Name: Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer de directe inductie van hemogeen endotheel en bloedcellen uit menselijke pluripotente stamcellen via overexpressie van transcriptiefactoren. Deze methode maakt efficiënte hematopoëtische differentiatie en in vitro observatie van endotheel-naar-hematopoëtische transitie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Matt Raymond voor redactionele assistentie. Dit werk werd ondersteund door fondsen van het National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 en P51 RR000167) en de Charlotte Geyer Foundation.

1. Virus Preparaten en transcriptie Factor Combinaties <ol><li> Bereid oplossingen pSIN-EF1α lentivirale expressieplasmide bevattende eiwit-coderende DNA voor ETV2, GATA1, GATA2, Tal1 en LMO2 (tabel 1). </li><li> Meet de concentratie en zuiverheid van plasmide-preparaten voor de productie van lentivirale opnemen UV absorptie met een spectrofotometer bij 230 nm, 260 nm en 280 nm. Opmerking: DNA-preparaten aantonen A260 / 280 en A260 / 230-waarden van meer dan 1,8 zijn over het algemeen beschouwd als een goede kwaliteit. Lagere A260 / 280 waarden eiwit verontreiniging wijzen, terwijl lagere A260 / 230 waarden duiden onzuiverheden met zout of een oplosmiddel, zoals fenol. Aanbevolen plasmideconcentratie is 1-3 ug / ul. </li><li> Opbrengst lentivirussen voor transductie beschreven in eerder gepubliceerde protocollen 11. Inductie van HE met pan-myeloïde potentieel vereist co-expressie van ETV2 en GATA1 of ETV2 en GATA2.Inductie van HE met erythro en megakaryocytische potentiële vereist GATA2 en Tal1. De toevoeging van LMO2 verbetert de opbrengst van erythro-megakaryocytische cellen van hPSCs in aanwezigheid van GATA2 en Tal1 10. </li></ol> 2. hPSCs Cultuur Protocol <ol><li> Groeien pluripotente stamcellen in strakke kolonies met scherpe randen om 70-80% confluentie voordat subcultuur. Mark en verwijder spontaan gedifferentieerde koloniën voordat passage cellen. </li><li> Verdun commerciële extracellulaire matrix gel (zie tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant en vacht 6-putjesplaten gedurende de nacht bij 4 ° C, of gedurende ten minste één uur bij 37 ° C vóór gebruik. Voordat passage cellen, zuigen de matrix, voeg 2 ml vers commerciële compleet kweekmedium (zie tabel 2) en houd platen bij 37 ° C, 5% CO2 totdat de cellen klaar voor het zaaien. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> AspiraTe midden van een confluente putje van een 6-wells plaat met hPSCs en voeg 1,5 ml voorverwarmde Dispase II-oplossing (2 mg / ml in DMEM / F12, gesteriliseerd door filtratie door 0,22 um filters). Incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 tot de randen van kolonies beginnen te tillen van het oppervlak. </li><li> Zuig Dispase II-oplossing en voorzichtig wassen koloniën tweemaal door het toevoegen en vervolgens aanzuigen 2 ml vers DMEM / F12 medium. Vervolgens werd met behulp van een 5 ml glazen serologische pipet, dissociëren hPSCs met 3 ml vers commerciële volledige cultuurmedium (zie tabel 2) van de celsuspensie te pipetteren en neer meerdere malen. </li><li> Voeg 0,5 ml celsuspensie aan elk putje van een 6-wells plaat met 1,5 ml commercieel compleet kweekmedium (zie tabel 2). Schud de plaat heen en weer en van rechts naar links een paar keer om een ​​uniforme cel verdeling te garanderen wanneer situeren de plaat in de incubator. Laat cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 18-24 uur. </li><li> De volgende dag verandering medium frisse commerciële compleet kweekmedium (zie tabel 2) en onderzoekt hPSCs morfologie. Succesvolle passage resultaten in kleine, goed bevestigd kolonies behoud HPSC morfologie. hPSCs moeten worden gevoed met 2,5-3 ml per putje freshmedium dagelijks gepasseerd en elke 4-5 dagen maximaal 70-80% confluentie. LET OP: Als hiPSCs op muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gehandhaafd, moeten ze worden overgedragen aan feeder-vrije omstandigheden en gepasseerd 2-3 keer voordat transductie efficiënte differentiatie te waarborgen. </li></ol></li></ol> 3. Inductie van Hematoendothelial Pprecursors uit hPSCs (dag 0, transductie van hPSCs) <ol><li> Ter voorbereiding reactiemedium combineren 1,3 ml commercieel volledig serumvrij medium (zie tabel 2), virus, polybreen en Y27632 ROCK inhibitor (tabel 1): voeg 1,3 pl 10 mM ROCK remmer 1,3 ml medium tot een uiteindelijke concen-tie van 10 uM, en polybreen een eindconcentratie 6 ug / ml. <ol><li> Voeg een geschikte hoeveelheid viraal concentraat (s) bij een uiteindelijke concentratie van 0,5-1,0 MOI (multipliciteit van infectie) van elk virus per cel. Blijf reactiemengsel op ijs of bij 4 ° C totdat het