Name: Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer mini-osmotische pompen implanteren en tract tracers toedienen om hersenconnectiviteit te bestuderen. Deze methode ondersteunt neurorestoratief onderzoek naar therapeutische effecten op het centrale zenuwstelsel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Dr. Werner Jackstädt Stichting (aan Eduardo Sanchez-Mendoza), de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD; aan Jeismar Carballo), de Duitse Onderzoeksraad (HE3173/2-1, HE3173/2-2 en HE3173/3-1; aan Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Stichting (aan Dirk M. Hermann).

Dierproeven werden uitgevoerd met goedkeuring van de regering (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 en G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) gebaseerd op NIH Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren. 1. Voorbereiding van de mini-osmotische pompen <ol><li> In een steriele omgeving (bijv., Celkweek kap), verkrijgen de pomp katheter stromingsmoderator, hersenen infusiecanule en de afstandhouder schijven te gebruiken (Figuur 1). </li><li> Voor levering van medicijnen direct in de ventrikels gebruik een vulring zodat alleen de punt van de punctienaald in contact is met het ventrikel. Houd de canule ondersteboven met een pincet. Voeg twee druppels cyanoacrylaat lijm (CA) en de invoering van één afstandhouder disc. </li><li> Laat de canule op een plat oppervlak naar boven, zodat de lijm tussen de vulring en de canule droogt. </li><li> Snijd de katheter in secties van ongeveer 2,5 cm. </li><li> Voor each pomp stelt een minimum van 300-350 pl van de oplossing van belang deze is nodig om de pomp waardoor alle lucht extruderen volledig vullen erin om de vorming van belletjes in de katheter te voorkomen. Bubbles zal de stroom van het belemmeren oplossing in de hersenen. </li><li> Sluit de katheter zorgvuldig om de stroom moderator. </li><li> Met behulp van een 2 ml spuit verbonden met de naald door de herseninfusiekit, vul de pomp tot een kleine hoeveelheid oplossing ontsnapt de pomp, waardoor luchtbellen voorkomen erin. </li><li> Vul zorgvuldig de stroom moderator en katheter met aandacht voor eventuele luchtbellen die nog in de katheter te voorkomen. </li><li> Introduceren de stroom moderator in de pomp. </li><li> Eenmaal gevuld, nauwkeurig de canule verbinden met het uiteinde van de katheter. Indien blijkt dat een bel wordt gevormd verwijdert de canule voorzichtig vullen de katheter met drager of geneesmiddeloplossing en herintroduceren van de canule. </li><li> Plaats de pump in een container met steriele zoutoplossing en verlaat deze bij 37 ° CO / N. </li><li> Vóór implantatie controleer voor de vorming zeepbel. Indien nodig (bijv., Belletjes worden waargenomen) verwijderen van de canule en vul de buis. Sluit de canule. Dit zou slechts een paar microliter van de oplossing te nemen. </li></ol> 2. Implantatie van mini-osmotische pompen Opmerking: Voor deze experimenten dieren werden verdoofd met 1% isofluraan (30% O 2, 70% N 2 O). Als dit echter niet beschikbaar is, het gebruik van intraperitoneale injecties van verdoving mogelijk 11. <ol><li> Zoek het dier in de stereotactische inrichting onder verdoving en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap. </li><li> Snijd de vacht over de hijad ofwel met een schaar of een scheren machine. Snij zoveel mogelijk zonder beschadiging van de huid. </li><li> Reinigen van de huid met 70% ethanol en desinfecterende met antibacteriële en fungicide eigenschappen. </li><li> Met een scalpel open een 1 cm incisie iets naar rechts van de middellijn en de schedel bloot te leggen. </li><li> Reinig de schedel met een wattenstaafje. Laten weken met 70% ethanol en doorgeven over de schedel. Dit induceert de schedel te drogen. </li><li> Als de schedel is licht bloeden, gebruik dan een cauterizer elke bloeden punten te elimineren. Bloed voorkomt CA droogt correct op het bot wanneer de canule wordt geïmplanteerd. </li><li> Gebruik de stereotactische apparaat om een ​​merk te maken op het punt van de schedel waar de canule wordt geïmplanteerd. Voor ventriculaire infusies de linker hersenhelft coördinaten -0,2 mm caudaal, 0,9 mm lateraal van bregma (Figuur 2A). </li><li> Boor voorzichtig over de schedel het maken van een hoek van 45 °; Dit voorkomt dat de boor per ongeluk gaan op de brain. Herhaaldelijk boren voor een paar seconden en controleer dan hoe diep het gat is. Stoppen met boren zodra de schedel is dunner, maar nog steeds niet volledig doorgedrongen. </li><li> Breek de hersenvliezen met de punt van een steriele naald totdat volledige toegang tot de hersenen bereikt. Ga voorzichtig om zo de hersenen niet beschadigen. </li><li> Reinig de schedel met 70% ethanol met behulp van een wattenstaafje. </li><li> Invoering van een rechte tang onder de huid van het dier in een antero-caudaal. Gebruik de tang om de ruimte te openen onder de huid op de rug van het dier waar de pomp worden geïmplanteerd. Introduceren van de pomp in de rug van het dier verlaten van de katheter en de canule buiten (figuur 2B). De pomp wordt in deze stand gehouden totdat deze wordt verwijderd en geen enkele vorm van fixatie nodig. </li><li> Plaats voorzichtig vier kleine druppels lijm naast de naald in de canule. </li><li> Introduceren zorgvuldig de naald door de schedel zonder zijwaarts bewegen. Houd het in positie voor 15-30 sec until de canule volledig bevestigd (figuur 2C.1). Eenmaal op zijn plaats, zal de canule bereiken 2,5 mm in de dorso ventrale richting als men spacer disc is gebruikt. Indien goed aangesloten, zal de canule tot het einde van het experiment blijft vastzitten aan het bot. </li><li> Plaats één vinger over het tabblad te verwijderen en vervolgens met de andere hand om het afgesneden door zijn nek met een set van de schaar (figuur 