Name: Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Leer de efficiënte synthese van fluorescerende glycopolymeren via RAFT-polymerisatie voor glycobiologie-onderzoek. Deze methode produceert polymeren met nauwkeurige moleculaire gewichten en smalle dispersiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Experiment Station Chemical Laboratories van de Universiteit van Missouri en door de Cystic Fibrosis Association van Missouri.

1. Synthese van 2-Glycomonomer Lactobionamidoethyl methacrylamide <ol><li> Los 2 g lactobionzuur in 3,0 ml watervrije methanol en voeg langzaam absolute ethanol in een daling van de verstandige manier tot de oplossing wordt gewoon bewolkt, verwijder vervolgens de oplosmiddelen via draaiverdamping. </li><li> Los het residu uit stap 1,1, in 3,0 ml watervrij methanol en, nogmaals, voeg langzaam absolute ethanol tot ze troebel, dan verdampt het oplosmiddel via roterende verdamping. Herhaal deze stap 3 keer om lactobiono-1,5-lacton (1,94 g, 98% opbrengst) verkregen. Dit product is voldoende zuiver voor gebruik in de volgende reactie. </li><li> Voeg 1,0 g lactobionolactone in 3,0 ml methanol N - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0,58 g) en hydrochinon monomethyl ether (MEHQ, 1,0 mg), een remmer van zelf-polymerisatie, in 2,0 ml methanol, gevolgd door 1,0 ml triethylamine. Roer bij kamertemperatuur gedurende 48 uur. </li><li> Voeg 20 ml gedeïoniseerd H2O (dH 2 </sub&gt; O) aan de reactiekolf, verwijder vervolgens de methanol en vrije triethylamine door verdamping tot droog via draaiverdamping. </li><li> Om overblijvende lactobionzuur verwijderen, voeg 20 ml dH 2 O, vervolgens de waterige oplossing door een anionenuitwisselingskolom (OH - vorm, 10 mm x 20 mm) in een ontvangend bekerglas met 1,0 mg MEHQ. </li><li> Verwijder triethylamine, geproduceerd in stap 1,5, door verdampen tot droog via roterende verdamping. </li><li> Voeg 20 ml dH 2 O en verwijder ongereageerd AEMA door langzaam toevoegen van 1 mg hoeveelheden van kationenuitwisselingshars (H + vorm) totdat geen ninhydrine reactieve materialen detecteerbaar. Controleer de verwijdering door middel van 1 pi aliquots van de oplossing na elke toevoeging hars, toe te passen op een dunnelaagchromatografie plate vervolgens sproeien van de plaat met een 2% ninhydrine in ethanol oplossing. Wanneer geen diepe blauwe kleur waargenomen ontwikkelen wanneer de plaat wordt verwarmd tot 90 ° C gedurende 1 min, is het eindpunt bereikt. </li><li&gt; Filtreer de oplossing door een glasfilter, transfer van het filtraat in een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en dan Lyophilize. </li><li> Verwijder MEHQ uit het monster door oplossen van het gevriesdroogde materiaal in een minimale hoeveelheid methanol (-0,5 ml), voeg dan koud watervrije aceton (-20 ° C, 15 ml) om het product te precipiteren. Verzamel het neerslag door filtratie met een glasfilter, daarna droog het precipitaat in een exsiccator onder vacuüm om 2-lactobionamidoethyl methacrylamide (LAEMA) als een gebroken-wit poeder (0,94 g, 68% opbrengst) verkregen. Dit product is voldoende zuiver voor gebruik in de volgende reactie. </li></ol> 2. Synthese van 2-Monomer Gluconamidoethyl methacrylamide Opmerking: De bereiding van 2-gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA), die een hanger suiker niet in het bezit, werd aangepast van een gepubliceerde methode 15. <ol><li> Voeg 2,0 g AEMA opgelost in 10 ml methanol om een ​​oplossingD-gluconolacton (1,6 g) in 30 ml methanol en onder roeren, voeg langzaam 1,6 ml triethylamine. </li><li> Roer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. </li><li> Filtreer het neergeslagen product op een glasfilter en spoel het precipitaat drie maal met 10 ml van isopropanol, daarna wassen met 10 ml droge aceton. Droog het neergeslagen product in een exsiccator onder vacuüm. </li></ol> 3. VLOT Glycopolymer Synthese <ol><li> Om de remmer MEHQ aanwezig handelsnaam verwijderen - (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), voeg 1 ml HEAA een 2 ml microcentrifugebuis, gevolgd door toevoeging van 0,5 g aluminiumoxide nanodeeltjes. Centrifugeer de buis bij 300 g gedurende 30 sec, en met de toplaag HEAA in de volgende reactie. </li><li> Voeg voorzichtig 32,8 mg LAEMA (70,0 umol), 1,7 mg AEMA (10,5 umol) en 27,5 pl HEAA (270 umol), alle opgelost in 0,4 ml dH 2 O, een goed gereinigde 1 ml Schlenk tube, waardoor met een Monomer molverhouding van 20: 3: 77. </li><li> Bij een parallelle reactie om de controle polymeren die geen tegenhanger suiker bezitten, produceren in plaats van het gebruik LAEMA in stap 3,2, vervangen 21,4 mg GAEMA (70,0 umol) in de reactie. </li><li> De