enkele celsuspensie bereid. OPMERKING: Dezelfde hoeveelheid MOI voor elk virus in de GATA1 / ETV2, GATA2 / Tal1 en GATA2 / Tal1 / LMO2 reactiemengsels optimaal is voor inductie van differentiatie. In ETV2 / GATA2 getransduceerde kweken verdubbelen traagheidsmoment voor GATA2 opzichte van ETV2, verbetert differentiatie. Daarom is voor deze culturen, verhouding 1: 2 voor MOI van ETV2 en 1 MOI van GATA2 aanbevolen (bijvoorbeeld als virale concentraat ongeveer 6,8 x 10 7 deeltjes / ml wordt geschat, voeg 10 ul ETV2 en 20 gl GATA2 virale concentraten 0,68 x 10 6 cellen per één ETV2 / GATA2 reactie in een 35 mm putje van een 6-wells plaat). </li></ol></li><li> Bereid hPSCs in een enkele cel suspension. <ol><li> Groeien hPSCs in feeder-vrije omstandigheden zoals beschreven in hoofdstuk 2. Op dag 4 na de laatste passage, observeren cel dichtheid en morfologie onder een omgekeerde microscoop. hPSCs moet groeien in strakke kolonies met scherpe randen zonder spontane differentiatie en bereiken ~ 60-70% confluentie op de dag van transductie. </li><li> Zuig medium, voeg 1,5-2 ml commercieel cel dissociatie reagens (tabel 1) per putje en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 5-7 min. </li><li> Verzamel cellen in gelijke volumina commerciële compleet medium (zie Tabel 2) met 10 pM ROCK inhibitor, tellen de cellen en levensvatbaarheid te bepalen. Pellet cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 5 minuten en vervolgens opnieuw in suspensie cellen commercieel compleet medium met 10 uM ROCK inhibitor een concentratie van 3,4-5 x 10 6 cellen per ml. OPMERKING: levensvatbaarheid van de cellen is cruciaal voor een succesvolle virale transductie en de daaropvolgende differentiatie.Normaal gesproken moet de levensvatbaarheid van de cel voordat transductie meer dan 90%. </li></ol></li><li> Voeg 200 ul van de celsuspensie gemaakt met 0,68-1 x10 6 cellen in 1,3 ml van het reactiemedium bereid in 3,1. </li><li> Zuig het matrix oplossing uit de nacht beklede 6-wells plaat bereid in 2,2. Breng het reactiemengsel één putje van een 6-wells plaat en gelijkmatig verdelen cellen. Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur. Na 24 uur ten minste 80% van de cellen aan de matrix worden verbonden. </li></ol> 4. Inductie van Hematoendothelial Voorlopers van hPSCs (Dag 1-7) <ol><li> 24 uur na transductie, verwijdert virus bevattend medium en was verbonden cellen met commerciële incomplete celkweekmedium (zie tabel 1) en voeg vervolgens 3 ml per putje van commerciële incomplete celkweekmedium bevattende hematopoiëtische cytokinen: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml bFGF 20 ng / ml (hierna 3F-medium). </li><li> Vervang totaal gemiddeld vers 3F-medium op dagen 2, 3 en 4 dagen om dode cellen en resten te verwijderen. Na 4 dagen bij drijvende hematopoëtische cellen ontstaan, vervang de helft van het 3F-medium elke andere dag terwijl de totale volume van 4 ml. OPMERKING: pSIN-EF1α lentiviraal expressieplasmiden nemen puromycineresistentiegen waardoor voor positieve selectie van getransduceerde cellen. De 1 ug / ml puromycine kan tot medium worden toegevoegd tijdens de eerste 1-2 dagen van differentiatie naar alle resterende ongedifferentieerde hPSCs elimineren. </li><li> Observeren celmorfologie op dag 4 onder een omgekeerde microscoop: strakke clusters van cellen met typische endotheelcellen morfologie beginnen te verschijnen (Figuren 2A, 3A). Ronde bloedcellen blijkt van dag 5 tot dag 7 van differentiatie, terwijl sommige gebieden hPSCs morfologie kunnen behouden. Analyseer HE en hematopoëtische differentiatie zoals hieronder beschreven. OPMERKING: Succesvolle hematoendothelial verschillendeiation resulteert in de productie van bloedcellen die als refractiele knoopcellen losjes bevestigd aan onderliggende platte endotheelcellen weergegeven. Deze cellen actief verspreiden vormen kleine aggregaten, en uiteindelijk los te maken en vlotter (Figuren 2A en 3A). Live bloedcellen kan visueel onderscheiden van de dode en stervende cellen op basis van hun vermogen om het licht te reflecteren en uit te breiden in de kweekomstandigheden. </li></ol> 5. Analyse van Hemogenic endotheel (HE) Fase van Differentiatie. <ol><li> Detecteren de vorming van HE tussen dag 3 en 4 van differentiatie door microscopische waarneming van endotheliale cellen met morfologie. Er zijn geen drijvende bloedcellen in de kweek in dit stadium van differentiatie. De aanwezigheid van HE kan worden bevestigd door immunofluorescente kleuring en flow cytometrische analyse met VE-cadherin, CD73, CD226 en CD43 antilichamen. <ol><li> Om HE vorming beoordelen door flowcytometrische analyse gebruik cellen op dag 3en dag 4 