Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

Het algemene doel van deze procedure is de goed gecontroleerde synthese van fluorescente statistische lineaire glycopolymeren met behulp van reversieve toevoeging, fragmentatie, ketenoverdracht of raftpolymerisatie. Dit wordt bereikt door eerst de glycomonomeer twee lacto bio ethylmethacrylamide, of L-A-E-M-A, te synthetiseren. De tweede stap is om raftpolymerisatie van L-A-E-M-A-N twee amino ethylmethacrylamide, of A EMA en N twee hydroxyethylacrylamide of een GAA te gebruiken om het overeenkomstige glycopolymeer met lage dispersie te synthetiseren.

Vervolgens wordt het glycopolymeer gemodificeerd op een van zijn primaire aminen door reactie met carboxyfluoresceine xito middelste ester om een gefluorescereerd glycopolymeer te produceren. De laatste stap is om het gefluorescereerd native glycopolymeer te binden aan lectinegecoate aro-kralen met bekende koolhydraatbindingsspecificiteit. Uiteindelijk wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de binding van de glycopolymeren aan de aro-kralen te analyseren, waardoor wordt bevestigd dat het glycopolymeer het koolhydraat van belang bezit en is gelabeld met een fluorescente tag.

Het voordeel van RAF-polymerisatie boven bestaande methoden die conventionele vrije radicaalpolymerisaties gebruiken, is dat het wrath-proces een controlepolymerisatietechniek is die het aantal door initiatie afgeleide ketens minimaliseert. Dit resulteert in polymeren met vooraf bepaalde molecuulgewichten en een zeer smalle polydispersiteit. Polymerisaties kunnen worden toegepast op een gedefinieerde mengsel van monomeren voor de bereiding van specifieke fluorescente glycopolymeren.

Deze glycopolymeren hebben gedefinieerde bindingsvermogens die kunnen worden geverifieerd door het gebruik van lectinegecoate kralen. De efficiënte bereiding van fluorescente glycopolymeren zou in de toekomst van grote waarde kunnen zijn voor glycobiologie-onderzoek. Om te beginnen, lost u twee gram lactobionzuur op in drie milliliter anhydrisch methanol.

Voeg vervolgens langzaam absoluut ethanol druppelsgewijs toe aan de oplossing totdat deze net troebel wordt. Gebruik een rotatieverdamper om alle oplosmiddelen te verwijderen. Herhaal dit proces drie keer om 1,94 gram lactobioo één vijf lacton in 98% opbrengst te produceren.

Voeg een oplossing van één gram lactobiolacton in drie milliliter methanol toe aan een oplossing van A EMA en MEHQ in twee milliliter methanol. Voeg vervolgens één milliliter triethylamine toe en roer het mengsel op kamertemperatuur. Voeg na 48 uur 20 milliliter gedeïoniseerd water toe aan het mengsel en breng het over in een rotatieverdamper.

Verdampen tot volledig droog. Los het residu op in 20 milliliter gedeïoniseerd water en breng de oplossing aan op de bovenkant van een 10 bij 20 millimeter anionenuitwisselingskolom. Plaats een beker met één milligram MEHQ onder de uitlaat en elueer de kolom in de beker.

Na het opnemen van de oplossing in een rotatieverdamper, los het residu op in 20 milliliter gedeïoniseerd water en voeg één milligram aliquotten van ionenuitwisselingshars toe. Totdat een hydranttest negatief is, voer hydranttests uit door één microliter van de oplossing te verwijderen en deze aan te brengen op een dunne laag chromatografieplaat. Spuit de plaat met een 2% anhy in ethanol oplossing en verwarm gedurende één minuut op 90 graden Celsius op een hotplate.

Het eindpunt is bereikt wanneer er geen blauwe kleur ontstaat. Filtreer vervolgens de oplossing door een fritteerglas trechter in een testbuis. Vries de oplossing in op min 80 graden Celsius en breng deze vervolgens over naar een lyofilisaat om te worden gevriesdroogd.

Los het residu op in een minimale hoeveelheid methanol en sla het product neer door minus 20 graden Celsius en anhydrisch aceton toe te voegen. Verzamel het neergeslagen L-A-E-M-A door middel van filtratie door een fritteerglas trechter. Breng de trechter en het neerslag over naar een vacuüm droogkast voor droging, eerst bij 0,5 gram van ongeveer 150 mesh aluminiumoxide nanodeeltjes op één milliliter commercieel HEAA in een twee milliliter testbuis.

Centrifugeer de buis gedurende 30 seconden bij 300 keer G en gebruik de bovenste laag als remmervrij HEAA. Los voorzichtig 32,8 milligram L-A-E-M-A, 1,7 milligram A EMA en 27,5 microliter remmervrij HEAA en 0,4 milliliter gedeïoniseerd water op en breng de oplossing over in een goed gereinigde één milliliter flankbuis. Voeg vervolgens 50 microliter raftreagens en 50 microliter initiatorreagens toe aan de buis en meng door voorzichtig te tikken op de zijkant van de buis met de klep gesloten. Verbind de buis met een vacuümlijn en bevries de inhoud met behulp van een dry ice ethanol bad.

Verlaag vervolgens de buisdruk tot ongeveer 50 millitorr met een pomp en sluit de klep. Verwijder het dry ice bad en laat de inhoud ontdooien. Herhaal de bevries-, vacuüm- en ontdooicyclus nog twee keer zorgvuldig.

Inspecteer de buis om ervoor te zorgen dat de inhoud volledig is opgelost en vortex voorzichtig indien nodig. Voordat u het zitje plaatst, verwijdert u de gesloten buis van de vacuümlijn en plaatst u deze in een doorzichtige plastic vacuümzak. Pomp de lucht uit de zak met een plastic handpomp.

Plaats vervolgens de zak in een afgedekt waterbad op 70 graden Celsius gedurende 24 uur. Verwijder vervolgens de buis uit de zak en breng de inhoud over in een dialysezak met een moleculair gewichtssnijvlak van 3.500 Dalton. Plaats de dialysezak in een beker en dialyseer gedurende 24 uur tegen twee liter gedeïoniseerd water.

Breng de inhoud van de dialysezak over in een testbuis en plaats deze in een vriezer op min 80 graden Celsius. Zodra bevroren, breng over naar een lyofilisaat en vriesdroog. Om het fluffige witte glycopolymeer PMA LA EMA te verkrijgen, bereidt u eerst een oplossing van vijf milligram PMA LA EMA in 0,9 milliliter PBS.

Voeg vervolgens langzaam 0,6 milligram carboxyfluoresceine cin, middelste eter in 100 microliter dimethylformamide toe aan