respectieve Schlenk buis (bijv 3,2 of 3,3), achtereenvolgens voeg 50 pl DMF dat 0,53 mg (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate (1,9 umol, RAFT agent) en 50 ui DMF dat 250 ug 4,4&#39;-azobis- (4-cyanovaleriaanzuur) (0,9 umol, initiator). Meng door vinger tikken. </li><li> Bevriezen van de inhoud in de Schlenkbuis gebruik van een droogijs: ethanol bad (75 g droog ijs in 100 ml ethanol), het toepassen van een vacuüm binnen 10-50 mTorr, sluit de Schlenk ventiel en toestaan ​​dat de oplossing om langzaam te ontdooien RT . Herhaal deze freeze-Evacuatie-dooi cyclus nog twee keer. Zorg ervoor dat alle reagentia worden opgelost na de laatste dooi. </li><li> Plaats de Schlenkbuis in een afsluitbare plastic bag, evacueren lucht van de zak, en sluit het dan. Breng de zak met de Schlenk buis een voorverwarmd waterbad bij 70 ° C en incubeer 24 uur. </li><li> Breng voorzichtig de oplossing in de Schlenk buis een voorbereid dialysezak (MWCO = 3500) en dialyseer tegen dH 2 O (10 x 2 l) gedurende 24 uur, verandert de dH 2 O elk uur gedurende de eerste 8 uur. Na dialyse Breng het monster uit de dialysebuizen een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en vervolgens lyofiliseren. </li></ol> Opmerking: Het verkregen statistische poly-methacrylamide / acrylamide (PMA) copolymeren dat aanhangende 4- O -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide (lactobionamide) (van Stap 3,2) of D-gluconamide (uit stap 3.3), respectievelijk, zijn verkregen. Voor het gemak van bespreking, zijn deze twee glycopolymers afgekort als PMA-LAEMA en PMA-GAEMA resp. 4. Post-modificatie van Glycopolymers met Fluoroforen </p&gt; <ol><li> Los 5,0 mg glycopolymer PMA-LAEMA of PMA-GAEMA bevattende ~ 0,9 pmol primaire aminefunctionele groepen in 0,9 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M natriumfosfaat, 0,15 M NaCl, pH 7,5), respectievelijk. </li><li> Voeg langzaam 0,6 mg carboxyfluoresceïne succinimidyl ester in 100 pi DMF aan de oplossing onder snel roeren. Roer de reactie 16 uur in het donker bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl beschermd tegen licht, laadt het monster in een voorbereide dialyseslang (MWCO = 3500) en dialyseer tegen dH 2 O (2 L) gedurende 16 uur, verandert de dialyseoplossing elk uur gedurende de eerste 8 uur. Na dialyse Breng het monster uit de dialysebuizen een reageerbuis, het monster bij -80 ° C te bevriezen, en vervolgens lyofiliseren. </li></ol> Opmerking: Na vriesdroging, fluorescent glycopolymers PMA-LAEMA-fluoresceïne en PMA-GAEMA-fluoresceïne, respectievelijk, worden verkregen. 5. Analyse van de Glycopolymeren <ol><li> Bepaal het aantalgemiddelde molecuulgewicht (Mn), het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht (Mw) en de dispersiteit (Mw / Mn) van de glycopolymers op commerciële HPLC systeem uitgerust met gelpermeatiechromatografie (GPC) software, een GPC kolom geschikt voor het molecuulgewicht van belang en een brekingsindex detector, gebruik van 0,1 M Tris / 0,1 M natriumchloride (pH 7) als eluent met een stroomsnelheid van 0,6 ml / min 14. Met polyethyleenglycol normen molecuulgewichtstandaards (MW: 200-1,200,000 g / mol). </li><li> Kwantificeren van de feitelijke concentraties primaire aminefunctionele groepen in de glycopolymers 16. Analyseer het totale koolhydraatgehalte van de gesynthetiseerde glycopolymers volgens een gepubliceerde werkwijze 17. </li><li> Voer testen van de structurele samenstelling en de zuiverheid van de glycomonomers LAEMA, GAEMA en glycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA in D 2 O met behulp van NMR-spectroscopie 14. </li></ol> 6. Binding Tests van de synthetische Glycopolymers met lectine-gecoate agaroseparels <ol><li> Voeg 1,5 ml van PBS tot 50 ul van de schorsing van Erythrina crista-galli lectine (ECL) gecoate agarosekorrels, centrifuge bij 300 xg gedurende 1 minuut en verwijder voorzichtig en gooi het supernatant. Herhaal deze stap tweemaal, en resuspendeer de korrels in 0,5 ml PBS. </li><li> Voeg 3 ug PMA-LAEMA-fluoresceïne of PMA-GAEMA-fluoresceïne (negatieve controle) in 6 pl PBS aan de parels suspensie, en incubeer de mengsels, in het donker, bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Was de mengsels met 1,5 ml PBS driemaal, en resuspendeer kralen in 0,2 ml PBS. Plaats een monster (4 pl) in een goed op een immunofluorescentie microscoopglaasje (Teflon-coating), dek af met een deksel slip, en observeren met behulp van fluorescentie microscopie met een FITC-filter (excitatiegolflengte: 467-498 nm, emissiegolflengte: 513- 566 nm) en een 10x objectief te onderzoeken van de binding van tHij fluorescent glycopolymers de kralen 14. </li></ol>