van het ene experiment. Verzamel cellen door incubatie van de kweken met commerciële cel dissociatie reagens (zie tabel 1) gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2 en vervolgens tot 1 x 10 5 cellen per kleurreactie (flowcytometrie beschreven kleuringsprocedure 12). OPMERKING: VE-cadherine + HE cellen expressie van de vroege hematopoietische marker CD226 te verwerven, maar missen de expressie van CD73 en CD43 6. Daarentegen vereist de niet-HE cellen brengen CD73 (Figuren 2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunofluorescentiekleuring voor HPSC afgeleide HE. <ol><li> Was de bijgevoegde monolaag van cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bevestig cellen in 4% paraformaldehyde 30-60 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen opnieuw met PBS en doorlaatbaar middels 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen in PBS 2-3 keer en vervolgens incuberen inblokkerende buffer bestaande uit PBS met 10% foetaal runderserum (FBS), gedurende 30 tot 120 min. </li><li> Bereid kleuroplossing, die zowel primaire antilichamen (1: 1000 verdunning) muizen anti-humaan CD43 en konijn anti-humaan VE-cadherine in PBS met 5% FBS, (tabel 1). </li><li> Zuig het blokkerende buffer uit de cellen en voeg 1 ml per putje van kleuring buffer met de toegevoegde primaire antilichamen; Incubeer 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen drie keer door toevoeging van 2 ml PBS met 5% FBS. </li><li> Bereid een tweede kleurbuffer gemaakt met secundaire antilichamen bij 1: 500 verdunning in PBS met 5% FBS: ezel anti-konijn geconjugeerd met groene fluorescente kleurstof, en anti-muis geconjugeerd met rode fluorescerende kleurstof (tabel 1). Voeg 1 ml per putje van secundaire kleuring buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Spoel driemaal met PBS zonder serum. Vlek cellen met 300 nm DAPI werkende oplossing in dH2 O 10-15 min. </li><li> Was de cellen met PBS twee keer en voeg 2-3 ml PBS in de goed met gekleurde cellen. Observeren fluorescentie met groen, rood en blauw microscoop filters. </li></ol></li></ol> 6. Analyse van Induced hematopoietische Voorlopers <ol><li> Handhaaf differentiatie kweken tot drijvende cellen aanzienlijk vergroten, tot 10-14 dagen, veranderen de helft van het 3F-medium, zoals beschreven in 3,1, elke twee dagen. </li><li> Distantiëren en verzamel differentiërende monolagen van cellen door het behandelen van cellen met een commerciële cel dissociatie reagens (zie tabel 1) gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Voer doorstroomcytometrie met behulp van anti-VE-cadherin, CD43 en CD45 antilichamen tegen hematopoiese in kweken 12 evalueren. Merk op dat een groot deel van de cellen tot 40% van ETV2 en GATA2 getransduceerde cellen, co-uitdrukt VE-cad en CD43. De volgende antilichamen kunnen worden gebruikt om specifieke cellijnen volgende e detecterenXpansion of differentiatie van geïnduceerde bloed voorlopers: CD235a (erythroïde cellen), CD41a (megakaryocytische), CD32 (alle soorten van myeloïde cellen), CD66b (neutrofielen) en CD163 (macrofagen). </li><li> Voer CFC-test met behulp van een commercieel clonogene medium (Tabel 1) volgens de instructies van de fabrikant. <ol><li> Overdracht 2/1 x 10 4 cellen in 3 ml commercieel klonogene medium (zie Tabel 3) om het aantal kolonievormende cellen en types hemopoëtische koloniën beoordelen. Optimale zaaidichtheid maakt de identificatie en isolatie van afzonderlijke kolonies die groeien afzonderlijk van elkaar en elkaar niet overlappen. Zaaidichtheid kan variëren tussen experimenten afhankelijk differentiatie efficiency, maar mag niet meer dan 1 x 10 4 cellen per 1 ml commercieel klonogene medium. </li><li> Mengen cellen in commerciële klonogene medium door zachte vortexen, en de overdracht van 3 ml suspensie twee 35 mm ultra-low attachment gerechtenvoor CFK-test, 1,5 ml suspensie voor elk gerecht. Verdeel medium gelijkmatig en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 14 dagen. Voorkomen dat het verstoren van de gerechten; observeren kolonie formatie op dag 7 en dag 10 van de test. </li><li> Identificeren en tel hematopoietische kolonies op basis van hun morfologie op dag 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium%3A+origins%2C+regulation%2C+and+implications+for+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li>
<li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Mol+%26+Dis%22%5BJournal%5D)">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li>
<li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li>
<li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imgn+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li>
</ol>

