Name: Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer een kostenefficiënt expressiesysteem voor humane granzymen in HEK293T-cellen. Deze methode levert hoge opbrengsten van volledig geglycosyleerde, enzymatisch actieve proteasen op voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Novartis Foundation for Medical-Biological Research en van de Research Pool van de Universiteit van Fribourg (aan MW). We danken Li Zhao, Zhan Xu en Solange Kharoubi Hess voor technische ondersteuning, evenals Radu Aricescu en Yvonne Jones (Oxford University, UK) voor het verstrekken van het pHLsec-plasmide, en Thomas Schürpf (Harvard Medical School) voor nuttige discussies.

1. Productie van de expressieplasmide pHLsec-GZM <ol><li> Bereid totaal RNA van humane NK-cellen (primaire cellen bereid zoals in 26 of NK cellijn NK-92 expressie vijf menselijke Gzms) met geschikte RNA-isolatie methode en reverse transcriberen met behulp van een eerste streng cDNA synthetiseren kit, na manufacturer` s aanbevelingen. Amplify GZM cDNA met PCR en klonen in pHLsec zoals beschreven in 23 (vriendelijke gift van Radu Aricescu en Yvonne Jones, University of Oxford, UK) met behulp van AgeI en KpnI plaatsen (Figuur 1). OPMERKING: Gebruik de volgende primers aangegeven in tabel 1. </li><li> Bevestig juiste inserts door sequencing. Vouw de expressieplasmiden in DH5a-cellen en zuiveren met behulp van een endotoxine-vrij plasmide isolatiekit en de aanwijzingen van de fabrikant. </li><li> Resuspendeer de gezuiverde plasmiden in endotoxine vrij, steriel water bij een concentratie van 2 mg / ml en bewaar bij -20 ° C until gebruik. </li></ol> 2. Expressie van Gzms in HEK293T cellen <ol><li> Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid standaard kweekmedium. Om Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) met hoge glucose (25 mM), GlutaMax (4 mM), natriumpyruvaat (1 mM) voeg 10% van standaard foetaal kalfsserum (FCS), penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine ( 100 ug / ml). </li><li> Bereid transfectie medium. Om kweekmedium zonder penicilline-streptomycine voeg 25 ug / ml chloroquine (voeg pas op de dag van transfectie van 1000x voorraden in PBS, opgeslagen bij -20 ° C). </li><li> Bereid serumvrij kweekmedium: To serumvrij medium voor HEK293-cellen voegen glutamine (4 mM), penicilline (100 eenheden / ml), streptomycine (100 ug / ml) en 2,5 mg / l amfotericine B. </li><li> Bereid de in tabel 2 en filter beschreven met een 0,45 urn filter vóór gebruik oplossingen: </li></ol></li><li> Uitbreiding van HEK293T cellen <ol><li> Groeien HEK293T cellen in 20 ml culture medium met 150 x 25 mm weefselkweek gerechten. </li><li> Split cellen bij 80% confluentie (split-verhouding van 1: 4, meestal elke 3e dag). Cellen losjes hechten, kunnen ze mechanisch worden verwijderd zonder trypsine door rigoureus en neer te pipetteren. </li><li> Plate cellen de nacht vóór transfectie tot 60-70% confluentie te geven op de dag van transfectie (zaaidichtheid ~ 2 x 10 5 cellen / ml). Een gebruikelijke opstelling grootte uit 20-25 kweekschalen. </li></ol></li><li> Calcium-fosfaat- transfectie <ol><li> 1 uur voorafgaand aan transfectie, veranderen de standaard kweekmedium tot 20 ml transfectie medium. Tegen het einde van de 1 uur incubatiestap meng 400 ug plasmide DNA met 10,95 ml DDH 2 0 en 1,55 ml 2 M CaCl2 in 50 ml buizen (1 tube / 5 schotels). </li><li> 1-2 min voorafgaand aan de transfectie, voeg 12,5 ml HBS 2x met 12,5 ml van de DNA-Calcium-oplossing, mengen door omkeren van de buis en incubeer gedurende 30 seconden bij KT. </li><li> Th toevoegene mengsel bereid in 2.3.2 direct naar de cellen (5 ml per gerecht), drop-wise in het medium. Strooi gelijkmatig over het gehele oppervlak, draaien het medium een ​​licht oranje kleur. </li><li> Incubeer de kweekschalen gedurende 7-11 uur in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2 in bevochtigde lucht). Na de incubatie, een fijn neerslag zichtbaar. Verwijder het transfectie medium, roer voorzichtig met voorverwarmde PBS en voeg 20 ml serumvrij kweekmedium bereid in 2.1.3. Incubeer 72 uur in een weefselkweek incubator. </li><li> Analyseer de transfectie en expressie-efficiëntie worden uitgevoerd door een monster (~ 20 pi) van de cel supernatant op SDS-PAGE en kleuring met Coomassie Brilliant Blue een granzyme band zichtbaar. </li></ol></li><li> Zuivering van Gzms uit kweeksupernatant door Nickel-IMAC <ol><li> Na de incubatie, het decanteren celkweeksupernatanten in 250 ml buizen en helder door centrifugeren. Voer een eerste spin (400 x g, 10 min, 4 °C) dat het medium te verwijderen uit losgemaakte cellen. Breng het supernatant in 250 ml verse buizen en centrifugeren bij 4000 xg, 30 minuten bij 4 ° C om alle resterende celresten te verwijderen. </li><li> Voeg 5 ml van 5 M NaCl, 6,25 ml 2 M Tris-Base (pH 8) en 1 ml van 0,25 M NiSO 4 per 250 ml van de heldere supernatant. Filtreer de bovenstaande vloeistof met behulp van een 500 ml vacuüm filtereenheid (0,45 mm). </li><li> Equilibreer een kolom Nickel-IMAC met Zijn bindende buffer A (10 kolomvolumes, CV) met een geschikte FPLC systeem. </li><li> Breng de heldere supernatant aan de geëquilibreerde kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min bij 4 ° C. </li><li> Nadat de supernatant werd aangebracht, waskolom met His-bindingsbuffer totdat UV-absorptie basislijn is bereikt (gewoonlijk 10 CV). </li><li> Elueer Gzms met een lineaire 20 ml gradiënt (0-250 mM imidazool) bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min tijdens het verzamelen 2 ml-fracties. Analyseer de elutie fracties door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. </li></ol></li><li> Enterokinase (EK)behandeling en de definitieve sanering door kationuitwisselingschromatografie <ol><li> Pool GZM bevattende fracties in een dialyseren buis met ≤10 MWCO. Sla een monster bij -20 ° C als pre-EK control. </li><li> Voeg EK in 0,02 eenheden / 50 ml initiële supernatant direct naar gepoolde fractie in de dialysebuis en dialyze O / N (minimaal 16 uur) bij kamertemperatuur in EK-buffer (4 l, change buffer eenmaal). </li><li> De volgende dag, analyseren EK behandeld Gzms in vergelijking met de pre-EK control door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. </li><li> Als N-eindstandige verwerking voltooid is, verandert dialyse buffer S buffer A (4 L) en dialyze nog eens 4 uur bij KT. Filter dialysaat (0,45 pm). </li><li> Equilibreer een S-S-kolom met buffer A. Plaats het monster op de kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min bij 4 ° C. </li><li> Na het monster laden, wassen van de kolom met S buffer A tot UV-absorptie basislijn is bereikt (ongeveer 10 CV). Elueer het Gzms met een 30 ml lineair gradiënt (150 tot 1000 mM NaCl). GzmA eluiten bij ~ 650 mM NaCl, GzmB bij ~ 700 mM NaCl en GzmM bij ~ 750 mM NaCl. </li><li> Analyseer elutie fracties door SDS-PAGE en colorimetrische assays (zie hieronder). Pool fracties die Gzms en concentraat (ongeveer 30-voudig tot een concentratie van ongeveer 100 uM) in rotatie filters (15 ml, 10 MWCO). Aliquot de geconcentreerde GZM voorbereidingen en bewaar bij -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Testen GZM activiteit <ol><li> Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid colorimetrische assay buffer: 50 mM Tris-Base, pH 7. <ol><li> Voor het meten van GzmA toevoegen Na-CBZ-L-Lysine thiobenzyl ester (S-Bzl) (BLT) aan de assay buffer tot een eindconcentratie van 0,2 mM en 5,5&#39;-dithio-bis (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) tot een concentratie van 0,22 mM. Voor GzmB bevatten 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) en 0,22 mM DTNB. Voor GzmM bevatten 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Synthetische peptiden worden toegevoegd uit passende voorraad oplossingen (in DMSO, stored bij -20 ° C) aan de buffer vers voor de assay. </li></ol></li><li> Bereid splitsing assay buffer: 100 mM NaCl, 50 mM Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Colorimetrische assays <ol><li> Verdeel GZM kleine monsters (&lt;5 ui) van elutiefracties of geconcentreerde voorraden in de 96-well platbodem platen. Neem een ​​positieve controle (getest GZM preparaten of ongezuiverde NK cellysaten) en een negatieve controle (alleen buffer). </li><li> Voeg 100 ul assaybuffer aan elk putje (een multi-channel pipet). Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. Meet de OD bij 405 nm in een microplaat reader. </li></ol></li><li> Klievingsbepaling <ol><li> Voor klieving assays met gezuiverd substraten, co-incuberen van een eiwitsubstraat (natief of recombinant, 100-400 nM, enkele voorbeelden van doeltreffende GZM substraten worden in het resultaat en in de opmerking einde van deze paragraaf) met seriële verdunningen van GZM (beginnend bij 400 nM) in assaybuffer voor verschillende tijdstippen.Analyse door SDS-PAGE en Coomassie en zilverkleuring; of door Western blotting met specifieke antilichamen. </li><li> Voor klieving assays gebruikt cellysaten, schorsen 10 6 HeLa-cellen (of eventueel beschikbare tumorcellijn) in 1 ml bepalingsbuffer en lyseren bevroren in een ethanol / droog ijsbad en ontdooien bij 37 ° C drie keer. Verwijder celresten door centrifugatie (15.000 x g gedurende 10 min bij 4 ° C). </li><li> Co-incubeer de geklaard lysaat met Gzms bij verschillende concentraties en tijden als hierboven. Splitsing wordt gedetecteerd door immunoblotting gebruikmaking van geschikte antilichamen. LET OP: Een paar voorbeelden van bona fide substraten waarvoor commerciële antilichamen zijn beschikbaar: Bied (BH3-interactie domein dood agonist) en caspase 3 gesplitst door GzmB 27,28; meerdere heterogene nucleaire ribonucleoproteins (hnRNPA1, A2 en U) gesplitst door GzmA 29; cytomegalovirus fosfoproteïne 71 door GzmM 30. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chowdhury, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+by+a+thousand+cuts%3A+granzyme+pathways+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death.</a> Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).</li>
<li>Thiery, J., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin%3A+a+key+pore-forming+protein+for+immune+control+of+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer.</a> Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).</li>
<li>Krensky, A. M., Clayberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+clinical+relevance+of+granulysin%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Biology and clinical relevance of granulysin.</a> Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).</li>
<li>Bovenschen, N., Kummer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+granzymes+find+a+home%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Orphan granzymes find a home.</a> Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).</li>
<li>Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+A+activates+another+way+to+die%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Granzyme A activates another way to die.</a> Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).</li>
<li>Hiebert, P. R., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+in+injury%2C+inflammation%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Granzyme B in injury, inflammation, and repair.</a> Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).</li>
