Name: Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer een in vitro methode om endotheelcelhechting te kwantificeren met behulp van fibronectine-gecoate glaasjes en fluorescent gelabelde monocyt. Deze techniek biedt betrouwbare metingen voor vasculair biologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Simon Bouffler zeer dankbaar voor zijn volledige steun en Public Health England voor infrastructurele ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door Public Health England via de National Institute for Health Research (NIHR) subsidie. Dit rapport is een door het NIHR opgedragen werk. De opvattingen die in deze publicatie worden geuit, zijn die van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, NIHR of het Ministerie van Volksgezondheid. De financiers hadden geen rol in de ontwerpstudie, gegevensverzameling en analyse, besluit om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

1. Bereiding van dekglaasjes <ol><li> Steriliseer mm diameter ronde glazen dekglaasjes van 12 weken in 70% ethanol gedurende ten minste 10 minuten onder af en toe roeren tot de totale blootstelling van dekglaasjes de ethanol te garanderen. Giet dekglaasjes en ethanol in een steriele celkweekschaal (hetzij 6 cm of 10 cm diameter). </li><li> Met een paar steriele fijne 5B pincet, pick-up en zet elke individuele glas dekglaasje in een putje van een 24 goed cluster plaat. Let erop dat de dekglaasjes niet raken de wanden van de put en ongeveer in het midden van de put. </li><li> Laat de niet-overdekte 24 goed cluster plaat met dekglaasjes te drogen in de stroom kast. Dit duurt ongeveer 10 minuten </li><li> Gedurende deze periode bereiden bekledingsmengsel door verdunnen 10 mg / ml humaan fibronectine in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met 0,1 mg / ml. </li><li> Wanneer de dekglaasjes droog Pipetteer 100 ul bekledingsoplossing op elk glas coverslip zodat de oplossing heeft alleen betrekking op het glas zonder het bundelen rond de buitenkant van de put. Leg de overdekte 24 goed cluster plaat in een celkweek incubator voor minstens een uur. </li><li> Net voor gebruik, verwijder de coating oplossing. Dezelfde bekledingsoplossing kan worden overgebracht naar een steriele buis en tot maximaal driemaal zonder zichtbare verminderde werkzaamheid. </li></ol> 2. Bereiding van endotheelcellen monolaag <ol><li> Culture humane coronaire endotheelcellen (EC) in medium bij 37 ° C en 5% koolstofdioxide. </li><li> Aspireren off cultuur media en spoel EC monolaag met 10 ml HBSS </li><li> Zuig uit HBSS en voeg 2 ml 0,5% trypsine, 0,2% EDTA-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten. </li><li> Wanneer EC kan worden losgemaakt door een kraan aan de zijkant van de kolf, voeg 5 ml sojaboon trypsine inhibitor en pipet spuiten het oppervlak van de kolf verder los van de cellen. </li><li> Transfer cellen in een 15 ml buis en centrifugeer de buisbij 200 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig uit het supernatant en resuspendeer de pellet EC in 5 ml medium. Tel de cellen met een hemocytometer en pas de cel concentratie tot 50.000 EC per ml van EC media. </li><li> Breng 1 ml van de celsuspensie in elk putje van de 24 wells plaat met beklede dekglaasjes. Incubeer cellen O / N in celkweek incubator bij 37 ° C plus 5% koolstofdioxide. </li><li> De cellen zijn klaar voor gebruik in experimenten wanneer een confluente monolaag wordt gevormd, binnen 3 dagen. </li></ol> 3. Bereiding van monocyten <ol><li> Overdracht HL-60 cellen die zijn gekweekt in RPMI gesupplementeerd met 10% foetaal kalfserum, als suspensiekweek in een 15 ml buis. Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 min. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 5 ml media en pas de celconcentratie met media tot 2.000.000 cellen / ml. Als fluorescentie labeling van de HL-60 wordt gewenst, resuspendeer de cellen in RPMI zonder serum en proceed zoals beschreven in hoofdstuk 4. </li><li> Voeg 0,5 ml van de HL-60 celsuspensie in elk putje van de 24 goed cluster plaat met EC monolaag en incubeer de plaat in een celkweek incubator bij 37 ° C en 5% koolstofdioxide voor een gekozen vaste periode tussen 1 en 3 hr. Weinig verschil is waargenomen tussen 1 uur en 3 uur de tijd-punt, waar de binding verzadiging is bereikt. </li><li> Bereid je voor op cel wassen / oogsten: Vul een 120 ml tube met 100 ml HBSS. Breng 1 ml formaline in elk putje van een nieuwe plaat met 24 putjes. </li><li> Na de incubatieperiode, gebruik dan een paar scherpe pincet en pak de glazen dekglaasje uit de put en houd de dekglaasje verticale en dep de rand van het dekglaasje op een stukje weefsel op de bank voor 3 sec, zorg niet om aan te raken cellen bedekte oppervlak van het dekglaasje met het weefsel. </li><li> Houd het dekglaasje stevig met een pincet, dompel de dekglaasje in en uit de HBSS vijf keer. </li><li> Na de vijfde dunkin HBSS, dep de rand van het dekglaasje op het weefsel gedurende 3 sec. </li><li> Herhaal de dunking en deppen procedures in 3.6 en 3.7 beschreven, waardoor een totaal van drie sets van 5 dunks, gevolgd door een schar. </li><li> Breng de dekglaasje in een putje met 10% formaline om de cellen vast bij kamertemperatuur. Het dekglaasje klaar voor de telling voor langdurige opslag of worden onderworpen aan andere procedures hieronder beschreven. </li></ol> 4. Etikettering van HL-60 cellen met Cell Tracker (optioneel) <ol><li> Tel en overdracht geschikte hoeveelheid HL-60 cellen (bijvoorbeeld 10000000) in een 15 ml centrifugebuis. Centrifuge HL-60 cellen bij 200 g gedurende 5 min. Verwijder supernatant. </li><li> Resuspendeer celpellet in Cell Tracker in RPMI medium zonder serum in een concentratie van 1 miljoen cellen / ml. Incubeer cellen in celkweek incubator gedurende 1 uur. </li><li> Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer celpellet in media tot een concentratie van 2 miljoen cells / ml. </li><li> Voeg 0,5 ml Cell Tracker-gemerkte HL-60 in elk putje endotheelcellen gekweekt op glazen dekglaasje. Doorgaan op 3,3. </li></ol> 5. Opsomming van Adhesive endotheelcellen <ol><li> Mount coverslips op microscoopglaasjes met DAPI contra-vlek individuele cellen te identificeren. </li><li> Met behulp van een omgekeerde microscoop met 4x of 10x objectief verkrijgen afbeeldingen van verschillende gebieden (bijvoorbeeld 5 velden) en tel het hoogste aantal monocyten die aggregeren niet-bestraalde endotheelcellen (Dit zou typisch 3-5). </li><li> Stel het dubbele nummer als de drempel van monocyten op endotheelcellen die worden gedefinieerd als een cluster. Indien gewenst kan een ander criterium gebruikt voor het definiëren van een cluster afhankelijk van de aard van het experiment. </li><li> Tel het aantal clusters en het aantal endotheelcellen in het veld. Verdeel de eerste door de laatste om het percentage hechtmiddel endotheliale cellen te verkrijgen. Partituurtal van gebieden een gemiddelde en standaard deviatie van de tellingen verkregen. </li></ol> 6. Tegenkleuring met Antibodies <ol><li> Na de hechting assay en cellen op het dekglaasje hebben in 10% formaline werden gefixeerd gedurende 15 min bij kamertemperatuur, onderwerpen de dekglaasjes bij immunofluorescentie gebruikt standaardprocedure 10 en antilichamen keuze. </li><li> Toevoegen en verwijderen van de verschillende oplossingen zeer voorzichtig voorkomen losraakt monocyten die zijn aangesloten op endotheelcellen. </li></ol> 7. Tegenkleuring voor senescentie geassocieerde beta-galactosidase Activity <ol><li> Na de hechting assay en cellen op het dekglaasje zijn in formaline werden gefixeerd gedurende 15 min, kleuring voor senescentie geassocieerde beta-galactosidase-activiteit zoals beschreven in de instructies die de kleuringskit gevoegd. Toevoegen en verwijderen van de verschillende oplossingen zeer voorzichtig voorkomen losraakt monocyten die zijn aangesloten op endotheelcellen. </li></ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
<li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li>
<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
<li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li>
<li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li>