IS is een van de oprichters aandeelhouder en adviseur voor Cynata.

De hierboven beschreven werkwijze voor hematopoëtische differentiatie van hPSCs door overexpressie van TFs, is een snelle en doeltreffende benadering voor het genereren van HE en myeloïde en erytho-magakaryocytic progenitoren hESCs en iPSCs, waardoor de productie van maximaal 30 miljoen bloedcellen 1 miljoen pluripotente stamcellen 10. Deze methode tentoongesteld consistente differentiatie in meerdere hESC en iPSCs lijnen 10. Tijdens de differentiatie door ETV2 en GATA2, GATA1 factoren evenals GATA...

Het unieke vermogen van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) om te hernieuwen en te differentiëren tot cellen van de drie kiembladen, met inbegrip van bloed, maken ze een waardevol instrument voor de mechanistische studies van hematopoietische ontwikkeling modellering van bloedziekten, drug screening, toxiciteit studies, en de ontwikkeling van cellulaire therapieën. Omdat de vorming van bloed in het embryo opbrengsten van hemogenic endotheel (HE) door een endotheliale hematopoietische overgang 1,2, de opwekking van HE in culturen zou essentieel om de moleculaire mechanismen reguleren van de endotheelcellen aan hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie te bestuderen. Huidige werkwijzen voor het onderzoeken van HE zijn gebaseerd op de inductie van differentiatie in hematoendothelial aggregaten (EBS) met toevoeging van hematopoïetische cytokinen 5/3 en co-kweek van hPSCs met hematopoiese-ondersteunende stromale cellen 6,7 of tweedimensionale kweken met extracellulaire matrices en cytokines 8,9. Deze klassieke differentiatie methoden zijn gebaseerd op de introductie van externe signalen handelen op het celoppervlak en het initiëren van cascades van moleculaire mechanismen die uiteindelijk leiden tot de activering van transcriptie programma begeleiden hematoendothelial ontwikkeling. Derhalve de efficiëntie van hPSCs differentiaties in deze systemen is gebaseerd op een effectieve inductie van die signalen, signaaltransductie naar de kern en de resulterende activatie van specifieke transcriptiefactoren. Daarnaast is de studie van HE gebruikelijke differentiatie culturen vereist de extra stap van het isoleren van cellen met behulp HE celsortering. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor rechtstreekse inductie van HE en bloed door overexpressie van hematopoietische transcriptiefactoren. Deze werkwijze maakt een efficiënte inductie van HE in een schotel en directe observatie van de endotheliale hematopoietische overgang zonder de noodzaak van isolatie van HE via een omslachtige procedure celsortering. Vorming van HE en bloed van humane pluripotente stamcellen efficiënt worden geïnduceerd door overexpressie enkele transcriptiefactoren (TF). De optimale combinatie van TFs kan induceren robuuste pan-myeloïde hematopoiese van hPSCs omvat ETV2 en GATA1 of GATA2. In tegenstelling, een combinatie van GATA2 en Tal1 induceert erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmering hPSCs door de overexpressie van deze factoren onderscheidt hPSCs direct naar VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellen die geleidelijk verwerven van de hematopoietische fenotype bepaald door de expressie van de vroege hematopoietische marker CD43 7. Deze lentivirale methode voor de rechtstreekse programmering van humane pluripotente stamcellen methode is toepasbaar voor het genereren van HE en bloedcellen voor mechanistische studies, studies van endotheliale hematopoietische overgang en transcriptieregulatie van hematopoietische ontwikkeling en specificatie. Hoewel de cUIDIGE protocol beschrijft bloedproductie via constitutieve expressie van de transgenen, soortgelijke resultaten kunnen worden verkregen met gewijzigde mRNA 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabel 1. Inductie van hPSCs differentiatie met transcriptiefactoren en analyse van hemogene endotheel en bloedcellen.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Lentiviral Vector</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Cationic polymeer gebruikt om de efficiëntie van infectie te verhogen</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK-padweginhibitor, remt ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Celdissociatiereagens</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incomplete (groeifactor-vrij) kweekmedium&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; mTeSR1 Aangepaste formulering&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE!D12">Serumvrij mTeSR1-medium zonder bFGF en TGFb&nbsp;</a></td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Premiumkwaliteit</td></tr><tr><td>human TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Onderzoekskwaliteit</td></tr><tr><td>human FGF-basis</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Premiumkwaliteit</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endotheelmarker (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietisch (FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoietisch (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endotheelmarker (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietisch (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead-test (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Celfixatie&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Permeabilisatie&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Foetaal bovien serum</td></tr><tr><td>Muis anti-menselijk CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Pure, primaire antilichaam voor immunofluorescentie (IF)-kleuring</td></tr><tr><td>Konijn anti-menselijk VE-cadherine</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primair (IF)</td></tr><tr><td>Anti-konijn Alexa Fluor 488-geconjugeerd</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secundair (IF)</td></tr><tr><td>Anti-muis Alexa Fluor 594-geconjugeerd</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>Secundair (IF)</td></tr><tr><td>DAPI nucleïnezuurkleuring</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Live/Dead-test (IF)</td></tr><tr><td>Klonogene medium MethoCult H4435 Verrijkt</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-test</td></tr><tr><td>Wright-kleuringsoplossing</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Kleuren van cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabel 2. hPSCs-kweek.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menselijk pluripotent stamcellen (hPSCs)&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) menselijke embryonale stamcellen; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgeenvrije geïnduceerde pluripotente stamcellen</td><td>hPSCs zijn in staat tot zelfvernieuwing en kunnen differentiëren in cellen van drie kiembanden</td></tr><tr><td>Volledig serumvrij medium voor kweek van hPSCs&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; mTeSR1 media&nbsp;&nbsp;</td><td>Wi

