Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Het algemene doel van het volgende experiment is om veranderingen in hippocampale irk-fosforylering te detecteren na ruimtelijk leren bij Grailed twee knock-out muizen als model voor neurodevelopmentele stoornissen. Dit wordt bereikt door eerst zowel wilde type als grail twee knock-out muizen te testen in de Morris-waterdoolhof. Als tweede stap worden de hersenen van de muizen verwijderd en worden plakken van wilde type en knock-out muizen bereid door middel van viome-snijden.

Vervolgens worden hersenplakken van wilde type en knock-out muizen verwerkt voor immunohistochemie en gebruikt om fosforylatieveranderingen in de hippocampus te detecteren. De resultaten tonen verschillen in hippocampale RC-fosforylering tussen wilde type en grail twee knock-out muizen op basis van lichtmicroscopische visualisatie van de immunohistochemische kleuring. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke subsets van hippocampale neuronen te identificeren die worden geactiveerd na een hippocampus-afhankelijke speciale leertaak, zoals de Maurice-waterdoolhof.

We voegden het idee voor deze methode toe toen we besloten om de moleculaire cascade te onderzoeken die de moleculaire tekortkoming bij grail twee knock-out muizen onderlijnt, een muismodel voor autismespectrumstoornissen. Om te beginnen worden muizen van verschillende achtergrond van belang getraind in een ruimtelijk leertaak zoals de Morris Water Mae. Volg het trainingsregime zoals beschreven in de bijbehorende tekstprotocol op het einde van de trainingsperiode, euthanaseren de muizen en vervolgens fixeren en verwijderen van hun hersenen.

Wanneer u klaar bent om door te gaan met de procedure, gebruikt u een scalpel om het cerebellum te verwijderen. Lijm vervolgens de rest van de hersenen rechtop op de houderplaat van de vibrato. Snijd de hersenen in 20 tot 40 micrometer dikke seriële secties door de dorsale hippocampus.

Breng elke snede over in één put van een 24-puttenplaat gevuld met één milliliter van 0,1 molair PBS. Breng drie tot vijf dorsale hippocampale secties voor elke muis over in de putten van een 24-multiputtenplaat die 500 microliter 0,1 molair PBS bevatten voor elke. Was de secties in elke put met 500 microliter 0,1 molair PBS. Voer alle wasbeurten en incubaties uit bij kamertemperatuur met zachte agitatie, tenzij anders vermeld. Incubeer de secties onder een afzuigkap gedurende 20 minuten in 40% methanol, 1% waterstofperoxide in 0,1 molair PBS om de endogene peroxidaseactiviteit te onderdrukken.

Volgend op drie meer wasbeurten in 0,1 molair PBS perme de secties door ze gedurende vijf minuten in 500 microliter 0,2% Triton X 100 te incuberen. Terwijl de secties incuberen, bereid voldoende blokkeerbuffer voor het hele experiment voor. Verwijder vervolgens de permeabele oplossing en voeg 100 microliter van de blokkeerbuffer toe aan elke. Put. Incubeer de secties gedurende een uur.

Verwijder vervolgens de blokkeerbuffer en bedek de secties met gefosforyleerd extracellulair gereguleerd kinase. Primaire antilichaam verdund één op 500 in blokkeerbuffer. Incubeer de secties een nacht bij vier graden Celsius met zachte agitatie. De volgende dag na het wassen van de secties drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molair PBS.

Incubeer vervolgens elke sectie met een biotin-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund één op 250 in blokkeerbuffer, gedurende één uur bij kamertemperatuur tijdens de incubatie. Bereid het ABC-reagens minstens 30 minuten voor gebruik om voldoende tijd te geven voor het vormen van het Aden- en biotinecomplex. Na het wassen van de secties nogmaals drie keer met 0,1 molair PBS, voegt u het ABC-reagens toe en laat u het 45 minuten incuberen met het monster.

Tijdens de volgende set van drie wasbeurten in PBS, bereidt u de DAB-werkoplossing voor in de afzuigkap volgens de specificaties van de fabrikant, verdeelt u de DAB-werkoplossing in de plaat. Breng vervolgens de secties over in de putten die de DAB-werkoplossing bevatten en zwiep langzaam met de plaat om maximale blootstelling van de secties aan de oplossing mogelijk te maken. Controleer de DAB-reactie onder een microscoop totdat er voldoende signaal ontstaat.

Na ongeveer twee tot vijf minuten, stopt u de reactie bij de gewenste kleurintensiteit door het weefsel in 0,1 molair PBS te wassen. Na drie meer wasbeurten in PBS, monteer de secties op gelatine-gecoate slides en laat ze bij kamertemperatuur drogen gedurende minstens drie tot vier uur. Zodra ze luchtdroog zijn, brengt u de slides in de afzuigkap over en dehydrateert u de secties door ze sequentieel in geïntegreerde ethanoloplossingen te plaatsen gedurende twee minuten per keer, vervolgens verheldert u de slides in 100% xyleen gedurende vijf minuten.

Bedek, plaats de slides met montagemiddel en laat ze in de afzuigkap overnacht drogen. Breng de slides over naar een helderveldmicroscoop, uitgerust met een camera en een 20x objectieflens. Verzamel meerdere helderveldbeelden van elke sectie bij 200x vergroting die de dorsale hippocampus beslaan. Drie tot vijf secties van elk dier.

Hier getoond zijn secties van de dorsale hippocampi-regio's van een wilde type muis en een Grailed twee knock-out muis gekleurd voor gefosforyleerd. Extracellulair gereguleerd betrouwbaar moleculair leesresultaat van leerafhankelijke neuronale activering. Beide muizen hadden een klassiek hippocampaal afhankelijke ruimtelijk leertaak ondergaan, de Morris-waterdoolhof, voordat ze werden geofferd.

Op de laatste testdag vertoonden de Grailed twee knock-out muizen een significant ruimtelijk leerdeficit vergeleken met de wilde type muizen. Om de hersenplakken van de muizen te analyseren, werd het totale aantal positieve cellen geteld in de verschillende regio's van de hippocampus. In de CA drie parameterlaag hadden wilde type muizen significant meer gefosforyleerde RK-positieve cellen per gebied dan de knock-out muizen.

Tegenovergestelde resultaten werden gevonden in de hili en granule cell layer of GCL. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fosforformulering op hersenplakken van de hippocampus van zowel genetische als farmacologische muismodellen van neurodevelopmentele stoornissen kunt on