Correlatieve Confocal en 3D Electron Microscopy van een specifiek Sensory Cell

Het algemene doel van deze procedure is om de volledige ultrastructuur van een specifieke darmgevoelscel te documenteren, verspreid tussen andere epitheelcellen in natuurlijk darmsweefsel. Dit wordt bereikt door eerst een weefselsegment van 300 bij 50 micron uit de darm te verkrijgen. Vervolgens worden optische Z-stacks van het segment verkregen met behulp van confocale microscopie.

Vervolgens dienen de confocale gegevens als gids om het weefsel te verwerken en te beeldvormen met behulp van seriële blokface-scanning elektronenmicroscopie of SBEM. Ten slotte wordt de SBEM-gegevens gesegmenteerd om de ultrastructuur van een specifieke darmgevoelscel in 3D weer te geven. Uiteindelijk correlatieve confocale microscopie en seriële blokface-scanning.

Elektronenmicroscopie worden gebruikt om een specifieke cel in zijn natuurlijke weefsel te tonen en zijn ultrastructuur in 3D te onthullen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vakgebied van de celbiologie, zoals de specifieke cel-op-cel interacties die anders niet op niveau van lichtmicroscopie zouden kunnen worden gevisualiseerd. Door deze methode te gebruiken, hebben we eerder een verborgen fysisch-chemische relatie tussen sensorische enter endocrin cellen en enter ggl gerapporteerd.

Na het isoleren van de muizencolon, volgens het tekstprotocol, plaats hem in mooi koude PBS en snij het weefsel open langs de mesentery terwijl het ondergedompeld is, breng het weefsel over in een paar druppels PBS op een vel dental wax en gebruik een scalpel om ongeveer zes kleine weefselsegmenten uit de distale colon te snijden. Na het bereiden van 5% lage smeltaros in PBS, gebruik het om de weefselsegmenten in een kleine plastic container te bedden, zoals de standaard grootte weefsel tech cryo mal, monteer de ingebedde secties op een vibrerende mes microtoom en gebruik ijskoud PBS om de bufferbak te vullen. Snijd vervolgens weefselstroken van 300 micron bij 0,8 amplitude en 0,04 millimeter per seconde snelheid.

Lees de 300 micron weefselstroken in aros en monteer ze loodrecht op het mes op een microtoom. Snijd vervolgens weefselstroken met een dikte van 50 micron met verwijzing naar het tekstprotocol voor details voordat de blokken in PBS bij vier graden Celsius worden opgeslagen. Na het beeldvormen van weefselblokken met behulp van confocale microscopie volgens het tekstprotocol om weefselsecties in hars te infiltreren en in te bedden.

Verwijder het weefsel uit PBS en gebruik 0,1 molaire co coate buffer om het drie keer vijf minuten lang te spoelen. Zodra de hars is voorbereid en de weefsels zijn gekleurd voor elektronenmicroscopie, volgens het tekstprotocol, gebruik het om weefselblokken tussen glazen dia's te sandwichen die zijn uitgehard met een vloeibaar losmiddel na inbedding van de weefselblokken, vlak de blokken aan voor een extra 48 uur bij 60 graden Celsius. Trek vervolgens de dia's uit elkaar om de blokken onder een dissectiescope vrij te maken, pas de oriëntatie van de in hars ingebedde weefselblokken aan met die van de confocale micrografieën.

Om het identificeren van de regio's die de cellen van belang bevatten te vergemakkelijken, monteer de platte blok op een pin met een geleidend epoxy en laat het 30 minuten drogen. Leg de blok vervolgens plat op een oppervlak en droog hem een nacht lang bij 60 graden Celsius de volgende dag. Bekleed de blok met colloïdaal zilvervloeistof.

Houd de weefselsecties vlak om het snijden van de blok in de juiste hoek te vergemakkelijken om de correlatie tussen de seriële blokface en confocale micrografieën te vergemakkelijken. Na het uitvoeren van scanning elektronenmicroscopie volgens het tekstprotocol, converteer de SPEM-afbeeldingen van de rauw DM drie-formaat naar acht bits TIFF-afbeeldingen met behulp van een 0,8 Gaussiaanse wazige filter in Fiji. Filter de TIFF-afbeeldingen.

Schaal de dataset naar 25% van de oorspronkelijke grootte en sla het op als een TIFF-stack om de hoeveelheid RAM-geheugen die nodig is om de dataset met de Fiji-plugin lineaire stapeluitlijning met sift in vertaalmodus te behandelen te minimaliseren. Lijn de stack van SPEM-afbeeldingen uit en gebruik de 3D-crop plugin om ze bij te snijden. Gebruik het oppervlaktes gereedschap in tekenmodus en de contour optie in tekenmodus van 50 milliseconden om handmatig de cel van belang te segmenteren en volume te renderen.

Volg contouren op elke snede van de cel voor gladdere weergave of elke vijf sneden voor snellere weergave. Gebruik het snapshot gereedschap om de uiteindelijke afbeeldingen te exporteren met een resolutie van 300 DPI of meer met behulp van de P-Y-Y-G-F-P muis. Alle entero-endocriene cellen van het distale deel van de dunne darm worden geïdentificeerd en verwerkt voor SBEM zoals hier getoond.

Een geselecteerd weefselsegment werd afgebeeld door confocale microscopie om Zack-beelden te verkrijgen, die optisch één micron uit elkaar staan. Het optimaliseren van de afmetingen van de weefselblokken is cruciaal voor topografische correlatie tussen confocale en SBEM-gegevens. Deze volume-rendered weergave van een entero-endocriene cel in de ileum van de muis toont een prominente neuropod die zich uitstrekt onder epitheelcellen ongeveer 60 micron.

Door de confocale Z-stacks te correleren met een SBEM-afbeelding van de hele blokface, wordt de cel van belang hier geïdentificeerd in een blok van de distale colon van A-P-Y-Y-G-F-P muis. Het is belangrijk om de oriëntatie van de blok zo vlak mogelijk te houden om de optische sneden in de SBEM-afbeeldingen te matchen. Zodra de cel is geïdentificeerd, wordt SBEM-beeldvorming gedaan met een resolutie die hoog genoeg is om secretoire sles en andere celorganellen te identificeren.

Deze video bevat een 3D-rendering van de entero-endocriene cel. De dataset bevat 643 afbeeldingen die 45 micron van de weefseldiepte overspannen. De cel bevat een neuropod gevuld met secretoire les en microvilli.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de volledige ultrastructuur van een specifieke darmgevoelscel te documenteren die verspreid is