direct inductie van hemogenic endotheel en bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Tijdens de ontwikkeling hematopoietische cellen ontstaan ​​uit een gespecialiseerde subset van endotheelcellen, hemogenic endotheel (HE). Modeling HE ontwikkeling in vitro is essentieel voor mechanistische studies van de endotheel-hematopoietische overgang en hematopoietische specificatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor de efficiënte inductie van HE uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) door de overexpressie van verschillende sets van transcriptiefactoren. De combinatie van ETV2 en GATA1 of GATA2 TF wordt gebruikt voor HE induceren met pan-myeloïde potentieel, terwijl een combinatie van GATA2 en Tal1 transcriptiefactoren maakt de productie van HE met erythroïde en megakaryocytische potentieel. De toevoeging van LMO2 om GATA2 en Tal1 combinatie aanzienlijk versnelt differentiatie en verhoogt erytroïde en megakaryocytische cellen productie. Deze werkwijze verschaft een efficiënte en snelle manier van HE-inductie uit hPSCs en maakt de waarneming van de endotheel-hematopoietic overgang in een cultuur schotel. Het protocol bevat procedures hPSCs transductie en post-transductie analyse van HE en bloed voorlopers.

Het schema van HE en bloed inductie van hPSCs door overexpressie van transcriptiefactoren wordt getoond in figuur 1. ETV2 met GATA1 of GATA2 combinatie induceert pan-myeloïde hematopoiese, terwijl een GATA2, Tal1 +/- LMO2 combinatie induceert hoofdzakelijk erythro-megakaryocyten hematopoiese. Beide TF combinaties direct geïnduceerde HE cellen die vervolgens omgezet in het bloed voorlopers met een duidelijke spectrum van hematopoietische differentiatie. Differentiatie van hPSCs van de pluripotente staat ...