<li>Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+non-cytotoxic+roles+of+the+CTL%2FNK+protease+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme.</a> B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157, 1309-1323 (2014).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells+act+as+an+extravascular+cytotoxic+barrier+for+joint-invading+Lyme+Borrelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimalarial+activity+of+granzyme+B+and+its+targeted+delivery+by+a+granzyme+B-scFv+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2014).</li>
<li>Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cytotoxic+T+cell+and+NK+granules+and+purification+of+their+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).</li>
<li>Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of granzyme B.</a> Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).</li>
<li>Masson, D., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+serine+esterases+in+lytic+granules+of+cytolytic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes.</a> Cell. 49, 679-685 (1987).</li>
<li>Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+refolding%2C+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B.</a> Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+human+granzyme+B+from+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris.</a> Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+enzymatically+active+recombinant+granzyme+B+in+a+baculovirus+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system.</a> Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).</li>
<li>Stahnke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-H22%28scFv%29%2C+a+human+immunotoxin+targeting+CD64+in+acute+myeloid+leukemia+of+monocytic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes.</a> Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).</li>
<li>Gehrmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+expression+and+purification+system+for+the+production+of+enzymatic+and+biologically+active+human+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme.</a> B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).</li>
<li>Metkar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cell+granule-mediated+apoptosis%3A+perforin+delivers+granzyme+B-serglycin+complexes+into+target+cells+without+plasma+membrane+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation.</a> Immunity. 16, 417-428 (2002).</li>
<li>Motyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose+6-phosphate%2Finsulin-like+growth+factor+II+receptor+is+a+death+receptor+for+granzyme+B+during+cytotoxic+T+cell-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis.</a> Cell. 103, 491-500 (2000).</li>
<li>Pinkoski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+trafficking+of+granzyme+B+in+target+cells+during+granzyme+B-perforin-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis.</a> Blood. 92, 1044-1054 (1998).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Fukuchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+assays+of+nine+heterogeneous+promoters+in+neural+and+other+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).</li>
<li>Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptidyl+peptidase+I%3A+importance+of+progranzyme+activation+sequences%2C+other+dipeptide+sequences%2C+and+the+N-terminal+amino+group+of+synthetic+substrates+for+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity.</a> Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+purification%2C+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Barry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+short-circuits+the+need+for+caspase+8+activity+during+granule-mediated+cytotoxic+T-lymphocyte+killing+by+directly+cleaving+Bid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.</a> Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).</li>
<li>Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+apoptotic+protease+CPP32+by+cytotoxic+T-cell-derived+granzyme+B.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. </a> Nature. 377, 446-448 (1995).</li>
<li>Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+RNA+processing+during+immune-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).</li>
<li>Domselaar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncytotoxic+inhibition+of+cytomegalovirus+replication+through+NK+cell+protease+granzyme+M-mediated+cleavage+of+viral+phosphoprotein+71%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71.</a> J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+activates+clathrin-+and+dynamin-dependent+endocytosis%2C+which+is+required+for+plasma+membrane+repair+and+delivery+of+granzyme+B+for+granzyme-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis.</a> Blood. 115, 1582-1593 (2010).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
<li>Luthman, H., Magnusson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+polyoma+DNA+transfection+of+chloroquine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).</li>
<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De klassieke en uitgebreid bestudeerd rol van GzmA en GzmB is de inductie van apoptose in zoogdiercellen na cytosolische levering door de porie vormende eiwit PFN 1. Onlangs werd de cytotoxische spectrum van de Gzms aanzienlijk verbreed van zoogdiercellen tot 9,10 bacteriën, alsmede bepaalde parasieten 11. In de non-klassieke, extracellulaire functies van GzmA en GzmB en de biologische betekenis van de verschillende wees Gzms nog onduidelijk. Daarom is een robuuste tijd- en kosten-effici...