<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De monocyt adhesie bovenbeschreven bepaling werd met succes gebruikt in experimenten ontworpen om de biologische effecten van ioniserende straling op endotheliale monolagen 10 bestuderen. Hoewel dit niet de enige methode om de hechting van een endotheel monolaag beoordelen is de enige methode die de kwantificering van de hoeveelheid of het percentage endotheel cellen in een monolaag die kleeflaag. Dit is een belangrijk onderscheid globale kwantitatieve verandering in binding van monocyten, zoals gemeten door andere methoden kunnen worden toegeschreven hetzij een algemene toename kleverigheid van alle cellen van het endotheel monolaag of de toename kleverigheid van een subpopulatie van endotheelcellen binnen de monolaag, zoals in het bovenstaande voorbeeld. De waarde van het hebben van deze gegevens wordt geïllustreerd door het feit dat de mogelijkheid om het percentage van endotheliale cellen die verbeterde hechting vertoonden kwantificeren na bestraling tot de ineskunnen concluderen dat dit effect niet te wijten aan genetische mutatie van een bepaald gen als het percentage cellen die lijm was werden zeer hoger (meer dan 1000 maal), hetgeen door willekeurige mutatie van een gen verwacht zou worden door röntgenstraling bij die dosis . De factor die goede reproduceerbaarheid van de resultaten mogelijk is het regime wassen. Aangezien het wassen omvat het onderdompelen van de glazen dekglaasje in de wasbuffer, gevolgd door deppen op een weefsel wordt variabiliteit in de buffer turbulentie die onvermijdelijk gevolg is van de oude methode pipetteren van de wasbuffer in een put vermeden. Inderdaad was de observatie van buitensporige variabiliteit tussen replicaten verkregen volgens de methode die wij pipetteren gedwongen een wasprocedure die de variabiliteit element uit de wasstap bedenken. Toegegeven, de beperkingen van deze test liggen in de noodzaak van handmatige telling van monocyten clusters, die n doenot laat het worden aangepast voor high throughput analyse. Ten tweede, de beslissing over hoeveel monocyten vormen een cluster moet semi-willekeurig worden bepaald en het niveau te hoog ingesteld worden en leiden tot uitsluiting van een aantal echte clusters. Het ontbreken van dwarskracht in deze werkwijze kan ook worden gezien als een beperking in experimenten waarbij grove verbeterde hechting van endotheelcellen wordt geïnduceerd (bijv + TNFa). In andere gevallen echter, het gebrek aan afschuifkracht is een voordeel aangezien het de detectie van minder overdreven vergroting van kleverigheid. Bescheiden toename monocyten hechtvermogen kan bijzonder belangrijk en relevant zijn. In vivo, monocyten niet (in een typisch experimentele tijd) verwachting te bevestigen in grote aantallen endotheelcellen met een bescheiden toename van kleverigheid, grotendeels te wijten aan afschuifkracht. Mettertijd echter een aantal monocyten zou waarschijnlijk, en dit is eerder het milieu van chronische ontsteking vertegenwoordigen. Zoals,afwezigheid van afschuifkracht kan een voordeel zijn omdat het de mogelijkheid voor kleine toename in endotheelcellen hechting worden geopenbaard in experimentele tijdframes die kenmerkend kort mogelijk te vluchtig om bescheiden toename kleverigheid onder schuifspanning worden waargenomen zijn. Het vermogen om de cellen na deze assay overige analyses zoals senescentie assay en immunofluorescentiekleuring onderwerpen vergroot de bruikbaarheid van deze werkwijze het mogelijk is bij hechting van specifieke endotheelcellen bepaalde cellulaire eiwitten of cellulaire toestanden zoals hierboven is aangetoond, een eigenschap die is niet beschikbaar bij de oudere hechting assays. Deze methode is gebruikt met EST2 geïmmortaliseerde humane coronaire endotheelcellen en vergelijkbare resultaten werden ook verkregen met primaire humane coronaire endotheelcellen 10, waaruit blijkt dat het niet specifiek voor alleen een bepaalde cellijn. Ook de adoption van deze wijze van testen van hechting van endotheelcellen niet uitsluiten onderwerpen dezelfde cellen op de standaard adhesietest die fluorescentie van gemerkte immunocyten meet. Samen dit verslag blijkt dat deze methode is veelzijdig, inclusief en levert veel meer informatie dan de standaard adhesietest.