Dit protocol beschrijft de efficiënte inductie van hemogene endotheel en multipotente hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen via de geforceerde expressie van transcriptiefactoren.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Het algemene doel van deze procedure is om erytroïde en myeloïde bloedcellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen door geforceerde expressie van transcriptiefactoren. Deze methode is toepasbaar voor de generatie van homogeen endotheel in bloedcellen voor studies naar de endotheel-naar-hepo-transitie en de transcriptionele regulatie van hepo-ontwikkeling en specificatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de methode een efficiënte en snelle manier biedt voor de inductie van homogeen endotheel uit humane pluripotente stamcellen, en het mogelijk maakt om de endotheliale hemmie-transitie in een kweekschaal te observeren.Dr. Bruske, een onderzoeksassistent in het laboratorium van Dr. Lin, zal de procedure demonstreren. Voordat u begint, moet u zes six-well platen coaten met een extracellulaire matrix, zoals Matrigel, door deze te verdunnen volgens de instructies van de fabrikant en in de wells te gieten. Incubeer de platen 30 tot 60 minuten bij 37 °C voor het transductiemedium. Bereid vervolgens lentivirale aliquots voor voor elke transductieset, zodanig dat de geschatte multiplicity of infection of MOI van virus tot cellen één virus per cel is, en bewaar deze bij 4 °C.Combine vervolgens complete serumvrije medium voor hbsc virussen poly brain tot een eindconcentratie van 6 µg/mL en rock-inhibitor Y 2 7 6 3 2 tot een eindconcentratie van 10 µM in een totaalvolume van 1,3 mL voor elke transductieset en zet de mengsels op ijs terwijl de cellen worden voorbereid. Begin met een gezonde batch pluripotente stamcellen bij 70% confluentie, ongeveer vier dagen na de laatste passage. Indien menselijke pluripotente stamcellen in maps werden onderhouden, moeten deze twee tot drie passages vóór de transductie-experimenten worden overgezet naar feeder-vrije condities en gezonde pluripotente stamcelculturen vertegenwoordigen.Vrij van spontane differentiatie. Aspireer het HPSC-medium en voeg per putje van een six-wellplaat twee milliliters zout-detachementoplossing toe, zoals Accutane, waarbij de plaat gedurende vijf tot zeven minuten wordt geïncubeerd bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens twee milliliters compleet medium met 10 µM ROCK-inhibitor toe en verzamel de gedetacheerde cellen.Nadat een homogene celsuspensie is voorbereid, wordt een klein aliquot genomen om de levensvatbare cellen te tellen via de trypaanblauw-uitsluitingsmethode. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 200 ×g gedurende vijf minuten en resuspendeer het pellet in compleet medium met 10 µM rock-inhibitor tot een uiteindelijke concentratie van 3,4 × 10⁶ levende cellen per ml. Voeg daarna 200 µl celsuspensie met 0,68 × 10⁶ cellen toe aan elk van de eerder bereide 1,3 ml transductiemedium.Haal de met matrix gecoate zeswellplaat uit de incubator bij 37 °C. Aspireer vervolgens de matrixoplossing, breng elk van de transductiemengsels over in een well en draai de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig over de well te verdelen. 