<ol><li>Scharfman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+binds+to+neoglycoconjugates+bearing+mucin+carbohydrate+determinants+and+predominantly+to+sialyl-Lewis+x+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates.</a> Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).</li>
<li>Song, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+alveolar+macrophages+via+RAFT-based+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers.</a> Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).</li>
<li>Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfenden%2C+ML+%22Carbohydrate+Recognition%3A+Biological+Problems%2C+Methods%2C+and+Applications%22">Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications</a>. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).</li>
<li>Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+addition-fragmentation+chemistry+in+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis.</a> Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).</li>
<li>Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+well-defined+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.%2C+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers.</a> J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).</li>
<li>Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+various+glycopolymer+architectures+via+RAFT+polymerization%3A+From+block+copolymers+to+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars.</a> Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).</li>
<li>Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT+polymerization+mediated+bioconjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies.</a> Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).</li>
<li>Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+and+their+multivalent+recognitions+with+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins.</a> Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).</li>
<li>Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+by+controlled+radical+polymerization+techniques+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications.</a> Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).</li>
<li>Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+glyco-functionalized+quantum+dots%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+cytotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).</li>
<li>Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+galactose-containing+multi-functional+copolymers+and+glyconanoparticles+for+biomolecular+recognition+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes.</a> Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+N-2-hydroxypropyl+methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl+methacrylamide+block+copolymers+as+hepatocyte-targeting+gene+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).</li>
<li>Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+RAFT+polymerization+of+N-acryloylmorpholine%2C+synthesis+of+an+ABA+triblock+glycopolymer+and+study+of+its+self-association+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior.</a> Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).</li>
<li>Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT-based+tri-component+fluorescent+glycopolymers%3A+synthesis%2C+characterization+and+application+in+lectin-mediated+bacterial+binding+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study.</a> Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).</li>
<li>Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+well-defined+glycopolymers+synthesized+via+the+reversible+addition+fragmentation+chain+transfer+process+in+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polymer+Sci.+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media.</a> J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).</li>
<li>Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+primary+amine+groups+available+for+subsequent+biofunctionalization+of+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).</li>
<li>Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+A+%22Analysis+of+Carbohydrates+by+GLC+and+MS%22">Analysis of Carbohydrates by GLC and MS</a>. , CRC Press. 87-170 (1989).</li>
<li>Thomas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+molecular+weight+control+of+the+polymerization+of+acrylamide+via+RAFT%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT.</a> Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een gemakkelijke en efficiënte protocol voor RAFT-gebaseerde tri-fluorescente component glycopolymers, met en zonder hangers koolhydraten en hun toepassing in een lectine-bindende test wordt aangetoond in dit rapport. Het protocol begint met de voorbereiding van glycomonomers LAEMA en GAEMA. Via een één-stap-VLOT gecontroleerde copolymerisatie, glycopolymers met reproduceerbare opbrengst, voorspelbare monomeersamenstelling en lage dispersiteit, worden verkregen. Worden bij een modificatie van glycopolymers met carboxyfluoresceïne succinimidyl ester, de binding van de resulterende respectievelijke fluorescent-gelabelde glycopolymer gemakkelijk testbaar om zijn lectine bindingsspecificiteit. In de initiële voorbereidende stappen van de glycomonomers die worden toegepast in de daaropvolgende glycopolymer syntheses, beschikbaar lactobionzuur en gluconolacton werden gebruikt. In theorie zou elk koolhydraten plaats van monosacchariden tot complexe Oligosacchariden, Converte kand om glycomonomers door het conjugeren van het doel suiker op de primaire hydroxylgroep op de C6 van glucose. Na oxidatie van het reducerende glucoserest en de daaropvolgende dehydratatie tot een lacton, kan het product daarna gemakkelijk in reactie gebracht met het primaire amine op AEMA de overeenkomstige glycomonomer vormen. Verdere voorbeelden van deze verbinding kan worden gezien in een recent rapport 14. Opgemerkt wordt dat voordat zij een polymerisatiestap, MEHQ, een krachtige polymerisatie-inhibitor, worden uit alle monomeer en glycomonomer preparaten juist voor gebruik verwijderd. Dit wordt eenvoudig volbracht door de minimale hoeveelheid methanol om de glycomonomer die bezit MEHQ dan onmiddellijk behandelen met aceton bij -20 ° C aan het inhibitor vrij product in hoge opbrengst precipitaat op te lossen. Essentieel in radicale polymerisatie regeling, aandacht voor detail en monomeer zuiverheden worden benadrukt. Zoals typerend voor een RAFT polymerisatiesysteem, het bestaat uiteen radicaalbron, een RAFT reagens, een monomeer en oplosmiddel. In deze presentatie gevisualiseerd wordt een eenstaps RAFT polymerisatiesysteem beschreven dat zich richt op de produktie van gegenereerd uit een reactiemengsel bezit drie verschillende monomeren in een waterige oplossing statistische copolymeren. Twee afzonderlijke RAFT-gemedieerde reacties worden waarbij men gebruik maakt van een glycomonomer die een aanhangende bezit, non-reducerende koolhydraten terminus (bijv β-D-galactose), en anderzijds bezit van een polyol zonder gebonden koolhydraatresidu. Gemeenschappelijk voor beide RAFT-gemedieerde reacties waren monomeren bezitten een unieke hydroxylgroep die dient als afstandhouder molecuul en ander bezit een vrije amine voor post-modificatie met een amino-reactieve fluorofoor. Aangezien de aanwezigheid van zuurstof in het reactiemengsel en omgeving nadelig voor RAFT-gemedieerde polymerisatie wordt de verwijdering op niveau traceren gemakkelijk verkregen via verscheidene vries-evaCuate-dooi cycli terwijl de Schlenk tube reaktievat onder hoog vacuum. Opgemerkt wordt dat de molaire verhouding van verschillende monomeren in het reactiemengsel kan worden bijgesteld te worden. Ook, door het variëren van de hoeveelheid RAFT middel gebruikt, de lengte van de verkregen polymeren kan worden gecontroleerd 18. Wel dient de molaire verhouding van de RAFT agent initiator altijd groter dan twee zijn de lage polydispersiteit van het product te waarborgen. Onder deze omstandigheden is de ontwikkeling van de copolymerisatie is stabiel, en de reproduceerbaarheid van de reactie is zeer hoog. Dat gezegd zijnde, is het onwaarschijnlijk dat men verkrijgt een geheel gelijkmatige verdeling van alle deelnemende monomeren binnen een statistisch copolymeer, vanwege hun verschillende polymerisatie- snelheden. Karakteriseren van de verdeling van de verschillende monomeren in het polymeer nog steeds zeer uitdagend. De post-modificatie methode, hier wordt gepresenteerd, is zowel eenvoudiger en amenable het gebruik van een bredere selectie van fluorescente labels, in vergelijking met andere protocollen toegepast label glycopolymers 2,11. Deze zouden omvatten veel van de in water oplosbare amine-reactieve fluoroforen, quantum dots, biotine, en anderen. De bindende specificiteiten van de gesynthetiseerde, geëtiketteerd glycopolymers zijn gemakkelijk controleerbaar met behulp van lectinen met bekende bindingsaffiniteiten. PMA-GAEMA bezitten geen hanger suiker is een passende negatieve controle. Glycopolymers met verschillende fluorescente labels bereid via deze route met succes gebruikt bij onderzoek van lectine-gemedieerde bacteriële binding 14. Zoals weergegeven, dient deze gemakkelijke en efficiënte bereiding van statistische fluorescent glycopolymers groot potentieel bieden om een ​​groot aantal glycobiologische onderzoek.