Infiltratie van immuuncellen zoals monocyten over de endotheliale cellaag die lijn bloedvaten is een belangrijke stap in het proces van ontsteking 1. Hierdoor kan de homing van immuuncellen (immunocyten) een plaats van letsel. In andere gevallen en locaties, zoals de kransslagader en halsslagader, kan infiltratie van monocyten door de endotheliale laag tot ongewenste langdurige verblijf van deze cellen in de wand van de slagader, kan leiden tot de vorming van plaques 2. In alle gevallen van immunocyt infiltratie, de eerste stap is de activering van de endotheelcellen in een gelokaliseerd gebied van het bloedvat. Endotheelcellen worden geactiveerd door pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-6 tot expressie van celoppervlakte-eiwitten zoals VCAM, ICAM en E-selectine waarmee het aannemen en bevestiging van de immunocyten op het endotheelceloppervlak 3- vergemakkelijken vergroten 6. 7 endotheliale uitgevoerd. De beperkingen van deze techniek in termen van nauwkeurigheid geleid tot het gebruik van radioactief gemerkte lymfocyten of monocyten, gevolgd door kwantificeren van radioactieve stoffen, die overeenkomt met lymfocyten of monocyten adhesie 4. Deze methode werd uiteindelijk vervangen door een fluorescentie gebaseerde methode, waarbij immunocyten plaats werden gelabeld met fluorescentie kleurstof en onderworpen aan dezelfde procedure als hierboven met het verschil dat in plaats fluorescentie radioactiviteit wordt gemeten 8. Momenteel is deze methode heeft ontpopt als de meest handige en in kit-vorm wordt verkocht door een aantal commerciële leveranciers. Hoewel dit assay daaraan gekoppelde hechting tussen de controles en experimentele monsters kunnen meten, is het niet bekend of er een verandering in fluorescentie wordt veroorzaakt door een gelijkmatige verandering kleverigheid over de gehele endothelial celpopulatie of als de verandering wordt veroorzaakt door een verschil van kleverigheid bij een subpopulatie van cellen. Het is ook duidelijk dat de stringentie van wassen oefent een grote invloed op het resultaat, en nog belangrijker, wordt de uniformiteit van het afspoelen ongebonden monocyten tussen verschillende endotheliale monolagen grote invloed op de mate waarin de resultaten van de herhalingen en de reproduceerbaarheid van de resultaten tussen monsters . Recenter verschillende systemen monocyten pomp in media in een monolaag van endotheelcellen werden gebruikt om dit probleem aan te pakken 9. Bovendien zijn deze stromingssystemen het effect van dwarskracht op de endotheliale cellen recapituleren ook. Hoewel de voordelen van dergelijke systemen duidelijk en zeer aantrekkelijk, is het ook belangrijk te beseffen dat hoewel kan endotheelcel hechting sterk worden uitgebreid, zoals het geval is bij acute ontsteking, door factoren zoals TNFa, andere activatoren, zoals ioniserende straling 10 Elicit verandert thoed zijn niet gemakkelijk gedetecteerd binnen in vitro experimentele termijnen die door deze zeer strenge systemen. Hoewel zulke kleine veranderingen van endotheelcellen kleverigheid gemakkelijk gemist of verworpen in vitro, het niet noodzakelijkerwijs goedaardig in vivo, wanneer deze kleine veranderingen binnen levenstijd, die kenmerkend is voor chronische ontsteking, zijn indrukwekkende resultaten oefenen. Vandaar dat een robuuste en gevoelige en specifieke methode voor het opsporen en meten van endotheelcellen kleverigheid vereist. Hier melden wij een methode om de hechting van endotheelcellen direct te meten. Deze methode is niet afhankelijk van fluorescentiemeting als indirecte surrogaat indicator van endotheelcellen hechting. Het onthult of veranderingen in hechting zijn te wijten aan een uniforme verandering in alle cellen of beperkt tot een sub-populatie. Bovendien maakt co-kleuring van endotheliale cellen met markers zoals senescentie-geassocieerde beta-galactosidase, cellevensvatbaarheid marker, Calcien AM en antilichamen tegen het celoppervlak en intracellulaire eiwitten, waardoor de vereniging van individuele lijm endotheelcellen bepaalde cel staten of expressie van specifieke eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips Round 12 mm Diameter</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-well cluster plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media</td><td>Cell Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Assay kit&nbsp;&nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van endotheelcellen hechtvermogen<em&gt; in vitro</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Eén van de kardinale processen van ontsteking de infiltratie van immuuncellen uit de lumen van het bloedvat aan het omringende weefsel. Dit gebeurt wanneer endotheelcellen die lijn bloedvaten, wordt kleefmiddel circulerende immuuncellen zoals monocyten. In vitro meting van deze hechting is tot nu toe gedaan door het kwantificeren van het totale aantal monocyten die voldoen aan een endotheel laag hetzij als direct count of indirecte meting van de fluorescentie van hechtende monocyten. Hoewel dergelijke metingen geven de gemiddelde kleverigheid van het endotheel celpopulatie, zijn ze verstoord door een aantal factoren, zoals het aantal cellen, en kan de hoeveelheid endotheelcellen die eigenlijk lijm niet bekend. Hier beschrijven wij en tonen een methode die de opsomming van lijm cellen mogelijk maakt binnen een geteste populatie van endotheelcellen monolaag. Endotheliale cellen worden gekweekt op dekglaasjes en volgende gewenstebehandeling uitgedaagd met monocyten (die kunnen fluorescerend worden gemerkt). Na incubatie van een spoelprocedure, waarbij meerdere ronden van onderdompeling en drainage worden de cellen gefixeerd. Adhesive endotheelcellen, die worden omgeven door monocyten worden gemakkelijk geïdentificeerd en opgesomd, waardoor een adhesie index die het werkelijke percentage van endotheliale cellen in de populatie dat hechtmiddel zijn openbaart.