De Gzms zijn een familie van sterk homologe serineproteasen gelokaliseerd in gespecialiseerde lysosomen van CTL en NK-cellen 1. De cytotoxische korrels van deze killer cellen bevatten ook de membraan verstoren eiwitten PFN en GNLY die gelijktijdig worden uitgebracht met de Gzms bij herkenning van een doel cel bestemd is voor de eliminatie 2,3. Er zijn vijf Gzms bij mensen (GzmA, B, H, K en M) en 10 Gzms in muizen (GzmA - G, K, M en N). GzmA en GzmB zijn de meest voorkomende en uitgebreid bestudeerd bij mensen en muizen 1. Echter, meer recente studies begonnen de celdood routes en de additionele biologische effecten gemedieerd door de andere, zogenaamde orphan Gzms bij gezondheid en ziekte 4 onderzoeken. De best bekende functie van het Gzms, met name GzmA en GzmB, is de inductie van geprogrammeerde celdood in zoogdier- cellen, indien in de doelcellen uit met PFN 5,6. Echter, Meer recente studies toonden ook extracellulaire effecten van de Gzms met grote invloed op het immuunsysteem regelgeving en ontsteking, onafhankelijk van cytosolische levering door PFN 7,8. Het spectrum van cellen die efficiënt worden gedood na cytosolische vermelding van de Gzms is onlangs uitgebreid van zoogdiercellen bacteriën 9,10 en zelfs sommige parasieten 11. Deze recente ontdekkingen opende een geheel nieuw gebied voor GZM onderzoekers. Daarom zal een kostenefficiënte, high-yield zoogdierexpressiesysteem aanzienlijk verlichten de weg voor deze toekomstige studies. Natief humaan, muis en rat Gzms met succes gezuiverd uit de granule fractie van CTL en NK-cellen 12-14. In onze handen de opbrengst van dergelijke zuiveringstechnieken in het bereik van minder dan 0,1 mg / L cellen (ongepubliceerde waarneming en 12). Bovendien is de chromatografische resolutie van een enkele GZM zonder besmetting door other Gzms en / of eiwitten die aanwezig zijn in de granules betwist (ongepubliceerde gegevens en 12,14). Recombinant Gzms werden bacteriën 15, 16 gisten, insectencellen en 17 geproduceerd zelfs in zoogdiercellen zoals HEK 293 18,19. Alleen de zoogdierlijke expressiesystemen zijn voorzien van de mogelijkheid om recombinante enzymen met posttranslationele modificaties identiek met het natieve eiwit cytotoxisch. Posttranslationele modificaties zijn geïmpliceerd bij de specifieke opname door endocytose en de intracellulaire lokalisatie van het protease binnen doelcellen 20-22. Daarom, met behulp van pHLsec 23 (een soort geschenk van Radu Aricescu en Yvonne Jones, Universiteit van Oxford, UK) als het plasmide backbone voor GZM expressie, hebben we een eenvoudige, tijd- en kostenefficiënte systeem voor high-yield eiwitproductie in HEK293T cellen. pHLsec combineert CMV enhancer met een kip Β-actine-promoter; Samen vormen deze elementen demonstratiested de sterkste promoteractiviteit in verschillende cellijnen 24. Bovendien bevat het plasmide een konijn Β-globine intron, geoptimaliseerde Kozak en secretiesignalen, een Lys-6xHis-tag en een poly-A signaal. Inserts kunnen geschikt worden gekloneerd tussen de secretiesignaal en Lys-6xHis-tag (Figuur 1) voor een optimale expressie en secretie efficiëntie van proteïnen ontbreekt geschikte N-eindstandige domeinen. Voor de expressie van de Gzms vervingen we de endogene secretie signaalsequentie de secretie signaal van de vector, gevolgd door een enterokinase (EK) plaats (DDDDK), zodat EK behandeling geactiveerd het uitgescheiden Gzms (actieve Gzms beginnen met de N-eindstandige aminozuursequentie IIGG 25). Bovendien vóór deze werkwijze HEK293T cellen groeien snel in goedkope medium, bijvoorbeeld Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) en zijn zeer geschikt voor kosteneffectieve calcium fosfaat transfectie methode.

<table><tbody><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 Cells</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enterokinase from bovine intestine</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>recombinant, &ge;20&nbsp;units/mg protein</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Nickel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>S column</td></tr><tr><td>N-&alpha;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA substrate</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB substrate</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM substrate</td></tr><tr><td>5,5&prime;-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Ellman`s reagent</td></tr></tbody></table>

een hoge opbrengst en kosten-efficiënte expression system van human granzymen in zoogdiercellen

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Wanneer cytotoxische T-lymfocyten (CTL) of natuurlijke killer (NK) cellen tumorcellen of cellen herkennen die geïnfecteerd zijn met intracellulaire pathogenen, geven ze hun cytotoxische granulinehoudende inhoud vrij om de doelcellen en de intracellulaire pathogeen te elimineren. De dood van de gastheercellen en intracellulaire pathogenen wordt veroorzaakt door de granuline serine proteasen, granzymen (Gzms), die door het porievormende eiwit perforine (PFN) in het cytosol van de gastheercel worden afgeleverd en door het prokaryotische membraanverstorende eiwit granulysine (GNLY) in bacteriële pathogenen. Om de moleculaire mechanismen van doelceldood gemedieerd door de Gzms in experimentele in-vitro instellingen te onderzoeken, zijn eiwitexpressie- en zuiveringssystemen die hoge hoeveelheden actieve enzymen produceren, noodzakelijk. Zoogdierlijke gesecreteerde eiwitexpressiesystemen impliceren het potentieel om correct gevouwen, volledig functioneel eiwit te produceren dat posttranslationele modificatie heeft, zoals glycosylering. Daarom gebruikten we een kosteneffectieve calciumprecipitatiemethode voor transiënte transfectie van HEK293T-cellen met humane Gzms gecloneerd in het expressieplasmide pHLsec. Gzm-zuivering uit het kweeksupernatant werd bereikt door geïmmobiliseerde nikkelaffiniteitschromatografie met behulp van de C-terminale polyhistidintag die door de vector wordt geleverd. De invoeging van een enterokinaseplaats op het N-uiteinde van het eiwit maakte de generatie van actieve protease mogelijk, die uiteindelijk werd gezuiverd door middel van kationenuitwisselingschromatografie. Het systeem werd getest door hoge niveaus van cytotoxische humane Gzm A, B en M te produceren en zou in staat moeten zijn om vrijwel elk enzym in het menselijk lichaam in hoge opbrengsten te produceren.

In de volgende paragraaf zullen we een volledige documentatie van een GzmA voorbereiding presenteren aan de methode te verlichten. We hebben ook met succes gezuiverd GzmB en GzmM, produceren vergelijkbare resultaten met betrekking tot de zuivering efficiëntie en activiteit. Echter, van die latere preparaten wij maar toont enkele geselecteerde stukjes informatie. GzmB voorbereidingen van 293T cellen na het huidige protocol werden gebruikt in verschillende studies gepubliceerd, met de nadruk hun activiteiten in verschille...

We beschrijven hier een kosteneffectief granzyme-expressiesysteem met behulp van HEK293T-cellen dat hoge opbrengsten produceert van zuivere, volledig geglycoseerde en enzymatisch actieve protease.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van hoge opbrengsten van foliumgeglycosyleerde en enzymatisch actieve granzymen in menselijke embryonale nier 293 T-cellen. Dit wordt bereikt door eerst HEC 293 T-cellen uit te breiden in geschikte weefselkweekschalen. De gebruikelijke preparaatgrootte na de expansie bestaat uit 20 tot 25 kweekschalen.De tweede stap is het transiënt transfecteren van de uitgebreide cellen met een granzym-expressieplasmide met behulp van de efficiënte calciumfosfaatmethode. Vervolgens worden de celsupernatanten geoogst en de uitgescheiden granzymen gezuiverd via geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie. De laatste stappen zijn het activeren van de granzymen door enterkinasebehandeling en het verder zuiveren van de proteasen via kationenuitwisselingschromatografie.Uiteindelijk wordt de enzymatische activiteit getest met behulp van een snelle en betrouwbare cholemetrische assay, aangezien de beschikbaarheid van actieve protease in voldoende hoeveelheden een beperkende factor is in granzyme-onderzoek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied, zoals de karakterisering van nieuwe celdoodpaden in verschillen

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

We beschrijven een eenvoudige, kwantitatieve colorimetrische test die specifiek de proteolytische activiteit van humane, muis- of ratten-Granzyme B (GzmB) meet. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast voor het bepalen van de protease-activiteit van andere granuulserineproteasen door de hydrolyse van andere synthetische peptide-substraten met een geschikte herkenningssequentie.

Een colorimetrische test waarmee specifiek Granzyme B proteolytische activiteit: Hydrolyse van Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

In deze studie werd de expressie van een doelgerichte humane recombinante eiwit in verschillende productieplatforms vergeleken. We concentreerden ons op traditionele fermentor-gebaseerde culturen en op planten, waarbij we de instelling van elk systeem beschreven en, op basis van de gerapporteerde resultaten, de inherente grenzen en voordelen voor elk platform benadrukten.

Een vergelijkende analyse van recombinant eiwit expressie in verschillende biofactories: Bacteriën, Insect Cells and Plant Systems

Expressie van malaria eiwitten in cellen gebaseerde systemen blijft uitdagend. We tonen twee stappen en een stap IVT (in vitro translatie) celvrije expressiesystemen voor het uitdrukken van malaria rhoptry recombinante eiwitten uit HeLa-cellen. We maken gebruik van een Ni-gebaseerde hars affiniteit zuiveringssysteem de rhoptry eiwitten te zuiveren.

HeLa basis Cell vrije expressie systemen voor expressie van<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Eiwitten

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.

High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies

Leer een kostenefficiënt expressiesysteem voor humane granzymen in HEK293T-cellen. Deze methode levert hoge opbrengsten van volledig geglycosyleerde, enzymatisch actieve proteasen op voor immunologisch onderzoek.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

Meer video's verkennen