Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Het algemene doel van deze procedure is om de uitlezing van digitale druppelassays te vereenvoudigen door gebruik te maken van een conventioneel realtime PCR-instrument om de bulkfluorescentie van de assay te meten. Dit wordt bereikt door eerst amplificatiereacties van de monsters van belang en twee standaarden voor te bereiden, en vervolgens druppels te vormen om elk monster te partitioneren in duizenden nanoliter-grote reactoren. De tweede stap is het incuberen van de druppels om de nucleïnezuren binnen elke druppel te amplificeren.

Vervolgens wordt de bulkfluorescentie van elk monster of elke standaard gemeten met een standaard QPC of thermocycler. De laatste stap is het voorspellen van de fractie fluorescerende druppels in de monsters van belang met behulp van een standaardcurve die is gegenereerd uit de standaardmonsters. Om de prestaties van deze methode te verifiëren, kan fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om de kwantificatieprestaties van de bulkfluorescentie-assay onafhankelijk te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals druppeltelling, is dat er geen gespecialiseerde instrumentatie vereist is. Voordat u start met deze assay-procedure, zijn alle noodzakelijke reagentia zoals beschreven in de protocoltekst en twee standaarden vereist. Ten eerste een controle zonder template, zoals nucleasevrij water, en ten tweede een hoge templateconcentratie, zoals lambda-DNA. Denatureer 3,3 µL van elke standaard met 3,3 µL denaturatiebuffer in een qPCR-buis.

Incubeer dit drie minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie van elk monster met 3,3 µL neutralisatiebuffer. Denatureer op dezelfde wijze 3,3 µL van het template van belang met 3,3 µL denaturatiebuffer door dit drie minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Stop de reactie met 3,3 µL neutralisatiebuffer. Bereid 11 µL master mix per monster voor om het aantal fout-positieven te verminderen. Stel de master mix bloot aan UV-licht voordat de druppels worden gevormd.

Bereid eerst 10 µL premix-mengsel per monster voor in een heldere buis van 0,5 mL of 1,5 mL op ijs. Het premix-mengsel bestaat uit gerandomiseerde oligo, B-S-A-D-N-A polymerase reactiebuffer, dn, NTP's en nucleasevrij water. Plaats de buis in water op ijs en stel deze bloot aan UV-licht na de UV-blootstelling.

Voeg A-D-S-D-N-A bindende kleurstof en referentiedieet toe aan het premix-mengsel. Voeg PHI 29 DNA polymerase als laatste toe om te voorkomen dat het polymerase pH-waarden tegenkomt die veel hoger of lager zijn dan 7,5. Meng goed; combineer 10 µL gedenatureerde template of standaard met 10 µL van het master-mengsel en meng goed.

Aangezien druppels zeer gevoelig kunnen zijn voor statische elektriciteit en schuifspanning, dient de experimentator kleding te verwijderen die statische elektriciteit kan veroorzaken en zichzelf te aarden voordat de druppels worden gevormd. Het microfluïdische apparaat dat voor deze demonstratie is gebruikt, is intern geproduceerd en beschikt over een olie-inlaat en twee waterige inlate met een flow-focusing junctie voor het genereren van druppels. Gebruik twee spuitpompen om de stroomsnelheden van 55 µL olie met surfactant en 20 µL reactiemengsel door de microfluïdische chip te regelen.

Om druppeltjes van 20.001 nanoliter te genereren, is een van de moeilijkste stappen het opvangen van de druppeltjes zonder de emulsie te verstoren. Het is belangrijk om langzaam te pipetteren en bij voorkeur een brede tip te gebruiken.

Verzamel alle druppels in PCR-buisjes voor elk monster. Pipetteer 30 µL olie met een wide-bore tip en zeer langzaam in nieuwe PCR-buisjes met optische dopjes. Breng 20 µL druppels bovenop de olie over.

Consistente volumes zorgen ervoor dat de assay zo nauwkeurig mogelijk is. Sluit de dopjes van de buisjes stevig af, aangezien losse dopjes verdamping van de olie kunnen veroorzaken; hanteer buisjes met emulsie aan de bovenkant van de buis, zo ver mogelijk verwijderd van de emulsie. Een PCR-thermocycler, A-Q-P-C-R-thermocycler of een warmteplaat kan worden gebruikt voor isotherme amplificatie.

Een A-Q-P-C-R thermocycler wordt in deze demonstratie gebruikt. Incubeer de monsters gedurende zeven uur bij 30 °C en inactiveer gedurende één minuut bij 75 °C. Direct na de reactie en activatie.

Meet de fluorescentieniveaus voor alle monsters met behulp van de qPCR-thermocycler. Deel voor elk monster de fluorescentie-intensiteit van de dsDNA-bindende kleurstof door de fluorescentie-intensiteit van de referentiekleurstof.

Trek de achtergrondfluorescentie of de genormaliseerde fluorescentie van de controle zonder template af van alle monsters. Maak een lineaire standaardcurve met de gecorrigeerde fluorescentiemetingen van de standaarden. De controle zonder template representeert de fluorescentie voor een monster met 0% fluorescerende druppels en de hoge templateconcentratie.

Fluorescentiemeting is de verwachte fluorescentie voor een monster met 100% fluorescerende druppeltjes met behulp van de overeenkomstige standaardcurve. Voorspel de tussenliggende ratio's van positieve en negatieve druppeltjes op basis van hun bulkfluorescentie. Deze methode maakt gebruik van een conventioneel real-time PCR-instrument om de bulkfluorescentie van digitale assays op basis van druppeltjes te meten.

Fluorescerende en niet-fluorescerende druppels werden in verschillende verhoudingen vooraf gemengd en er werd een vergelijking gemaakt tussen de bulkfluorescentie en het aandeel positieve druppels. Zoals verwacht schalen de bulkfluorescentie en de aantallen positieve druppels lineair met de inputfractie van fluorescerende druppels. De voorspelde verhoudingen op basis van standaarden werden vergeleken met de verwachte fluorescerende inputfracties.

De lijn geeft de verwachte waarde aan bij een lineair verband. De resultaten tonen een goede prestatie bij de kwantificering van de druppelratio over twee logaritmische ordes van het dynamische bereik. Om deze methode te testen in een echte kwantitatieve whole genome amplification-assay, werden fluorescentieniveaus en fracties positieve druppels van een digitale druppel bepaald.

MDA-assays werden gemeten met toenemende concentraties van template Lambda DNA. De lijn geeft de verwachte fluorescerende fractie aan, waarbij de Poisson-verdeling is gebruikt om de gegevens van het experiment te modelleren. Representatieve fluorescentiebeelden van de druppels worden getoond; zowel de bulkfluorescentie als de positieve druppelfractie van de digitale MDA-monsters schalen zoals verwacht met de gemiddelde hoeveelheid template per druppel, wat aangeeft dat de bulkmeting het resultaat van een digitale assay getrouw kan vastleggen.

Deze methode kan andere digitale assays, zoals digitale PCR, ten goede komen door de uitlezing van de assay te versnellen, te parallelliseren en te vereenvoudigen.