebeurtenissen te bestuderen.

Inductie en beoordeling van ischemie-reperfusie schade in Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Meer video's verkennen