24 uur.Visualiseer na transductie de putjes onder de microscoop om te controleren of ten minste 80% van de cellen is geadhereerd. Verwijder de virusoplossing en was de gehechte cellen met incompleet medium zonder groeifactoren. Voeg vervolgens drie milliliter van het medium gesuppleerd met cytokinen, aangeduid als three F.Medium, toe aan de cellen.Incubeer de cellen de volgende dag gedurende de nacht. Vervang het medium door vers Three F medium dat 1 µg/mL puromycine bevat, om de resterende niet-getransduceerde cellen te elimineren.Vervang dit medium elke 24 uur om de dode cellen te verwijderen. Na 48 uur behandeling wordt de toediening van puromycine gestaakt en wordt op dag vier enkel vers three F medium gebruikt. Observeer de cellen na transductie onder de microscoop op de aanwezigheid van geclusterde cellen met een endotheliale morfologie om de vorming van hemo-endotheliale cellen vast te stellen.Behandel de cellen tussen dag drie of vier vanuit de kweekschaal eerst met de celdetachementsolution. Verzamel de losgelaten cellen in compleet medium en centrifugeer deze, resuspendeer de cellen in max buffer bij kamertemperatuur en tel de cellen met een hemocytometer; incubeer vervolgens 1 × 10⁵ cellen per kleuringsreactie met geschikte antilichamen voor de detectie van v catrin, CD 2 26, CD 73 en CD 43 celoppervlaktemarkers.Het uitvoeren van flowcytometrie wordt beschreven in het tekstprotocol van dag vier. Ga na de transductie verder met de differentiatie van de cellen door elke 48 uur de helft van het medium in elke put te vervangen; tussen dag vijf en zeven zullen de bloedcellen los geaggregeerd verschijnen en zich boven de endotheliale cellaag bevinden. Houd de culturen tot 14 dagen in stand, waarbij de zwevende cellen aanzienlijk zouden moeten expanderen.Flowcytometrische analyse van ETV2, GATA1 en ETV2. GATA2-getransduceerde cellen vertonen de vorming van terin-positief hemo-endotheel, wat kan worden geïdentificeerd door de expressie van CD226 en het ontbreken van CD73-expressie op dag drie tot vier van de differentiatie flowcytometrische analyse van ETV2, GATA1 en ETV2. GATA2-getransduceerde cellen vertonen inductie van CD43-expresserende bloedcellen op dag zeven.Na transductie laat flowcytometrische analyse van gata 2 TAL 1 LMO 2 geïnduceerde cellen op dag 14 na transductie de vorming zien van bloedcellen die CD 235 A en CD 41 A tot expressie brengen. Gekleurde cytosinepreparaten van gata 2 TAL 1 LMO 2 geïnduceerde hematopoëtische cellen toonden erythroïde, macrofaag- en megakaryocytaire celmorfologieën in colony-forming cell assays. De transductie van menselijke pluripotente stamcellen kan in minder dan een uur worden voltooid tijdens het uitvoeren van de transductieprocedure. Het is belangrijk om de levensvatbaarheid van de stamcellen in overweging te nemen en daarom altijd een ROCK-inhibitor in het reactiemengsel op te nemen en een optimale hoeveelheid virus per cel te gebruiken gedurende de eerste drie dagen.Na de transductie kunnen methoden zoals immunovleking, colony-forming assays en flowcytometrie worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over de efficiëntie van de differentiatie en welk type hematopoëtische ziekte is geïnduceerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe menselijke pluripotente stamcellen moeten worden geprepareerd en geïnfecteerd, en wat u kunt verwachten van differentiërende culturen binnen de eerste zeven tot 10 dagen. Nadat transcriptiefactoren succesvol in menselijke pluripotente stamcellen zijn afgeleverd, verliezen de cellen hun pluripotentie en committeren ze zich geleidelijk aan een hematopoëtisch lot.Zo beschikken onderzoekers over een handig in vitro-model om de moleculaire mechanismen van de endotheliale naar hematopoëtische transitie te bestuderen. Vergeet niet dat het werken met lentivirus-bevattende reagentia uiterst gevaarlijk kan zijn; voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen en de juiste verwijdering van virusbevattende reagentia, moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