Deze methode maakt de detectie van afzonderlijke kleefstof endotheliale cellen in een populatie. Bijvoorbeeld, terwijl een monolaag uit niet-bestraalde endotheelcellen vastgehouden sporadisch HL-60 monocyten na incubatie en wassen, endothele monolaag op 7 dagen post-10Gy bestraling vóór incubatie met monocyten werden gebonden aan monocyten in clusters rond afzonderlijke endotheelcellen ( Figuur 1). Hoewel dit fenomeen is gemakkelijk waarneembaar onder fase contrast microscopie, fluorescentie microscopie onthult een nog duidelijker beeld van de monocyten clusters. Na het uitvoeren van de beschreven adhesietest, is het mogelijk over te gaan tot het kleuren van de cellen voor membraan cytoplasmatische of nucleaire (figuur 2) proteïnen onder toepassing van geschikte antilichamen met standaard immunofluorescentie werkwijzen. Verder kunnen enzymen gebaseerde assay zoals senescentie geassocieerde beta-galactosidase (Figuur 3) ook worden performed. Aangezien elke monocyten cluster komt overeen met een afzonderlijke endotheelcellen, zal opsomming van de clusters het werkelijke aantal kleefstof endotheliale cellen in de monolaag zichtbaar (figuur 4), en derhalve het percentage hechtmiddel endotheliale cellen in de populatie (Tabel 1, figuur 6) . Dit is de enige methode om de datum dat een dergelijke kwantificering van endotheelcellen hechting mogelijk maakt. Het is opmerkelijk dat de endotheliale cellen in de experimenten hier contactloos geremd en niet in aantal toenemen na het bereiken van confluentie. Dit elimineert de mogelijke complexiteit veroorzaakt door verhoogd aantal endotheelcellen op latere tijdstippen. Desgewenst kan monocyten bevestigd aan endotheliale monolagen worden losgemaakt met 0,5% trypsine-EDTA-oplossing 0,2% (in plaats van fixatie in 3,9) en de fluorescentie gemeten met een plaatlezer, zoals het geval is in de hedendaagse werkwijzen (figuur 5). </p&gt; <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figuur 1. hechting van monocyten aan monolaag van endotheelcellen. On un-bestraalde endotheelcellen, monocyten gehecht als individuele cellen in een sporadische willekeurige wijze (linker panelen) en in clusters op afzonderlijke endotheelcellen van de 7 dagen na 10 Gy bestraald monolaag (rechts panelen). Onderste panelen zijn fluorescentie beelden van de top panelen, bevestigd dat de kleine en lichte sferische cellen zichtbaar onder fasecontrast zijn inderdaad monocyten die werden pre-gelabeld met Cell-Tracker Green. Enkele monocyt clusters zijn aangegeven met witte pijlen. Beelden werden genomen met behulp van een 10x objectief. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <html><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figuur 2. Kleuring van endotheliale cellen voor eiwitten na adhesietest. Na het uitvoeren van de beschreven adhesietest, cellen op dekglaasjes werden onderworpen aan immunofluorescentie voor de detectie van (A) membraaneiwit (CD44), b) cytoplasmatische eiwit (tubuline) of c) kerneiwit (γ-H2AX). Links panelen van (A) en (B) (gezien met 20X objectieve) tonen monocyten pre-gelabeld met Cell de soortgelijke afbeelding rechts panelen Tracker Green en onthullen CD44 en microtubules (rood) en DAPI-gekleurde kernen (blauw). Witte pijlen in (C) punt om bestraalde endotheliale celkernen die werden gekleurd met antilichamen tegen γ-H2AX. Monocyt kernen die helderder blauw zijn gekleurd met DAPI worden gemakkelijk onderscheiden van de ovale nuclei van de endotheelcellen. Beelden werden genomen met 20X objectief.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figuur 3. senescentie-geassocieerde beta-galactosidase kleuring van endotheelcellen. Na adhesietest cellen op dekglaasjes werden onderworpen aan kleuring voor senescentie geassocieerde beta-galactosidase waardoor lysosomen van verouderde cellen naar blauw, zoals blijkt uit de endotheelcellen die selectief door talrijke monocyten, die gemakkelijk geïdentificeerd gebonden door hun kleine afmetingen en bolvorm. Afbeelding gezien door 20X objectief. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Bepaling van het aantal monocyten clusters op individuele endotheelcellen. Na hechting assay, beelden van de cellen werden genomen uit verschillende posities en monocyten clusters geïdentificeerd en omcirkeld (in het groen). Een cluster werd gedefinieerd als een agglomeratie van 10 of meer monocyten op endotheelcellen. Het aantal monocyten clusters en het aantal van 12 dagen post-bestraalde endotheelcellen (Dotted in rood) in het beeld werden geteld en het percentage van adherente endotheelcellen berekend als aangegeven in tabel 1. Image genomen door de 10x doelstelling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figuur 5. Kwantificering van fluorescentie van hechtende monocyten. Na adhe<html> sie assay cellen op dekglaasjes werden getrypsiniseerd en de fluorescentie van monocyten gelabelde met CellTracker Green werd gemeten onder toepassing van een fluorescentie plaatlezer, als een indirecte indicator van de kleverigheid van het endotheel monolaag. De resultaten van dergelijke metingen op vaste dagen na de bestraling werden verkregen en gevlochten op de bovenstaande grafiek. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figuur 6. Weergave van adhesietest scores Tabel 1. Zelfklevende endotheelcellen in vijf verschillende locaties op drie dekglaasjes werden beoordeeld zoals beschreven in figuur 4 en de bovenstaande resultaten blijkt dat 12 dagen na 10 Gy bestraling 8-10 procent van bestraalde getabelleerd endotheelcellen werd lijm. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Percentage van de lijm endotheelcellen </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Veld 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Veld 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Veld 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Veld 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Field 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Gemiddelde </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. adhesietest scores. Adhesive endotheelcellen in vijf verschillende locaties op drie dekglaasjes werden beoordeeld zoals beschreven in Figure 4 en de bovenstaande resultaten blijkt dat 12 dagen na 10 Gy bestraling 8-10 procent van bestraalde endotheelcellen werd lijm getabelleerd.

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Het algemene doel van deze procedure is om de adhesiviteit van endotheelcellen in vitro te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst met fibronectine gecoate dekglasplaatjes voor te bereiden in een 24-wells clusterplaat. Menselijke endotheelcellen uit de kransslagader worden vervolgens op de glazen dekglasplaatjes aangebracht en geïncubeerd totdat er een confluente monolaag van endotheelcellen is gevormd.Na toediening van de gewenste behandeling aan de endotheelcellen werden fluorescentie-gelabelde monocyten toegevoegd aan de glazen dekglasjes en geïncubeerd met de endotheelcellaag. De laatste stap is het verwijderen van niet-gebonden monocyten uit de endotheellaag door middel van een zorgvuldige procedure van het dompelen en wassen van de dekglasjes. Uiteindelijk maakt deze methode het mogelijk om het percentage van een endotheelcelpopulatie te kwantificeren dat adhesief is na een specifieke behandeling.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het werkelijke aantal of percentage adhesieve endotheelcellen meet, in tegenstelling tot de algemene kleverigheid van een endotheelmonolaag zoals gemeten met alle huidige methoden. We kwamen op het idee voor deze methode toen we probeerden de ADI's van endotheelcellen te meten met de momenteel beschikbare methoden en stuiten op een onacceptabel grote variatie in de resultaten als gevolg van technische uitdagingen die inherent zijn aan deze methoden. Gesteriliseerde ronde glazen dekglasjes met een diameter van 12 millimeter door ze gedurende ten minste 10 minuten in 70% ethanol te laten weken, met af en toe schudden om volledige blootstelling van alle dekglasjes aan de ethanol te garanderen.Breng vervolgens alle glazen dekglasjes en de ethanol met een steriele fijne 5B-pincet over in een steriele celkweekschaal. Pak elk afzonderlijk glazen dekglasje op en plaats dit in een well van een 24-wells clusterplaat. Zorg ervoor dat de dekglasjes de wand van de well niet raken en zich ongeveer in het midden van de well bevinden; laat de 24-wells clusterplaat met de glazen dekglasjes drogen in de laminaire flowkast.Dit duurt ongeveer 10 minuten. Wanneer de dekglasjes droog zijn, breng ik 100 µL coatingoplossing aan op elk dekglasje, zodanig dat de oplossing alleen het glas bedekt zonder over de rand van de well te lopen. Plaats de clusterplaat met 24 wells en de bedekte dekglasjes gedurende ten minste een uur in een celkweekincubator.Kweek menselijke endotheelcellen van de kransslagader in medium bij 37 °C en 5% CO2. Aspireer het cultuurmedium en spoel de endotheelcelmonolaag met 10 mL Hank's balanced salt solution of HBSS. Aspireer vervolgens de HBSS en voeg 2 mL 0,5% tripsine in 0,2% EDTA-oplossing toe. Incubeer dit bij kamertemperatuur gedurende ongeveer vijf minuten, waarna de endotheelcellen losgemaakt kunnen worden door tegen de zijkant van de kolf te tikken. Voeg 5 mL soja-trypsine-inhibitor toe over het oppervlak van de kolf. Om de cellen verder los te maken, worden de cellen overgebracht naar een 15 mL buis en gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Aspireer het supernatant en resuspendeer de endotheelpellet in 5 mL medium.Tel de cellen met een hemocytometer en pas de celconcentratie aan naar 50, 000 endotheliale cellen per milliliter medium. Verdeel één milliliter van de celsuspensie over elke put van de 24-wells plaat met gecoate glazen dekglasjes en incubeer de cellen gedurende de nacht in een celkweekincubator bij 37 °C plus 5% CO2. De cellen zijn nu gereed voor de gewenste behandeling.Wanneer er binnen drie dagen een confluente monolaag is gevormd, worden HL 60-cellen, gekweekt in RPMI aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, overgebracht naar een buis van 15 milliliter en gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de cellen in vijf milliliter serumvrij medium voor fluorescentielabeling van de HL 60-cellen. Tel de cellen en breng de juiste hoeveelheid over naar een centrifugebuis van 15 milliliter.Centrifugeer de cellen bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder na afloop het supernatant en resuspendeer de celpellet in cell tracker in ons PMI-medium zonder serum. Incubeer de cellen bij een concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter gedurende één uur in de celkweekincubator. Centrifugeer de cellen na incubatie bij 