In de afgelopen twee decennia hebben de onderzoeken met synthetische glycopolymers langzame maar voortdurende ontwikkeling doorgemaakt, waaruit een aanzienlijk potentieel in de behandeling van besmettelijke mechanismen die onderzoek dat zich richt op lectine erkenning verwerkt 1-3 bevatten. Aangezien synthetische glycopolymers bezit multivalent suikergroepen vertonen veel hogere lectine-bindende efficacies, vergeleken met monovalente koolhydraten, ze van grote vraag in de glycobiologie gebied 3. Van bijzonder belang bij klinisch onderzoek is het gebruik van fluorescente glycopolymers de lectine-gemedieerde bacteriële binding met koolhydraten op humane celoppervlakken en respiratoire slijmvliezen glycoproteïne karakteriseren. Vroege in vitro studies gebruikt handel verkrijgbare polyacrylamide gebaseerde glycopolymers in bacteriële binding testen. Verschillende van deze probes waren veelbelovend, maar bezorgdheid over, verkrijgbaarheid en lot-to-lot variaties in zowel polYmer molecuulgewicht en glycoepitope content. Een economische in-laboratoriumprotocol ontwikkeld die voorziet in een voldoende controle structuur inhoud, grootte en zuiverheid van synthetische glycopolymers richten bacteriële lectines. In de zoektocht naar een geschikte synthetische benadering glycopolymers, werd een relatief nieuwe polymerisatietechniek getest met behulp van een soort van gecontroleerde radicaal-polymerisatie die omkeerbaar toevoeging-fragmentatie keten-overdracht (VLOT) agenten 4 toegepast. Dergelijke RAFT reagentia zijn onlangs gebruikt in enkele glycopolymer preparaten 5-7. Vergeleken met andere glycopolymer bereiding protocollen RAFT-gemedieerde polymerisaties tonen verscheidene voordelen, waaronder de tolerantie voor verschillende monomeer structuren en reactieomstandigheden mogelijke verenigbaarheid met waterige oplossingen en geringe omvang dispersiteit van het gewenste polymere producten 8,9. Van opmerkelijk belang zijn protocollen voor de bereiding van RAFT-based tri-component glycopolymers, waardoor regeling van samenstellingen van verschillende monomeren, die elk verschillende functies 10-13 hebben. Echter, de meeste van het voorgaande onderzoek inspanningen hetzij ontbrak anomere hanger koolhydraten 10 of dienst getrapte polymerisaties resulteert in tri-blokcopolymeren, die uit covalent gebonden homopolymeren, die vaak voor verschillende doeleinden dan statistische polymeren die copolymeren zijn waarin de sequentie monomeer residuen volgt een statistische regel 9-13. Onlangs werd met het ge- thiocarbonylthio RAFT verbinding (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate in een waterige omgeving, de bereiding van een groep van RAFT-gebaseerde lineaire tri-component statistische glycopolymers met specifieke hanger suikers en hun toepassing in lectine-gemedieerde bacteriële binding proeven gerapporteerd 14. Het algemene doel van deze methode, gepresenteerd op een visuele manier, is tri-component te bereidenstatistische fluorescerende glycopolymers via RAFT-gecontroleerde copolymerisatie. Vanwege het gemak van de eenstaps polymerisatie protocol, de nauwkeurige controle over de polymeerlengte en samenstellingen, en de hoge reproduceerbaarheid van de reactie, dit protocol kan gemakkelijk worden toegepast op andere RAFT-gebaseerde synthesen van glycopolymers met de gewenste structuur.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>Lactobionzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>153516</td><td></td></tr><tr><td>D-Gluconolacton&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>Oranje II natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8126</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon monomethylether (MEHQ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54050</td><td>Polymerisatie-remmer</td></tr><tr><td>N-(2-aminoethyl)methacrylamide hydrochloride (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>Aanion-uitwisselingshars IRN-78 hydroxide-vorm, 80 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>Kation-uitwisselingshars 50Wx8, 200 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumoxide, ~150 mesh&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1522</td><td>Type WN-6, Neutraal, Activiteitsgraad Super I</td></tr><tr><td>Ninhydrine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4876</td><td>Een ethanoloplossing van 0,2% ninhydrine werd gebruikt in de test</td></tr><tr><td>4-Cyano-4-(fenylcarbonothioylthio)pentaanzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>722995</td><td>RAFT-middel</td></tr><tr><td>4,4&prime;-Azobis(4-cyanovalerinezuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11588</td><td>Polymerisatie-initiator</td></tr><tr><td>Carboxyfluoresceine succinimidyl ester&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina Cristagalli lectin gecoate agarose kraal</td><td>Vector Laboratories</td><td>AL-1143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Oplosmiddel</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Geproduceerd door Barnstead waterzuiveringssysteem, 18 megOhm-cm</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>ACS-kwaliteit of beter</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ACS-kwaliteit of beter</td></tr><tr><td>Absoluut ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS-kwaliteit of beter</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>ACS-kwaliteit of beter</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>ACS-kwaliteit of beter</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Dialymembraan (MWCO: 3.500)</td><td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol analytische standaard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O2393</td><td></td></tr><tr><td>Schlenkbuis, 1 ml</td><td>Quark Glass</td><td></td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>Tosoh Bioscience&nbsp;</td><td>8022</td><td>Gebruikt voor GPC-analyse van de glycopolymeren</td></tr><tr><td>Empower 3 met GPC/SEC-pakket</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Alliance HPLC-systeem&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td></td><td>Uitgerust met refractieve indexdetector (Waters 2414) en fluorescentiedetector (Waters 2475)</td></tr><tr><td>Avance III 800 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX43 fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Gebruikt met FITC-filter in de glycopolymeerbindingstest</td></tr><tr><td>Rotavap / Roto-evaporator</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted disc snel</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Lyofilizzator</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunofluorescence microscoopglas</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp;&#176;C Vriezer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastiek vacuümzak en handpomp</td><td>Ziploc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuumpomp, directe aandrijving, Maxima C Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuummeter</td><td>Sargent-Welch</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

facile en efficiënte voorbereiding van tri-component fluorescent glycopolymers via-vlot gecontroleerde polymerisatie

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

Synthetische glycopolymers zijn instrumentaal en veelzijdige instrumenten die gebruikt worden in verschillende biochemische en biomedische onderzoeksgebieden. Een voorbeeld van een gemakkelijke en efficiënte synthese van goed gecontroleerde fluorescent statistische glycopolymers via reversibele additie-fragmentatie chain transfer (RAFT) gebaseerde polymerisatie wordt aangetoond. De synthese begint met de bereiding van β-galactose-bevattende glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide, verkregen door reactie van lactobionolactone en N - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA). 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) wordt gebruikt als een structureel analogon ontbreekt een terminale β-galactoside. De volgende RAFT-gemedieerde copolymerisatiereactie omvat drie verschillende monomeren: N - (2-hydroxyethyl) acrylamide als spacer, AEMA als doelwit voor verdere fluorescentie labeling en de glycomonomers. Tolerant waterige systemen de RAFT, gebruikt bij de reactie (4-cyanopentaanzuur) -4-dithiobenzoate.Low dispersities (≤1.32), voorspelbare copolymeersamenstellingen en hoge reproduceerbaarheid van de polymerisaties werden waargenomen bij de producten. Fluorescent polymeren worden verkregen door modificeren van de glycopolymers met carboxyfluoresceïne succinimidyl ester gericht op het primaire amine functionele groepen op AEMA. Lectine-bindende specificiteiten van de resulterende glycopolymers worden geverifieerd door te testen met bijbehorende agarosekorrels gecoat met specifieke glycoepitope herkennen lectinen. Vanwege het gemak van de synthese, de strikte controle van het productsamenstellingen en de goede reproduceerbaarheid van de reactie, dit protocol kan worden vertaald richting bereiding van andere RAFT-gebaseerde glycopolymers specifieke structuren en samenstellingen, zoals gewenst.

Synthese van glycomonomer Lactobionzuur werd hier gebruikt als voorbeeld voor de bereiding van glycomonomers. Met behulp van methoden in het eerste verslag over de synthese van LAEMA 11, werden gevarieerd rendementen in de voorbereiding met onbevredigende zuiverheid waargenomen. De gemodificeerde zuiveringswerkwijze gebruik kation en anion-uitwisselende harsen om onomgezet uitgangsmateriaal aangeboden stabiel product opbrengst en hoge zuiverheid, hetgeen wordt bevestigd door 1H en 13C NMR-spectroscopie (figuur 1) te verwijderen. VLOT glycopolymer synthese en post-modificatie van glycopolymers met fluoroforen In tegenstelling tot de block-glycopolymers bereid met verhoogde RAFT polymerisaties Deze eenstaps copolymerisatie protocol verschaft een gelijkmatige glycomonomer verdeling over het polymeerskelet. De hier getoonde glycopolymers bevat 20 mol% van glycomonomer, 77 mol% van HEAA als afstandhouder en 3 mol% van AEMA als doelwit voor post-modificaties (zie figuur 2). 1 H- en 13C-NMR-spectroscopie bevestigde de structuur van PMA-LAEMA en PMA-GAEMA (Figuren 3 en 4). Zoals getoond in figuur 5, wanneer uitgezet tegen de GPC elutieprofielen van de glycopolymer gesynthetiseerde zonder RAFT, zowel PMA-LAEMA en PMA-GAEMA lage dispersities, waaruit de effectiviteit van de RAFT benadering. Zoals verwacht, PMA-GAEMA een Mn kleiner dan die van PMA-LAEMA vanwege PMA-GAEMA Het gebrek aan een tegenhanger suiker. Analyse van de koolhydraten en primaire aminefunctionele groepen inhoud van de RAFT glycopolymers gebleken dat de verhouding van monomeren in het product glycopolymers strookt met de stoichiometrische verhouding van uitgangsmonomeren die bij de RAFT-gemedieerde polymerisatie reactie (Tabel 1). Dit betekent een strakke controle van het monomeer compositions in de gesynthetiseerde glycopolymers volgens ontwerp. Omzetting van primair amine functionele groepen met actieve fluoroforen is een algemeen gebruikte techniek bij het merken van eiwitten. Deze techniek werd hier gebruikt om gezuiverd glycopolymers label met carboxyfluoresceïne. Na post-modificatie, werden fluorescent polymeren verkregen (Figuur 6). Geen degradatie van de fluoresceïne-gelabelde polymeren in de reactie werd gedetecteerd met behulp van GPC-analyse (data niet getoond). Binding testen van de synthetische glycopolymers met lectine gecoate agaroseparels Om het lectine-bindende specificiteit van het gesynthetiseerde glycopolymers beoordelen, lectine-agarose korrels bekleed met bekende koolhydraat-bindende specificiteit werd gebruikt. Erythrina crista-galli lectine (ECL), toegepast in de experimenten een bindende specificiteit voor β-D-galactoside. Figuur 7A toont dat PMA-LAEMA-Fl duidelijkuorescein, waarbij β-D-galactoside als hanger koolhydraat bevat, vertoonde sterke binding met de ECL lectine. In tegenstelling, de negatieve binding aan de ECL van de glycopolymer PMA-GAEMA-fluoresceïne, die een aanhangende suiker bezit, wordt getoond in Figuur 7B. Dit resultaat illustreert de binding doeltreffendheid en affiniteit van de gesynthetiseerde fluorescente glycopolymer. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" /> Figuur 1. Assigned 1 H- (a) en 13 C-NMR (b) spectra (D 2 O) voor LAEMA. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" /> Figuur 2. Schematische weergave van de synthese van fluorescerende glycopolymer PMA-LAEMA met β-galactoside als hanger suiker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" /> Figuur 3. Assigned 1 H- (A) en 13 C-NMR (B) spectra (D 2 O) voor de PMA-LAEMA glycopolymer. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">Pleidooi</a>se klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" /> Figuur 4. Assigned 1 H- (A) en 13 C-NMR (B) spectra (D 2 O) voor de PMA-GAEMA. (Dit cijfer is aangepast van Wang et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" /> Figuur 5. Gel permeatie chromatografie sporen van RAFT-gebaseerde PMA-GAEMA en PMA-LAEMA bereid met en zonder dat RAFT agens. In tegenstelling tot de PMA-LAEMA bereid zonder RAFT middel (blauw), RAFT-<html> gebaseerd PMA-LAEMA (green) een veel lagere dispersiteit (Mw / Mn). RAFT-gebaseerde PMA-GAEMA (rood) en PMA-LAEMA hebben soortgelijke GPC-profielen, maar de voormalige heeft een kleinere Mn te wijten aan het ontbreken van een hanger suikers. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" /> Figuur 6. PMA-LAEMA vóór en na de post-modificatie met fluorofoor. (A) in vergelijking met witte niet-gelabelde glycopolymer (links tube), fluoresceïne-gelabelde PMA-LAEMA toont een sterke gele kleur (rechts tube). (B) onder UV, ongelabelde PMA-LAEMA (linkerbuis, 1 mg / ml in PBS) donker en weer zonder fluorescentie, terwijl fluoresceïne-gelabelde PMA-LAEMA (rechterbuis, 1 mg / ml in PBS) shows sterke groene fluorescentie.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" /> Figuur 7. Erythrina crista-galli lectine (ECL) gecoate agarose korrels binden β-D-galactoside bevat glycopolymers, en niet die geen tegenhanger suiker bezit. (A) PMA-LAEMA-fluoresceïne (3 ug) toonden sterke binding met ECL , terwijl in (B) PMA-GAEMA-fluoresceïne, die geen tegenhanger β-D-galactoside residu bezit, vertoonde geen binding aan de lectine beklede parels. Schaal bar = 100 micrometer. Tabel 1. Targeting waarden een van synthetische parameters en de feitelijke samenstelling van de glycopolymers. A) Targeting waarden, waarden diegewenst van de produkten; b) DP, polymerisatiegraad; c) NA, niet beschikbaar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody style="vertical-align:middle;text-align:center"><tr><td style="width:120px"></td><td style="width:40px"> DP b </td><td style="width:70px"> Dispersiteit </td><td style="width:120px"> Eigenlijke inhoud van glycomonomers mol% </td><td> Werkelijke gehalte aan primaire amine mol% </td></tr><tr><td> Targeting waarden </td><td> 100 </td><td> &lt;1,3 </td><td> 20 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PMA-LAEMA </td><td> 99 </td><td> 1.26 </td><td> 19 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> PMA-GAEMA </td><td> 89 </td><td> 1.32 </td><td> NA c </td><td> 2.7 </td></tr></tbody></table>

Een efficiënte, driedelige synthese van RAFT-gebaseerde fluorescerende glycopolymeren, bestaande uit glycomonomeervoorbereiding, copolymerisatie en post-modificatie, wordt gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gebruikt om RAFT-gebaseerde statistische glycopolymeren met gewenste structuren te bereiden.

Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

Het algemene doel van deze procedure is de goed gecontroleerde synthese van fluorescerende statistische lineaire glycopolymeren middels reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerisatie. Dit wordt bereikt door eerst het glycomonomeer 2-lactobioethylmethacrylamide, of L-A-E-M-A, te synthetiseren. De tweede stap is het gebruik van RAFT-polymerisatie van L-A-E-M-A, N-(2-aminoethyl)methacrylamide, of AEMA, en N-(2-hydroxyethyl)acrylamide, of HEAA, om het overeenkomstige glycopolymeer met een lage dispersiteit te synthetiseren.Vervolgens wordt het glycopolymeer op een van de primaire amines gemodificeerd door reactie met carboxyfluoresceïne-XSE om een fluoresceïne-gelabeld glycopolymeer te produceren. De laatste stap is het binden van het fluoresceïne-gelabelde glycopolymeer aan lectine-gecoate agarosebeads met een bekende koolhydraatbindingsspecificiteit. Ten slotte wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om de binding van de glycopolymeren aan de agarosebeads te analyseren, waarmee wordt bevestigd dat het glycopolymeer het betreffende koolhydraat bevat en is gelabeld met een fluorescente marker.Het voordeel van RAF-polymerisatie ten opzichte van bestaande methoden die gebruikmaken van conventionele vrije radicalpolymerisaties is dat het RAF-proces een gecontroleerde polymerisatietechniek is die het aantal ketens afgeleid van de initiator minimaliseert. Dit resulteert in polymeren met vooraf bepaalde molecuulgewichten en een zeer smalle polydispersiteitsindex. Polymerisaties kunnen worden toegepast op een gedefinieerd mengsel van monomeren voor de bereiding van specifieke fluorescente glycopolymeren.Deze glycopolymeren hebben gedefinieerde bindingscapaciteiten die geverifieerd kunnen worden met behulp van met lectine gecoate beads. De efficiënte bereiding van fluorescerende glycopolymeren zou in de toekomst van grote waarde moeten zijn voor glycobiologisch onderzoek. Begin met het oplossen van twee gram lactobionzuur in drie milliliter watervrij methanol.Voeg vervolgens langzaam druppelsgewijs absoluut ethanol toe aan de oplossing tot deze net troebel wordt. Gebruik een rotatieverdamper om alle oplosmiddelen te verwijderen. Herhaal dit proces drie keer om 1,94 gram lacto bioo one five lactone te produceren met een opbrengst van 98%.Voeg een oplossing van één gram lactobiolacton in drie milliliter methanol toe aan een oplossing van A EMA en MEHQ in twee milliliter methanol. Voeg vervolgens één milliliter triethylamine toe en roer het mengsel bij kamertemperatuur. Voeg na 48 uur 20 milliliter gedeïoniseerd water toe aan het mengsel en breng dit over naar een rotatieverdamper.Verdampen tot het volledig droog is. Los het residu op in 20 milliliters gedeïoniseerd water en breng de oplossing aan op de bovenkant van een anionenuitwisselingskolom van 10 by 20 millimeter. Plaats een bekerglas met één milligram MEHQ onder de uitlaat en elueer de kolom in het bekerglas.Nadat de oplossing is ingedampt in een rotatieverdamper, wordt het residu opgelost in 20 milliliter gedeïoniseerd water en worden aliquots van één milligram ionenwisselingshars toegevoegd. Dit wordt herhaald totdat een hydraattest negatief is; deze test wordt uitgevoerd door één microliter van de oplossing te verwijderen en aan te brengen op een dunlaagchromatografieplaat. Bespuit de plaat met een 2% anhy-oplossing in ethanol en verhit deze één minuut lang op 90 graden Celsius op een warmteplaat.Het eindpunt is bereikt wanneer er geen blauwe kleur meer ontstaat. Filtreer vervolgens de oplossing door een glazen frittrechter in een reageerbuis. Vries de oplossing in bij -80 °C en breng deze daarna over naar een lyofilisator om te worden gevriesdroogd.Los het residu op in een minimale hoeveelheid methanol en precipiteer het product door toevoeging van watervrije aceton bij min 20 graden Celsius. Verzamel het geprecipiteerde L-A-E-M-A door filtratie via een gesinterde glazen trechter. Verplaats de trechter en het precipitaat naar een vacuümdessicator om te drogen; voeg vervolgens 0,5 gram aluminiumoxide-nanodeeltjes van ongeveer 150 mesh toe aan één milliliter commerciële HEAA in een reageerbuis van twee milliliter.Centrifugeer de buis bij 300 ×g gedurende 30 seconden en gebruik de bovenste laag voorzichtig als inhibitorvrije HEAA. Los 32,8 mg L-A-E-M-A, 1,7 mg a EMA, 27,5 µL inhibitorvrije HEAA en 0,4 mL gedeïoniseerd water op en breng de oplossing over in een goed gereinigde flankbuis van 1 mL. Voeg vervolgens 50 µL RAFT-reagens en 50 µL initiatorreagens toe aan de buis en meng door voorzichtig tegen de zijkant van de buis te tikken terwijl het ventiel gesloten is. Sluit de buis aan op een vacuümlijn en bevries de inhoud met behulp van een bad van droogijs en ethanol.Verlaag vervolgens de buisdruk met een pomp tot circa 50 millitorr en sluit de kraan. Verwijder het droogijsbad en laat de inhoud ontdooien. Herhaal de cyclus van bevriezen, vacuüm trekken en ontdooien zorgvuldig nog twee keer.Inspecteer de buis om er zeker van te zijn dat de inhoud volledig is opgelost en vortex indien nodig voorzichtig. Verwijder vóór het plaatsen de gesloten buis uit de vacuümlijn en plaats deze in een transparante plastic vacuümzak. Zuig de lucht uit de zak met een plastic handpomp.Plaats de zak vervolgens gedurende 24 uur in een afgedekt waterbad bij 70 °C. Haal daarna de buis uit de zak en breng de inhoud over naar een dialysezak met een molecular weight cutoff van 3.500 Daltons. Plaats de dialysezak in een bekerglas en dialyseer gedurende 24 uur tegen twee liter gedeïoniseerd water.Overbreng de inhoud van de dialysezak naar een reageerbuis en plaats deze in een vriezer op -80 °C. Zodra het bevroren is, overbrengt u het naar een lyofilisator en vriesdroogt u het. Om het pluizige witte glycopolymeer PMA LA EMA te verkrijgen, bereidt u eerst een oplossing van 5 mg PMA LA EMA in 0,9 mL PBS.Voeg vervolgens langzaam 0,6 mg carboxyfluoresceïne-isothiocyanaat in 100 µL dimethylformamide toe aan de snel geroerde oplossing in de microtubus en folie, en roer dit langzaam gedurende 16 uur bij kamertemperatuur. Breng de oplossing over in een dialysezak met een molecular weight cutoff van 3.500 Da. Plaats de zak in een bekerglas en dialyseer dit tegen twee liter gedeïoniseerd water gedurende 16 uur, terwijl de zak tegen licht wordt beschermd. Breng de inhoud van de dialysezak over in een reageerbuis.Vriesdroog de oplossing na het invriezen bij -80 °C. Om het pluizige gele fluorescentie-gelabelde P-M-A-L-A-E-M-A glycopolymeer te verkrijgen, worden het getalsgemiddelde molecuulgewicht, het gewichtsgemiddelde molecuulgewicht en de dispersiteit van de glycopolymeren bepaald met een HPLC-systeem. Voeg eerst 1,5 mL PBS toe aan een suspensie van 50 µL erykrista galley lectine-gecoate aro-beads in een centrifugebuis.Centrifuge de buis vervolgens één minuut bij 300 ×g. Verwijder daarna het supernatant en herhaal de wasstap nog twee keer, om vervolgens 0,5 milliliters PBS toe te voegen. Voeg een oplossing van drie micrograms fluoresceïne-gelabelde PMA LA EMA in zes microliters PBS toe aan de buis met de lectine-gecoate beads.Gebruik fluoresceïne-gelabelde P-M-A-G-A-E-M-A als negatieve controle. Wikkel vervolgens de buisjes in aluminiumfolie en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer het buisje gedurende één minuut en verwijder het supernatant.Resuspendeer de beads vervolgens in 1,5 milliliters vers PBS en herhaal het wassen drie keer. Resuspendeer de beads tot slot in 0,2 milliliters PBS. Breng vier microliters van de gesuspendeerde beads over naar een putje van een immunofluorescentiemicroscoop-plaatje en dek deze af met een glasdekglaasje voor registratie.Afbeeldingen van het preparaat met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 10 x objectief, FITC-filter en camera. De glycopolymeren werden geanalyseerd via gelpermeatiechromatografie. Polymeren die zijn gesynthetiseerd zonder gebruik van RAFT vertonen een veel hogere dispersiteit dan polymeren die met behulp van RAFT zijn gemaakt.Wanneer deze met fluoresceïne zijn gelabeld, verandert het fysieke uiterlijk van het glycopolymeer van wit naar een sterke gele kleur onder UV-licht. Een oplossing van niet-gelabeld polymeer blijft donker, terwijl het met fluoresceïne gelabelde polymeer heldergroen oplicht, wat de aanwezigheid van het label bevestigt. Specifieke binding aan met lectine gecoate beads vindt alleen plaats bij polymeren met pendant suikerresiduen; de beads lichten groen op wanneer ze gebonden zijn, terwijl ze donker blijven wanneer ze worden behandeld met polymeren zonder pendant suikerresiduen. Deze raft-gebaseerde polymerisatietechniek biedt grote flexibiliteit in het type glycopolymeren dat gesynthetiseerd kan worden.Vervolglabeling van de glycopolymeren kan ook worden bereikt met een grote verscheidenheid aan fluorescerende reagentia die in staat zijn om in een waterige omgeving met primaire aminen te reageren. Onderzoekers op het gebied van de glycobiologie kunnen deze techniek gebruiken om eenvoudig zeer veelzijdige en gedefinieerde glycopolymeren te verkrijgen. Deze glycopolymeren kunnen worden gebruikt als instrumenten om koolhydraatbindingsspecificiteiten te onderzoeken, zoals die worden waargenomen in de luchtwegen van patiënten met cystische fibrose of die betrokken zijn bij veel soorten menselijke kankers.

facile-efficient-preparation-tri-component-fluorescent-glycopolymers

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hier beschrijven we een unieke strategie voor het maken van biocompatibele, gelaagde matrices met continue interfaces tussen verschillende lagen van tissue engineering. Een dergelijke steiger kan een ideale aanpasbare omgeving te moduleren cel gedrag van verschillende biologische, chemische of mechanische...

Dichtheidsgradiënt Meerlaagse polymerisatie (dGMP): een nieuwe techniek voor het maken van meerdere compartimenten, Aanpasbare Steigers for Tissue Engineering

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema's, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

We presenteren een protocol om snel gigantische polymeervesikels (pGVs) te vormen. In het kort, polymeeroplossingen worden gedehydrateerd op gedroogde agarose-films die op dekglasjes zijn bevestigd. Rehydratie van de polymeerfilms resulteert in een snelle vorming van pGVs. Deze methode brengt de bereiding van synthetische gigantische vesikels voor directe toepassingen in biomimetische studies een grote stap vooruit.

Het vormen van Giant-sized polymeervesicles Met behulp van Gel-geassisteerde Rehydratatie

Dit artikel beschrijft een proces voor het produceren van zelfgeassembleerde polymere nanodeeltjes met behulp van zichtbare licht gemedieerde dispersiepolymerisatie. Het gebruik van zichtbaar licht met lage energie om de polymerisatie te controleren, maakt de reproduceerbare vorming van zelfgeassembleerde worm-achtige micelles mogelijk bij een hoog vast stofgehalte.

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Niet-geroerde precipitatie polymerisatie geeft een snelle, reproduceerbare prototyping aanpak van de synthese van stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) microgels smalle grootteverdeling. In dit protocol synthese, lichtverstrooiing karakterisering en enkel deeltje fluorescentie volgen van deze microgels in een wide-field microscopie setup worden gedemonstreerd.

Gecontroleerde Synthese en Fluorescentie Tracking of Highly Uniform Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

We presenteren een protocol voor de synthese van RGD-gefunctionaliseerde hydrogels als apparaten voor cel- en geneesmiddelafgifte. De procedure omvat koper gekatalyseerde alkyn-azide cycloadditie (CuAAC) tussen alkyn-gemodificeerde polyacrylzuur (PAA) en een RGD-azide-derivaat. De hydrogels worden gevormd met behulp van microgolf-geassisteerde polycondensatie en hun fysisch-chemische eigenschappen worden onderzocht.

De synthese van RGD-gefunctionaliseerde Hydrogels als een instrument voor therapeutische toepassingen

Protocollen zijn beschreven voor de fabrikatie van afbreekbaar thermoresponsive hydrogels op basis van het hydrazon cross-linking van polymere oligomeren op de schaal van de bulk, microscale, en nanoscale, de laatste voorbereiding van zowel de nanofibers als de gel nanodeeltjes.

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

Een protocol voor de synthese en karakterisering van diffuse beweging van cyclische polymeren op de single molecule-niveau wordt gepresenteerd.

Synthese van cyclische polymeren en karakterisering van hun Diffusive Motion in de Smelt staat bij de Single Molecule niveau

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden en te visualiseren secundaire structuren (bijvoorbeeld vezels, toroïdale architecturen en nano- bolletjes) verkregen uit schroeflijnvormige polycarbodiimides. De morfologie gekenmerkt door zowel atomaire kracht microscopie (AFM) en scanning elektronenmicroscopie (SEM) bleek afhankelijk moleculaire structuur, de concentratie en het oplosmiddel van keuze.

Zelf monteren van morfologieën Verkregen uit rechte polycarbodiimide copolymeren en hun triazoolderivaten

Microgelstaven met complementaire reactieve groepen worden geproduceerd via microfluïdica met het vermogen om in waterige oplossing met elkaar te verbinden. De anisometrische microgels binden en verbinden zich tot stabiele constructies met grotere poriën in vergelijking met op bolvormige systemen gebaseerde systemen. Microgels gemodificeerd met GRGDS-PC vormen macroporeuze 3D-constructies die kunnen worden gebruikt voor celkweek.

Onderling verbonden macroporeuze 3D-steigers van Microgel-staven

Leer de efficiënte synthese van fluorescerende glycopolymeren via RAFT-polymerisatie voor glycobiologie-onderzoek. Deze methode produceert polymeren met nauwkeurige moleculaire gewichten en smalle dispersiteit.

Facile en efficiënte voorbereiding van Tri-component Fluorescent Glycopolymers via-VLOT gecontroleerde polymerisatie

Meer video's verkennen