We stellen een protocol voor voor het herprogrammeren van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Door de getransduceerde bloedcellen te plaatsen op met matrix beklede platen met behulp van centrifugatie, worden iPSC's met succes geïnduceerd uit zwevende cellen. Deze techniek suggereert een eenvoudig en effectief herprogrammeringsprotocol voor cellen zoals PBMC's en CBMC's.

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Hier presenteren we menselijke pluripotente de protocollen van de cultuur van het cel van de stam (hPSC), gebruikt om te onderscheiden van hPSCs in CD34+ hematopoietische progenitorcellen. Deze methode maakt gebruik van fase-specifieke manipulatie van canonieke WNT signalering cellen uitsluitend naar ofwel het definitieve of primitieve hematopoietische programma opgeven.

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Hier presenteren we een protocol om precies te vormen hemogenic endoteel van menselijke pluripotente stamcellen in een feeder-en xeno-vrije voorwaarde. Deze methode zal hebben brede toepassingen in ziektemodel lering en screening voor therapeutische verbindingen.

Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

Dit protocol demonstreert de inductie van een hemogeen programma in menselijke dermale fibroblasten door afgedwongen expressie van de transcriptiefactoren GATA2, GFI1B en FOS om hematopoietische stam en voorlopercellen te genereren.

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft de generatie van zelforganiserende bloedvaten uit menselijke pluripotente en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze bloedvatnetwerken vertonen een uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk omgeven door pericyten, gladde spieractine en een continu keldermembraan.

Generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

Leer de directe inductie van hemogeen endotheel en bloedcellen uit menselijke pluripotente stamcellen via overexpressie van transcriptiefactoren. Deze methode maakt efficiënte hematopoëtische differentiatie en in vitro observatie van endotheel-naar-hematopoëtische transitie mogelijk.

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen