Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

Het algemene doel van deze procedure is om hoge opbrengsten van geglycoseerde en enzymatisch actieve granzymen te produceren in menselijke embryonale nier 2 93 T-cellen. Dit wordt bereikt door eerst HEC 2 93 T-cellen uit te breiden in geschikte weefselkweekschalen. De gebruikelijke bereidingsgrootte na de uitbreiding bestaat uit 20 tot 25 kweekschalen.

De tweede stap is om de uitgebreide cellen tijdelijk te transfecteren met een granzyme-expressieplasmide met behulp van de efficiënte calciumfosfaatmethode. Vervolgens worden de celsupernatanten geoogst en worden de uitgescheiden grand-enzymen gezuiverd door geïmmobiliseerde metaalionenaffiniteitschromatografie. De laatste stappen zijn het activeren van de grand-enzymen door enter kinase-behandeling en het verder zuiveren van de proteasen via kationenuitwisselingschromatografie.

Uiteindelijk wordt enzymatische activiteit getest met behulp van een snelle en betrouwbare chole metrische assay. Aangezien de beschikbaarheid van actieve protease in voldoende hoeveelheden een beperkende factor is in granzyme-onderzoek, kan deze methode helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld, zoals de karakterisering van nieuwe celdoodsroutes in verschillende organismen of de identificatie van nieuwe protease-substraten in hele proteoombenaderingen Om grand-enzymen te expresseren. Eerst kweekt u HEC 2 93 T-cellen in 20 milliliter kweekmedium, gebruik 150 bij 25 millimeter weefselkweekschalen, verdeel de cellen bij 80% co-fluency, cellen hechten losjes, maar kunnen mechanisch worden losgemaakt zonder trypsine door krachtig omhoog en omlaag te pipetteren in de plaat.

De cellen de nacht voor transfectie om 60 tot 70% co-fluency te geven op de dag van transfectie. Een gebruikelijke bereidingsgrootte bestaat uit 20 tot 25 kweekschalen. Een uur voorafgaand aan transfectie, veranderde het standaard kweekmedium in 20 milliliter transfectiemedium. Tegen het einde van de stap van een uur incubatie, mengde 400 microgram plasma-DNA met 10,95 milliliter dubbel gedestilleerd water en 1,55 milliliter twee molaire calciumchloride in 50 milliliter buizen een tot twee minuten voorafgaand aan de transfectie.

Bij 12,5 milliliter twee keer heups gebufferd zoutjes op 12,5 milliliter van de DNA-calciumoplossing vermengd door de buizen om te draaien voordat ze gedurende 30 seconden worden geïncubeerd. Bij kamertemperatuur, voeg dit mengsel druppelsgewijs rechtstreeks toe aan de cellen bij vijf milliliter per schaal, gelijkmatig over het hele gebied strooien, waarbij het medium een licht oranje kleur krijgt. Incubeer de kweekschalen gedurende zeven tot 11 uur in een weefselkweekincubator.

Na de incubatie is een fijne neerslag zichtbaar. Verwijder het transfectiemedium. Spoel voorzichtig met voorverwarmd PBS en voeg 20 milliliter serumvrij kweekmedium toe voordat u 72 uur in een weefselkweekincubator incubeert, analyseer de transfectie- en expressie-efficiëntie door een monster van het celsupernatan op SDS-pagina te draaien en te kleuren met kumasi.

Brillante blauw. Om een granzyme-band te visualiseren. Na de incubatie, decanteer de celcultuursupernatan in 250 milliliter buizen en maak helder door centrifugeren.

Voer een eerste spin uit die het medium van de losgemaakte cellen zal verwijderen. Breng het supernatan over in verse 250 milliliter buizen en draai 30 minuten bij 4.000 Gs bij vier graden Celsius om eventueel resterend celdebris te verwijderen. Voeg vervolgens vijf milliliter natriumchloride, 6,25 milliliter tris-base en één milliliter nikkelsulfaat toe plus 250 milliliter helder supernatan.

Filter het supernatan met behulp van een 500 milliliter vacuümfiltereenheid. Equilibreer een nikkelgeïmmobiliseerde metaalionenaffiniteitschromatografiekolom met zijn bindende buffer. Gebruik een geschikt FPLC-systeem.

Breng vervolgens het heldere supernatan aan op de geëquilibreerde kolom met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut bij vier graden Celsius. Nadat het supernatan is aangebracht, spoel de kolom met zijn bindende buffer tot de ultraviolette of UV-absorberende basislijn is bereikt. Elueer de granzymen met een lineair 20 milliliter ILE-gradient met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut terwijl twee milliliterfracties worden verzameld.

Analyseer de elucian-fracties door SDS-pagina en kumasi-kleuring. Trek de grand-zyme bevattende fracties in een dazingbuis. Bewaar een klein monster bij minuus 20 graden Celsius als de pre-entero kinase controle.

Voeg entero kinase toe bij 0,02 eenheden per 50 milliliter van het oorspronkelijke supernatan direct toe aan de gepoolde fractie in de dialysebuis en dialyseer een nacht bij kamertemperatuur in entero-kinasebuffer. De volgende dag analyseer de kinasebehandelde grand in vergelijking met de pre-enterokinasecontrole door SDS-pagina en kumasi blauwe kleuring. Wanneer eindterminalverwerking voltooid is.

Verander de dialysebuffer naar S-buffer A en dialyseer nog eens vier uur bij kamertemperatuur voordat u de DIALATE acht filtert. Equilibreer vervolgens een S-kolom met S-buffer A. Laad het monster op de kolom met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut bij vier graden Celsius na het laden van het monster.

Was de kolom met S-buffer A tot de UV-absorberende basislijn is bereikt. Elueer de granzymen met een 30 milliliter lineaire natriumchloridegradiënt, granzyme A elueert bij ongeveer 650 millimolair natriumchloride, granzyme B bij ongeveer 700 millimolair natriumchloride en granzyme M bij ongeveer 750 millimolair natriumchloride. Pool de fracties die granzymen bevatten en concentreer tot ongeveer 100 micromolair in spinfilters, verdeel de geconcentreerde granzymepreparaten in aliquoten en bewaar bij minuus 80 graden Celsius.

Analyseer vervolgens de elucian-fracties door SDS-pagina en chole metrische assays om de chole metrische assays uit te voeren, verdeel kleine granzymemonsters van elucian-fracties of geconcentreerde voorraden in 96. Wel flatbodemplaten. Voeg 100 microliter assaybuffer toe aan elk.

Wel incube