200 ×g gedurende vijf minuten en gooi het supernatant weg.Suspendeer de celpel in medium tot een concentratie van 2 miljoen cellen per milliliter. Voeg één milliliter van de met cell tracker gelabelde HL 60 cel-suspensie toe aan elke put van de 24-put clusterplaat die de endotheelcelmonolaag bevat en incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende een gekozen vaste periode van één tot drie uur. Gebruik na de incubatieperiode een fijne 5B pincet om het glazen dekglas uit de put te tillen, waarbij u alleen de buitenrand van het dekglas vastpakt en de rand van het dekglas aftikt.Plaats het dekglas gedurende drie seconden op een stukje weefselpapier op de werkbank. Houd het dekglas stevig vast met een pincet en zorg ervoor dat het weefselpapier het oppervlak waarop de cellen zich bevinden niet raakt. Dompel het dekglas vijf keer in en uit de HBSS.Dep de rand van het dekglas met HBSS. Schuif het weefsel drie seconden lang over het glas. Herhaal de dompel- en depprocedures voor in totaal drie series van vijf keer dompelen gevolgd door een depbeurt.Breng vervolgens het dekglas over naar een putje met Tencent-formule om de cellen bij kamertemperatuur te fixeren. Het dekglas is nu klaar voor telling, langdurige bewaring of voor tegenkleuring met antilichamen of senescence-geassocieerde bèta-galactosidase-activiteit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de adhesieve endotheelcellen te tellen, worden de dekglazen op microscopieglaasjes gemonteerd met DPI-tegenkleuring om individuele cellen te identificeren met behulp van een omgekeerde microscoop met een 4x of 10x objectief. Leg afbeeldingen van meerdere velden vast en tel het hoogste aantal monocyten dat aggregeert op niet-bestraalde endotheelcellen.Stel, indien nodig, het dubbele van dit aantal in als drempelwaarde voor het aantal monocyten op een endotheelcel om deze als een cluster te definiëren. Afhankelijk van de aard van het experiment kan een ander criterium worden gebruikt om een cluster te definiëren. Tel het aantal clusters en het aantal endotheelcellen in het gezichtsveld.Deel het formulier door de laatste waarde om het percentage adhesieve endotheelcellen te verkrijgen. Score meerdere velden om een gemiddelde en standaarddeviatie van de tellingen te bepalen. Endotheelmonolagen zeven dagen na grijze straling, voorafgaand aan incubatie met monocyten, vertoonden binding van monocyten in clusters rond individuele endotheelcellen.Hoewel dit fenomeen gemakkelijk waarneembaar is onder fasecontrastmicroscopie, onthult fluorescentiemicroscopie een nog duidelijker beeld van de monocytenclusters. Na het uitvoeren van de beschreven ADI-assay is het mogelijk om over te gaan tot het kleuren van de cellen voor membraan-, cytoplasmatische of nucleaire eiwitten met behulp van geschikte antilichamen. Let bij standaard immunofluorescentiemethoden goed op de wasstappen, aangezien overmatige kracht de monocyten kan losmaken.Daarnaast kunnen enzymgebaseerde assays, zoals senescence-geassocieerde bèta-galactosidase, worden uitgevoerd. Hierdoor kleuren lysosomen van senescente cellen blauw, zoals duidelijk zichtbaar is in de endotheelcel die selectief is gebonden door talrijke monocyten, die worden geïdentificeerd aan hun kleine omvang en sferische vorm. Aangezien elke monocytcluster correspondeert met een individuele endotheelcel, onthult de telling van de clusters het werkelijke aantal adhesieve endotheelcellen binnen de monolayer en dus het percentage adhesieve endotheelcellen binnen de populatie.Dit is tot op heden de enige methode die, indien gewenst, kwantificering van de adhesiviteit van endotheelcellen mogelijk maakt. Monocyten die gehecht zijn aan endotheelmonolagen kunnen worden losgemaakt met een trypsine-EDTA-oplossing, waarna de fluorescentie kan worden gemeten met een plaatlezer, zoals gebruikelijk is bij hedendaagse methoden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in vier uur worden uitgevoerd met zeer weinig actieve tijd. Het is belangrijk om te onthouden dat alle was- en dompelstappen op een identieke wijze en met hetzelfde aantal herhalingen tussen alle monsters moeten worden uitgevoerd volgens deze procedure.Andere methoden, zoals immunofluorescentie en assays voor senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de kenmerken zijn van adhesieve endotheelcellen in vergelijking met cellen die niet adhesief zijn.

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol is een eenvoudige bacteriële hechting test die bestaat in het tellen van de aantallen van bacteriële kolonievormende eenheden die in acht worden genomen op gekweekte cellen. De test is robuust, onafhankelijk van de adhesine bestudeerd en er zijn ontelbare variaties gebruikt in de meeste laboratoria werken aan bacteriële pathogenese.

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

In this video, we demonstrate an assay utilizing fluorescence microscopy to detect the adhesion of cancer cells to neutrophil extracellular traps (NETs). In the test wells, there is a notable increase in the number of fluorescently labeled cancer cells adhering to NETs, whereas wells treated with DNase exhibit reduced cancer cell adhesion to NETs.

In Vitro Adhesion Assay to Detect the Adherence of Cancer Cells to Neutrophil Extracellular Traps

Neutrofielaanhechting aan de geactiveerde endotheel op plaatsen van infectie is een integraal onderdeel van de gastheer ontstekingsreactie. Beschreven in dit rapport is een neutrofiel binding assay die het mogelijk maakt voor...

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

Leukocyten rekrutering naar de lever plaatsvindt binnen de gespecialiseerde kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door unieke lever sinusoïdale endotheelcellen. Fasecontrastmicroscopie van werving leukocyten over humane lever sinusvormige endotheel onder omstandigheden van fysiologische shear stress kan de ontrafeling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces te vergemakkelijken.

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.

Human Neutrophil Flow Kamer adhesietest

Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.

Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet

Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.

Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties

Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

Dynamische wrijvingscoëfficiënt van immune cellen aan de vaatwand is een voorwaarde voor gut homing. Hier presenteren we een protocol voor een functionele in vitro assay voor de analyse van de impact van anti-integrine antilichamen, chemokines of andere factoren op de dynamische cel adhesie van menselijke cellen, met addressin beklede haarvaten.

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Leer een in vitro methode om endotheelcelhechting te kwantificeren met behulp van fibronectine-gecoate glaasjes en fluorescent gelabelde monocyt. Deze techniek biedt betrouwbare metingen voor vasculair biologieonderzoek.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen

Meer video's verkennen