2C.2). </li><li> Sluit de wond op de huid met een 5-0 hechtdraad en enkele druppels povidon-joodoplossing (PVP-I) boven op de wond ter voorkoming van infectie (Figuur 2D). </li><li> Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Plaats geen geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Houd dieren die zijn geïmplanteerd pompen alleen in hun kooien in de tijd van geneesmiddeltoediening. </li><li> Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen. </li></ol> 3. Pomp removal Opmerking: Gewoonlijk experiment eindigt aan het einde van de levertijd toegestaan ​​door de pomp, maar het is mogelijk om de pomp om secundaire experimenten verwijderen als vervolg op de geneesmiddelafgifte. Om tract tracer injecties doen is het dus noodzakelijk om de pomp te verwijderen. <ol><li> Plaats het dier in de seterotactic apparaat onder verdoving en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog te voorkomen tijdens het onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap. </li><li> Open de huid voorzichtig door het snijden door de incisie uitgevoerd op de dag van de pomp implantatie. </li><li> Met een chirurgische klem houd de canule en trek hem uit. Het moet gemakkelijk uit de schedel. Zo zacht bloeden wordt verwacht, stoppen door het plaatsen van een wattenstaafje en wacht 1-2 min. </li><li> Trek de pomp door de katheter. Hijlp het uit door te duwen, waardoor de druk op de huid. </li><li> Weer sluit de wond met een 5-0 hechtdraad en voeg een paar druppels van de PVP-I. </li><li> Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Niet gezet geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Dieren die chirurgie hebben ondergaan kunnen worden samengesteld. </li><li> Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen. </li><li> Laat het dier om te herstellen gedurende 10 dagen alvorens tot darmkanaal tracer injectie. </li></ol> 4. Druk Tract Tracer Injectie bij 45 ° hoeken op de juiste Motor Cortex <ol><li> Leg het dier op het stereotactische apparaat onder narcose en de ogen te bedekken met een beschermende zalf tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap. </li><li> Open de hoofdwond. </li><li> Cleunen de schedel met 70% ethanol met behulp van een wattenstaafje. </li><li> Invoering van een 5 ul glazen spuit (26S bis) op de verticale houder van de inrichting. Zorg ervoor dat het onderste uiteinde van de glazen houder juist op het vasthoudelement. De spuit mag niet te ver eronder dan is het onmogelijk om deze te plaatsen bij 45 ° vanuit de vertikale stand en de injectie toe. </li><li> Richt de spuit direct over bregma en zoek de gewenste coördinaten. Voor een injectie op de motorische cortex coördinaten: Punt # 1: 0,5 mm rostraal en 2,5 mm lateraal met betrekking tot bregma. Punt # 2: 1,34 mm rostraal, 2,5 mm lateraal met betrekking tot bregma. </li><li> Zodra de coördinaten zijn gevestigd, geven hun positie over de schedel met een marker met een dunne punt. Maak slechts één punt in de schedel als buitensporig inkt release mogelijk te verbergen de juiste coördineren. </li><li> Boor de schedel die de boor bij 45 ° voorzichtig. Zoals in stap 2.8, controleer dan de schedel regelmatig, zodat het niet volledig perforated om schade aan de hersenen veroorzaakt door de boor voorkomen. Gebruik de punt van een spuit te zorgen dat alle bot is verwijderd. </li><li> Laden 600 nl van darmkanaal tracer verdunning in de spuit. </li><li> Stel de verticale stand 45 ° naar de rechterzijde van het dier. Onder de microscoop, plaats de punt van de naald van de spuit is recht tegenover het gat. </li><li> Bewegen in de verticale richting van 1,5 mm. Laat de naald stabiel in deze positie gedurende 30 seconden tot 1 minuut voordat u druk injecties. </li><li> Injecteer 300 nl van tracer verdunning in drie stappen van 100 nl van elkaar gescheiden door 30 sec. Na de laatste injectie, laat de spuit stabiel bij 30 sec tot 1 min teneinde de tracer stroomt en uit de hersenen voorkomen. </li><li> Trek langzaam uit de spuit, verplaats het over het tweede gat en herhaal hetzelfde proces met de resterende 300 nl dat zich binnen de spuit. </li><li> Na de tweede injectie, verwijder de spuit en ga naar de wou sluitennd met een 5-0 hechtdraad en voeg een paar druppels van de PVP-I. </li><li> Verplaats het dier in een nieuwe kooi. Niet gezet geopereerde dieren met dieren die nog steeds niet zijn bediend. Dieren die chirurgie hebben ondergaan kunnen worden samengesteld. Heeft muizen niet onbeheerd achter tot ze wakker en borstligging hebben herwonnen. </li><li> Laat het dier te laten bekomen van 10 dagen voor het offer. </li></ol> 5. Tract Tracer Observation <ol><li> Verdoven van het dier volledig per institutionele richtlijnen. Bevestig anesthesie door het observeren van een gebrek aan respons op de achterpoot bij het indrukken met de vingers of met een tang. Ga niet verder voordat het dier is volledig in slaap. </li><li> Perfuseren de dieren met 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7) onder standaardprotocollen 6. </li><li> Verwijder de hersenen en post fix door O / N onderdompeling in 4% paraformaldehyde. </li><li> Cryoprotect hersenen in sucrose op 30% tot de hersenen zinken. Verwijder vervolgens de hersenen en vries ze met 10 sec Immersion in vloeibare stikstof. Houd hersenen bij -80 ° C totdat profielen worden vervaardigd. </li><li> Produceren secties bij 20 micrometer voor retrograde tract tracer analyse en bij 40 micrometer voor anterograde tract tracer analyse door het snijden op een cryostate. </li></ol> Opmerking: FG gelabelde neuronen kunnen worden waargenomen als witte bloedcellen onder ultraviolet licht excitatie. BDA wordt gedetecteerd door O / N incubatie met avidine-biotine-peroxidase complex en 3,3 &#39;diaminobenzidine onder toevoeging van nikkel in 0,4% om het contrast van de vezels 6,7 verbeteren.

<ol><li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-124+protects+against+focal+cerebral+ischemia+via+mechanisms+involving+Usp14-dependent+REST+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-124 protects against focal cerebral ischemia via mechanisms involving Usp14-dependent REST degradation.</a> Acta Neuropathol. 126, 251-265 (2013).</li>
<li>Hoyo-Becerra, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Regulation+of+Depression-Associated+Genes+in+a+New+Mouse+Model+Mimicking+Interferon-alpha-Related+Depression+in+Hepatitis+C+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Regulation of Depression-Associated Genes in a New Mouse Model Mimicking Interferon-alpha-Related Depression in Hepatitis C Virus Infection.</a> Mol Neurobiol. , (2014).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, Unit 4.24(2010).</li>
<li>Miao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+adiponectin+improves+neurobehavioral+outcomes+after+focal+cerebral+ischemia+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurosci+Ther%22%5BJournal%5D)">Overexpression of adiponectin improves neurobehavioral outcomes after focal cerebral ischemia in aged mice.</a> CNS Neurosci Ther. 19, 969-977 (2013).</li>
<li>Pellegrini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+benefit+of+a+combined+strategy+using+erythropoietin+and+endothelial+progenitor+cells+after+transient+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Therapeutic benefit of a combined strategy using erythropoietin and endothelial progenitor cells after transient focal cerebral ischemia in rats.</a> Neurol Res. 35, 937-947 (2013).</li>
<li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-acute+delivery+of+erythropoietin+induces+stroke+recovery+by+promoting+perilesional+tissue+remodelling+and+contralesional+pyramidal+tract+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Post-acute delivery of erythropoietin induces stroke recovery by promoting perilesional tissue remodelling and contralesional pyramidal tract plasticity.</a> Brain. 134, 84-99 (2011).</li>
<li>Reitmeir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+induces+contralesional+corticobulbar+plasticity+and+functional+neurological+recovery+in+the+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor induces contralesional corticobulbar plasticity and functional neurological recovery in the ischemic brain.</a> Acta Neuropathol. 123, 273-284 (2012).</li>
<li>Hermann, D. M., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+brain+remodelling+and+plasticity+for+stroke+recovery%3A+therapeutic+promise+and+potential+pitfalls+of+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery: therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation.</a> Lancet Neurol. 11, 369-380 (2012).</li>
<li>Overman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+ephrin-A5+in+axonal+sprouting%2C+recovery%2C+and+activity-dependent+plasticity+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for ephrin-A5 in axonal sprouting, recovery, and activity-dependent plasticity after stroke.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E2230-E2239 (2012).</li>
<li>Wolf, W. A., Martin, J. L., Kartje, G. L., Farrer, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Fibroblast+Growth+Factor-2+as+a+Mediator+of+Amphetamine-Enhanced+Motor+Improvement+following+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence for Fibroblast Growth Factor-2 as a Mediator of Amphetamine-Enhanced Motor Improvement following Stroke.</a> PLoS One. 9, e108031(2014).</li>
<li>Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intraperitoneal+injection+anesthesia+in+mice%3A+drugs%2C+dosages%2C+adverse+effects%2C+and+anesthesia+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth.</a> Comp Med. 51, 443-456 (2001).</li>
</ol>

Vergoedingen productie en Open Access publiceren door DURECT Corporation, waarvan de mini-osmotische pompen gebruikt in dit artikel oplevert.

Gedurende vele jaren heeft het onderzoek naar neurodegeneratieve aandoeningen, zoals ischemische beroerte of traumatisch hersenletsel gericht op de ontwikkeling van neuroprotectieve therapieën die gericht zijn op neuronale overleving in de acute beroerte fase te promoten. De overgrote meerderheid van geneesmiddelen therapieën die zijn gevonden effectief in diermodellen niet wanneer vertaald naar de kliniek. Redenen hiervoor therapeutisch falen omvatten maar zijn niet beperkt tot het ontbreken van aanhoudende geneesmiddeleffecten resulteert in aanhoudende functionele neurologische herstel. Het is dus belangrijk om strategieën te bevorderen hersenen remodeling op de langere termijn te ontwikkelen. Door het bevorderen van neuronale overleving alleen is niet voldoende om succesvol beroerte herstel mogelijk maken, zoals voorgesteld door het grote aantal mislukte neuroprotectie proeven, het stimuleren van neuronale plasticiteit onlangs verkregen groot belang op. Middelen voor drug delivery zijn intraperitoneale injectie, staart intravasculaire injection, dijbeen injectie, enkele stereotactische injectie van vectoren in de hersenen en bleef constante levering door mini-osmotische pompen. Laatstgenoemde kan omvatten systemische afgifte, wanneer de pomp niet een canule, of die worden orgel gerichte kunnen, zoals we hebben aangetoond voor plaatsing in de hersenen. Met uitzondering van mini-osmotische pompen en het gebruik van virale vectoren, zullen alle andere strategieën fluctuerende geneesmiddelconcentraties induceren. Voor lange termijn experimenten derhalve noodzakelijk om het dier bij de stress van ontvangst frequente injecties. De BBB legt een belangrijke belemmering voor de hersenen opname van eiwitten of geneesmiddelen uit het bloed, waardoor de noodzaak van grote eiwit of geneesmiddel doseringen om therapeutische concentraties in de hersenen te bereiken. Bijvoorbeeld Pellegrini et al. (2013) 5 afgegeven rhEPO door intraperitoneale injectie met een dosis equivalent aan 75 IU / dag voor een dier van 30 g (750 IU / dag voor een 300 g rat). Ter vergelijking, de doelgerichte aflevering van rhEpo naar de hersenen liet ons toe om een ​​veel lagere dosis van 10 IU / dag te gebruiken in onze studie voor een succesvolle beroerte herstel, dat ons in staat om het herstel over een groot tijdsbestek te realiseren tegen een vaste rente van 0,25 pl / uur. In dit werk hebben we aangetoond de wijze van implanteren van minipompjes met een canule verbonden met de schedel om de plasticiteit bevorderend proteïne rhEPO rechtstreeks te leveren in de ventrikel, waardoor het omzeilen van de BBB. Door deze werkwijze rhEPO bevorderd neurologisch herstel in een aantal manieren, waaronder vermindering van infarctgrootte reductie van gliale littekenvorming en inductie van angiogenese. rhEPO bevorderde ook neuronale overleving en hogere projecties van de contralesional motorische cortex naar de gedenerveerde rode kern en gezicht kernen. De kiemen van de vezels werd onthuld door injectie van de anterograde tract tracer BDA in de motorische cortex (figuren 4A en 5A). Een functioneel correleren met de kiemen van de vezels provided door de verbetering van de motorische vaardigheden (Figuur 5B). Daarnaast hebben we aangetoond dat dezelfde benadering tract tracer injectie kan worden toegepast thalamo-corticale verbindingen door injectie van de retrograde tracer tract FG (Figuur 6B) onthullen. Bij de bereiding van de mini-osmotische pomp, is het essentieel om de eind- en gebruik van spacers te overwegen. We gebruiken een afstandhouder om de lengte van de naald te reduceren 0,5 mm zoals deze wijze de punt van de naald in contact is met het ventrikel op de aangegeven coördinaten (-0,2 mm caudaal, 0,9 mm lateraal, 2,5 mm dorso ventrale met ten opzichte van bregma). Maar als diepere structuren het doel van het onderzoek, is geen spacers nodig. Evenzo, als een externe afleverpunt gewenst is (bijv., De cortex) en vervolgens meer spacer disks nodig. De katheter moet lang genoeg zijn zodat de pomp niet te dicht bij het hoofd, zoals bewegingen van de MOU zal belemmerense, maar ook niet te lang eenmaal geïmplanteerd lange duur kan de katheter te buigen, waardoor het risico van canule verwijdering verhogen door de natuurlijke beweging van de muis. Een sectie van 2 cm van de katheter geeft zeer goede resultaten in termen van mobiliteit en stabiliteit van het implantaat (Figuren 1 en 2). Incubatie van de pomp bij 37 ° CO / N kan de pomp direct beginnen pompen het geneesmiddel in de hersenen op het moment van implantatie. In de mini-osmotische pomp implantatie is het essentieel om te verzekeren dat de schedel juist vóór implanteren van de canule wordt gedroogd. Meestal reiniging met 70% ethanol wordt het bot te drogen induceren, maar als continue bloeden wordt gevonden, gelijk aan de schedel voorzichtig met een cauterizer zal volledig drogen. Het is essentieel om te verzekeren dat de invoering van de naald verticale en langzaam mogelijk. Eenmaal in positie, en terwijl de lijm droogt, het plaatsen van de vinger op de top van de canule voorkomt dat zijwaartse ovre van de schedel. Speciale aandacht moet worden gegeven aan de wond en de plaatsing van de canule. Het is belangrijk dat de insnijding niet wordt uitgevoerd precies boven de middellijn van de schedel maar enigszins naar rechts. Bij het sluiten van de wond indien de incisie werd gemaakt in de middellijn, de huid zal worden overbelast, waardoor het risico van wondopening verhogen. Het maken van de insnijding aan één zijde iets zal de hechting punten om vanaf het hoogste punt van de canule. Bijgevolg zal er minder spanning op de hechtdraad punten en de wond goed te genezen. De dieren moeten alleen worden gekooid en gecontroleerd elke dag, vooral tijdens de eerste 10-15 dagen na de implantatie. Bij wonddehiscentie, wonden moeten zo snel mogelijk gesloten. Als de canule wordt verwijderd of het dier weer een infectie experiment moet worden beëindigd. Re-implantatie van de canule wordt afgeraden. Het is zeer belangrijk voor een succesvolle implantatie voldoende hoeveelheden weefsel ad gebruikenhesive (niet te veel!) als het degradeert het bot en verhoogt het risico van canule verwijderd. Echter het gebruik van te weinig kleefmiddel wordt evenmin de canule bevestigd aan het bot vast te houden. De mini-osmotische pompen kunnen uitvoeren medicijnen opgelost in een grote verscheidenheid van stoffen als enige beperking dat deze het oplosmiddel biocompatibel. Bovendien, aangezien het volume klein (200 ui) moet men bepalen of de concentratie die nodig is voor het experiment geschikt en precipitatie veroorzaken in de pomp. Darmkanaal tracing met ofwel anterograde of retrograde tracers is een zeer goed gevestigde techniek om de hersenen connectiviteit en plasticiteit te bestuderen. Zorg moet worden gegeven aan het gebruik stereotactische frames bij het ​​injecteren om nauwkeurigheid op gericht het hersengebied men wil bestuderen (bijv injectie te voorkomen op het corpus callosum bij het ​​inspuiten van de cortex). Voor alle chirurgische ingrepen en om de pijn te verminderen enontsteking, moeten de dieren behandeld met 0,1 mg / kg buprenorfine voor de interventie en Caprofen bij 4 mg / kg eenmaal per dag gedurende drie dagen na de ingreep. Kortom, deze benadering levert een goede hulpmiddel om invloed van eiwitten of farmacologische samenstelling in de beschadigde brein, die een werkwijze die goed geschikt is voor onderzoek naar hersenplasticiteit.

De aflevering van eiwitten en farmacologische verbindingen in de hersenen zijn belangrijke strategieën voor het bestuderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan hersenziekten en het evalueren van kandidaat-moleculen voor nieuwe behandelingen 1,2. In de experimentele neurowetenschappen is de aflevering van vectoren zoals plasmiden of adenovirussen een belangrijk hulpmiddel geworden voor het bestuderen van langetermijneffecten van eiwitten in de hersenen 3,4. Enkelvoudige injecties van vectoren hebben het voordeel van een systeem dat op zichzelf al zeer stabiele niveaus van het therapeutische middel in de hersenen handhaaft 4. Echter, voor langetermijnexperimenten met gezuiverde geneesmiddelen induceert systemische toediening via intraperitoneale injectie stress bij muizen of ratten, en is het niet de beste keuze wanneer een gerichte hersenreactie nodig is, die ook grote doses van het medicijn vereist5. Mini-osmotische pompen vormen een ideaal systeem voor langdurige directe medicijntoediening in de hersenen door zowel lage toegankelijkheid tot de hersenen als pieken van medicijnconcentratie te omzeilen, aangezien de aflevering van het medicijn direct gebeurt in een gerichte plaats in de hersenen en tegen een vaste stromingssnelheid bepaald door het gekozen pompmodel2,6,7. Inderdaad, dit systeem heeft ons in staat gesteld om hersenherstel na een beroerte met succes te bestuderen door de toediening van verschillende geneesmiddelen zoals recombinant humaan erytropoëtine (rhEpo) en vasculair endotheelgroeifactor 6,7.
Hersenplasticiteit is essentieel voor het herschikken van verbindingen als reactie op hersenletsels. Plasticiteit is een breed concept dat varieert van de vorming of eliminatie van synaptische contacten, groei van dendritische stekels en ook verlenging of terugtrekking van langeafstandsverbindingen8,9. Er werd eerder gedacht dat de hersenen niet in staat zouden zijn om verbindingen na een laesie te herstellen. Maar veel benaderingen hebben aangetoond dat deze, indien goed gestimuleerd, de connectiviteit opnieuw kunnen tot stand brengen 6,7,10. Een techniek die bijzonder nuttig is om dit te bestuderen, is het gebruik van tractustracers. Anterograde tractustracers zijn verbindingen die neuronen kunnen binnendringen bij de soma en zich vervolgens langs de axonen verspreiden totdat deze hun doelstructuren bereiken. Twee voorbeelden zijn cascade blauw (CB) en biotinyleren dextran amine (BDA). Daarentegen komen retrograde tractustracers, zoals cholera toxine B (CTB) of fluorogoud (FG), het neuron binnen via het axon-uiteinde en verspreiden zich vervolgens terug naar de soma en onthullen zo de oorsprong van neuronen die de injectieplaats targeten.
Hier presenteren we de methoden die we gebruiken voor het implanteren van mini-osmotische pompen voor directe aflevering van eiwitten of geneesmiddelen die potentiële effecten hebben op neurale plasticiteit, evenals de injectie van BDA en FG om input- en outputverbindingen naar de motorische cortex te onthullen. BDA zal ook worden gebruikt als een voorbeeld van een tractustracer die wordt gebruikt om verhoogde plasticiteit van axonen te demonstreren die na een beroerte uit het co ontstaan onder behandeling met rhEpo.

<table><tbody><tr><td>Alzet miniosmotische pomp. Model 2004.</td><td>Alzet</td><td>000298</td><td>Geneesmiddel container</td></tr><tr><td>Hersinfusie set 3 1-3 mm</td><td>Alzet</td><td>0008851</td><td>Geneesmiddel hersenafleveringssysteem</td></tr><tr><td>Loctite&nbsp; 454 Prism gel&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>45404</td><td>Cyanoacrylaatkleefstof voor canule adhesie aan de schedel</td></tr><tr><td>75N glazen spuit&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87900/00</td><td>Injectie van tract tracers</td></tr><tr><td>Biotine Dextran Amine (10.000 MW)</td><td>Molecular probes</td><td>N-7167</td><td>Anterograde tract tracer</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC.</td><td></td><td>Retrograde tract tracer</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Stereotactisch apparaat voor coördinaagbepaling, pompimplantatie en tract tracer injectie.</td></tr></tbody></table>

implantatie van mini-osmotische pompen en levering van tract tracers naar brain reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden studie

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Farmacologische behandeling in diermodellen van cerebrale ziekten brengt het probleem met zich mee van herhaalde injectieprotocollen die stress bij dieren kunnen veroorzaken en resulteren in tijdelijk weefselniveaus van het medicijn. Bovendien is medicijntoediening aan de hersenen delicaat vanwege de bloed-hersenbarrière (BBB), waardoor de intracerebrale concentraties van selectieve geneesmiddelen na systemische toediening aanzienlijk worden verminderd. Daarom is een systeem dat zowel constante medicijntoediening zonder piekniveaus als het omzeilen van de BBB mogelijk maakt, noodzakelijk om voldoende hoge intracerebrale concentraties van geneesmiddelen te bereiken die ondoorlaatbaar zijn voor de BBB. In deze context vertegenwoordigen miniosmotische pompen een ideaal systeem voor constante medicijntoediening tegen een vaste bekende snelheid dat het probleem van dagelijkse injectiestress bij dieren ontwijkt en dat ook kan worden gebruikt voor directe hersenlevering van geneesmiddelen. Hier beschrijven we een methode voor implantatie van miniosmotische pompen en post-operatieve zorg die aan dieren moet worden gegeven om deze techniek met succes toe te passen. We bedden het genoemde experimentele paradigma in standaardprocedures die worden gebruikt voor het bestuderen van neuroplasticiteit in de hersenen van C57BL6-muizen. Zo werden dieren blootgesteld aan 30 minuten herseninfarct en geïmplanteerd met miniosmotische pompen die via een canule met de schedel waren verbonden om een pro-plasticiteitsdrug te leveren. Gedragstesten werden gedurende 30 dagen van de behandeling uitgevoerd. Na verwijdering kregen de dieren injecties van anterograde tracttracers om neuronale plasticiteit in de chronische fase van herstel te analyseren. De resultaten gaven aan dat neuroprotectie door het toegediende medicijn gepaard ging met een toename van motorische vezels die de middellijn van de hersenen bij doelstructuren overstaken. De resultaten bevestigen de waarde van deze technieken voor geneesmiddeltoediening en hersenplasticiteitsstudies in de moderne neurowetenschappen.

We ingediend dieren 30 min van de middelste cerebrale arterie occlusie van de intraluminale hechting werkwijze het induceren van een laesie in het linker striatum en lever rhEPO direct in de hersenen met behulp van mini-osmotische pompen (Figuur 1, Figuur 3) gedurende 30 dagen vanaf 3 dagen na beroerte 6. Figuur 4 toont een schema van de cortico spinale kanaal dat werd gevonden na CB en BDA injectie en het gebied waar tracers geïnjecteerd. We lieten een verbetering van de grijpkracht en motorische prestaties (figuur 5) na 14 en 42 dagen van rhEPO levering respectievelijk. Levering van BDA in de rechter motorische cortex van dieren met een beroerte ontvangen links striatum, toonde een toename van de motorische vezels die de middellijn ter hoogte van de rode en gezicht nucleus (figuur 5), demonstreren succesvolle kleuring van kiemen vezels gevolg van farmacologische behandeling met miniosmotic pompen. rhEPO behandeling toegenomen neuronale overleving, vertraagde diffuse astrocytose, verminderde gliale littekenvorming en verhoogde angiogenese in de bestudeerde periode 6. Door deze zelfde techniek tract tracer injectie kunnen we met succes thalamuskernen die zijn verbonden met de cortex door injectie van de retrograde tracer tract FG (Figuur 6) te detecteren. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figuur 1. Onderdelen van de mini-osmotische pomp gebruikt in dit protocol. De afstandhouder disc, canule en afneembare tabblad, katheter, stromen moderator en mini-osmotische pomp kan worden waargenomen. Het aspect van de volledig gemonteerde pomp kan worden gezien in figuur 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> ithin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Figuur 2. Samenvatting van de pomp implantatie belangrijke punten. (A) De muis wordt getoond als geplaatst op het stereotactische apparaat met de volledig geconstrueerde mini-osmotische pomp ernaast. Pijl geeft de voor implantatie coördinaten. (B) De pomp is geïntroduceerd op de rug van het dier en alleen de canule blijft aan de buitenkant. De schedel is al geboord. (C) Aspect van het hoofd na implantatie. (C.1) De canule is op positie, maar het tabblad verwijderbare niet is gesneden. (C.2) Het tabblad verwijderbaar is gesneden en het stikken van de wond kan nu beginnen. (D) Het sterretje toont een recent geïmplanteerd dier in vergelijking met een dier 30 dagen na implantatie (#). Wanneer correct gehuisvest, moet de wond gesloten tot het einde van de procedure blijven zoals getoond op de afbeelding.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Figuur 3. Nissl-kleuring vermelding van de plaats van implantatie op de cortex. Een kleine incisie kan worden waargenomen op een deel van de linker cortex (pijl). De breedte van de binnengedrongen zone is ongeveer 50 urn. De geen evidente ernstig weefselveranderingen basis van Nissl-kleuring in vergelijking met het overeenkomstige gebied contralaterale (*). R: rechter hersenhelft. L: Links halfrond. Schaal bar = 300 micrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Figuur 4. Tracttracer injectie strategie als voorheen gepubliceerd door Reitmeier et al. 6,7. (A) Schematische aangeeft injectieplaatsen voor de luchtwegen tracer BDA in de contralaterale motorische cortex, terwijl CB werd geïnjecteerd in de motorische cortex van het infarct halfrond. Vezels werden gevolgd om de rode kern (niet getoond) en gezicht nucleus (zie figuur 5). (B) De injectie van de anterograde tract tracer BDA naast de motorische cortex weergegeven. Let op de rode pijl die de naald spoor, terwijl de zwarte pijl geeft een paar corticale cellen gelabeld met de BDA. Cx: Cortex. CC: corpus callosum. V: ventrikel. FN: Facial kern. Schaal bar in B = 200 micrometer. Is figuur 4A weergegeven met de vriendelijke toestemming 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt = &quot;Figuur 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Figuur 5. Terugwinning van een infarct hersenen na aflevering van rhEPO. (A) BDA geïnjecteerd in de contralesional motor cortex wordt dan gedetecteerd in corticobulbar vezels ter hoogte van het gezicht nucleus (Bregma -5,8 mm tot -6,3 mm). Kruising lijnen op elk halfrond werden parallel aan de middellijn en vezels kruisen elke lijn in de richting van de ipsilesional en contralesional halfrond getrokken werden geteld en uitgedrukt als percentage van de totale gelabelde vezels in de corticospinale darmkanaal. Erytropoëtine toegenomen vezel kruisingen in de richting van de contralesional gezicht kern De gegevens zijn middelen + - SD. Gegevens werden geanalyseerd door one-way ANOVA gevolgd door de minst significante verschillen tests §P &lt;0,05 vergeleken met met drager behandelde niet-ischemische muizen. (B) Motor gedrag vertoonden een verbetering van handknijpkracht en coördinatie op het rooster staaftest. De gegevens zijn gemiddelde waardevollees + - SD. Gegevens werden geanalyseerd door tweeweg herhaalde metingen ANOVA gevolgd door eenzijdige ANOVA / minst significante verschillen tests voor elk tijdpunt. §P &lt;0,05 vergeleken met pre-ischemische basislijn; * P &lt;0,05 in vergelijking met vehikel behandelde ischemische muizen. De figuren 5A en B zijn gereproduceerd met toestemming 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figuur 6. Target structuren bereikt na injectie van Fluorogold (FG). (A) injectieplaats van FG naast de motorische cortex zoals aangegeven in figuur 1. Let op de rode pijl die de naald spoor en de witte pijl die een paar gelabelde cellen in de cortex. (B) FG geïnjecteerd in de buurt van de motorcortex wordt gedetecteerd in de VPL. Fi: fimbria. IC: Interne capsule. RT: nucleus reticularis thalami. VPL: Thalamic ventrale posterolaterale kern. Schaal bar = 200 pm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Om hersenreorganisatie onder pathologische omstandigheden te bestuderen, gebruikten we miniosmotische pompen voor directe eiwitbezorging in de hersenen, waarbij we de bloed-hersenbarrière omzeilden. Trajecttracers worden vervolgens geïnjecteerd om veranderingen in hersenconnectiviteit onder invloed van het eiwit te bestuderen.

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Het algemene doel van deze procedure is het implanteren van mini-osmotische pompen om therapeutische middelen in de hersenen af te leveren, gevolgd door het toedienen van tracttracers om wijzigingen in de geleidbaarheid van het corticospinale tractus te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het neurorestoratieve onderzoek, zoals de wijze waarop langeafstandverbindingen binnen het centrale zenuwstelsel veranderen in de aanwezigheid van potentiële therapeutische middelen. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is dat de continue toediening van het therapeutische middel de reproduceerbaarheid van de resultaten waarborgt, terwijl tracttracers zeer betrouwbare middelen zijn om morfologische veranderingen in langeafstandverbindingen te volgen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methoden moeite hebben, omdat precisie en chirurgische vaardigheden essentieel zijn om hersenschade als gevolg van de verschillende interventies te voorkomen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Jeismar Carballo, een promovendus uit het laboratorium van professor Hammond. Begin met het voorbereiden van de mini-osmotische pomp in een steriele omgeving.Gebruik eerst een pincet om de herseninfusiecanule ondersteboven vast te houden. Voeg vervolgens twee druppels cyanoacrylaatlijm toe en plaats één afstandsschijf voor toediening van het geneesmiddel aan het ventrikel. Snijd daarna de katheter op een lengte van 2,5 centimeter en verbind deze zorgvuldig met de flowmoderator.Gebruik vervolgens een spuit van 2 milliliter met een naald om de pomp te vullen totdat er een kleine hoeveelheid oplossing uit de pomp ontsnapt, om zo de vorming van luchtbellen te voorkomen. Vul nu voorzichtig de flowmoderator en de katheter, waarbij u er zeker van bent dat er geen bellen in de katheter zitten. Plaats daarna de flowmoderator in de pomp.Zodra deze is gevuld, verbindt u de canule voorzichtig met het uiteinde van de katheter, plaatst u de pomp in een bak met steriele zoutoplossing en laat u deze een nacht bij 37 °C staan. Nadat het dier is geanestheseerd volgens de goedgekeurde protocollen en de anesthesie is bevestigd door het uitblijven van een reactie op een knijpbeweging in de achterpoot, plaatst u het dier in een stereotaxisch frame. Bedek de ogen met beschermende zalf om uitdroging te voorkomen.Knip daarnaast de vacht boven het hoofd zo kort mogelijk bij de huid en reinig de huid met 70 procent ethanol en een desinfectiemiddel met antibacteriële en fungicide eigenschappen. Maak met een scalpel een incisie van 1 centimeter vlak rechts van de middellijn, leg de schedel bloot en reinig deze met een wattenstaafje gedrenkt in 70 procent ethanol. Nadat de stereotaxische arm boven het bregma is geplaatst, verplaatst u de stereotaxische arm naar de coördinaten om het ventrikel te targeten.Markeer dit punt op de schedel. Boor voorzichtig op dit punt in de schedel, waarbij de boor in een hoek van 45 graden wordt gehouden om accidentele beschadiging van de hersenen te voorkomen. Boor herhaaldelijk gedurende enkele seconden en controleer vervolgens de diepte van het gat.Stop met boren zodra de schedel is dunner geworden maar nog niet volledig is gepenetreerd, en doorboor vervolgens de hersenvliezen met de punt van een steriele naald totdat de toegang tot de hersenen vrij is. Introduceer daarna een rechte pincet onder de huid van het dier in anterocaudale richting en gebruik de pincet om de ruimte onder de huid in de rug van het dier te openen waar de pomp zal worden geïmplanteerd. Plaats de pomp in de rug van het dier, waarbij de katheter en canule buiten blijven.Breng voorzichtig vier kleine druppels lijm aan op de canule naast de naald. Voer de naald nu voorzichtig door de schedel in, zonder deze zijwaarts te bewegen. Houd de naald 15 tot 30 seconden op zijn plaats totdat de canule volledig is vastgezet.Het is belangrijk om voorzichtig en nauwkeurig te zijn bij het inbrengen van de pompnaald en om ervoor te zorgen dat de canule correct aan de schedel is bevestigd, zodat deze de toedieningsperiode kan voltooien zonder door het dier te worden verwijderd. Plaats vervolgens één vinger over het afneembare lipje en gebruik een schaar om dit bij het smalle gedeelte af te knippen. Sluit tot slot de incisie met 5-0 hechtdraad en desinfecteer de gesloten incisie met een povidon-jodiumoplossing.Verplaats het dier naar een schone kooi en houd het in de gaten totdat het weer in sternale recumbentie is gekomen. Het dier moet individueel worden gehuisvest tijdens de toediening van het geneesmiddel. Nadat het dier zoals voorheen is voorbereid, geanestheseerd en in het stereotaxische frame is geplaatst, wordt de huid geopend door door de incisie te snijden die werd gebruikt voor de implantatie van de pomp; houd vervolgens de canule vast met een chirurgische klem en trek deze eruit zoals getoond.Het zou eenvoudig van de schedel verwijderd moeten kunnen worden. Stop eventuele bloedingen door een wattenstaafje één tot twee minuten op de plek te houden. Pak de katheter vast en verwijder de pomp door aan de katheter te trekken en tegelijkertijd tegen de pomp te duwen.Sluit na verwijdering van de pomp de wond zoals voorheen en breng enkele druppels povidonjodium aan. Plaats het dier in een schone kooi en volg het tot het weer mobiel is. Anestheseer het dier tien dagen na verwijdering van de mini-osmotische pomp, plaats het terug in het stereotaxische frame en open de hoofdwond.Reinig de schedel met 70 procent ethanol. Bevestig een glazen spuit van vijf µL correct op de verticale houder van het stereotaxische apparaat. Richt de spuit direct boven het bregma en verplaats deze naar de gewenste coördinaten om de motorische cortex te injecteren.Zet op dit punt een markering met een marker met een dunne punt. Verplaats de spuit vervolgens naar het tweede punt en zet daar een klein markeringsteken. Boor voorzichtig in de schedel op beide punten terwijl u de boor in een hoek van 45 graden houdt.Perforeer de schedel opnieuw niet volledig en gebruik de punt van een naald om het laatste beetje bot te verwijderen. Vul de spuit met 600 nanoliters van de tracer. Pas vervolgens de positie van de naald aan naar een hoek van 45 graden aan de rechterkant van de schedel.Positioneer, terwijl u door een chirurgische microscoop kijkt, de punt van de naald direct voor het gat en voer de naal vervolgens in de hersenen in tot een diepte van 1,5 millimeter. De getoonde snelheid is uitsluitend bedoeld voor demonstratiedoeleinden. Wacht normaal gesproken 30 seconden tussen elke stap van 0,5 millimeter.Laat de naald 30 seconden tot één minuut op zijn plaats zitten. Zoals u heeft gezien, vindt de penetratie van de naald tijdens de injectie van de tractertracer plaats vanuit de mantel om te voorkomen dat onjuiste gebieden worden geraakt, wat tot verwarrende resultaten tussen individuen zou kunnen leiden. Het langzaam verwijderen van de naald voorkomt terugstroming van de tracer.Inject vervolgens 300 nanoliters tracer in drie stappen van 100 nanoliters, waarbij elke stap wordt gescheiden door een interval van 30 seconden. Laat de spuit na de laatste injectie 30 seconden tot één minuut op zijn plaats blijven voordat u de spuit langzaam terugtrekt. Plaats de punt van de spuit boven het tweede gat.Voer de naald opnieuw in zoals voorheen en herhaal vervolgens de injectie met de resterende 300 nanoliters in de spuit. Trek na de tweede injectie de spuit terug en sluit de wond met een hechtdraad van maat 5-0. Plaats het dier opnieuw in een schone kooi en houd het dier in de gaten terwijl het zich herstelt van de anesthesie voordat het wordt teruggebracht naar de verblijfruimte.Dieren werden gedurende 30 minuten onderworpen aan occlusie van de middelste cerebrale arterie om een laesie in het linker striatum op te wekken. Drie dagen later werd recombinant humaan erytropoëtine toegediend via mini-osmotische pompen gedurende een periode van 30 dagen. Cascade blue werd geïnjecteerd in het geïnfarceerde hemisfeer en gebiotineerde dextraanamine werd geïnjecteerd in het contralaterale hemisfeer.Vezels werden gevolgd naar de facialisnucleus. Biotine-dextraan-amine, geïnjecteerd in de contralesionele motorische cortex, wordt aangetroffen in corticobulbaire vezels. Vezels naar het ipsilesionele en contralesionele hemisfeer werden geteld en uitgedrukt als een percentage van het totaal aantal gelabelde vezels in het corticospinale tractus.Erytropoëtine verhoogde het aantal vezelkruisingen in de richting van de contralaterale facialisnucleus. Het motorisch gedrag vertoonde een verbetering van de handgreepkracht in vergelijking met de pre-ischemische baseline na infusie van recombinant humaan erytropoëtine. De motorische coördinatie, beoordeeld met de rotarod-test, was eveneens verbeterd na infusie van recombinant humaan erytropoëtine.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in minder dan 30 minuten per chirurgische procedure worden voltooid. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om adequate steriliteit te handhaven tijdens de voorbereiding van de pomp en tijdens de operatie om herseninfecties te voorkomen. Het gebruik van anterograde en retrograde tracttracers is een veilige en goedkope methode die inzicht biedt in de connectiviteit van de hersenen bij zowel gezonde toestanden als bij ziekte.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u mini-osmotische pompen implanteert en verwijdert en/of hoe u injecties met tracttracers uitvoert.

implantation-miniosmotic-pumps-delivery-tract-tracers-to-study-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Als neurowetenschappen onderzoek wordt meer geavanceerde, het onderzoek van de hersenen structuren en circuits vereist verbeterde niveaus van nauwkeurigheid en hogere resolutie. We hebben een methode ontwikkeld voor de voorbereiding en de implantatie van een chronische infusie-systeem in de hersenen met behulp van een borosilicate microcannula met een tip diameter van 50 micron.

Bouw en Implantatie van een Microinfusion systeem voor duurzame levering van neuroactive Agents.

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

In this video, we demonstrate the assembly of a micro-osmotic pump brain infusion system followed by its surgical implantation in the mouse skull. This system enables continuous delivery of potential drugs and facilitates the study of their effects on the brain and brain tissue.

Continuous Drug Infusion System in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Micro-osmotic Pump Infusion System in the Mouse Brain for Continuous Drug Delivery

Source: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the method for delivering neurotherapeutic drugs using an osmotic pump in a demyelinated mouse model. The controlled drug release promotes remyelination by activating myelin-producing cells in the corpus callosum.

 Osmotic Pump-Based Neurotherapeutic Drug Delivery in a Demyelinated Mouse Model

Hier presenteren we een histologische methode voor het vastleggen, etikettering, optisch opruimen, en het afbeelden van de intacte hersenen weefsel-interface rond chronisch geïmplanteerde Microdevices in knaagdieren hersenweefsel. Resultaten van de technieken die deze methode bruikbaar voor het begrijpen van de invloed van verschillende penetrerende brain-implantaten hun omringende weefsel.

Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Osmotische Drug Delivery voor ischemische achterpoten en perfusie van vaatstelsel met Microfil voor Micro-Computed Tomography Imaging

Een chirurgische methode wordt beschreven om de ventrale schedel aan pasgeboren ratten bloot. Met deze benadering is het mogelijk om een ​​craniotomie acute elektrofysiologie en twee-foton microscopie experimenten in de hersenstam van verdoofde pups openen.

Een methode om een ​​Craniotomie aan de ventrale Schedel van pasgeboren knaagdieren maken

Dit protocol bestudeert de rol van chemokine (C-C motief) ligand 5 (CCL5) in de hypothalamus door het leveren van een antagonist, MetCCL5, in de hersenen van de muis met behulp van een micro-osmotische hersenen infusie pompsysteem. Deze tijdelijke remming van CCL5 activiteit onderbroken hypothalame insuline signalering, wat leidt tot glucose-intolerantie en perifere systemische insulinegevoeligheid.

Bestuderen van het signaal van de hypothalamische insuline naar perifere Glucose-intolerantie met een continue Drug infusie-systeem in de hersenen van de muis

Convectie-verbeterde levering (CED) is een methode die een effectieve levering van Therapeutics in de hersenen mogelijk maakt door directe perfusie van grote weefsel volumes. De procedure vereist het gebruik van katheters en een geoptimaliseerde injectieprocedure. Dit protocol beschrijft een methodologie voor CED van een antilichaam in een muis hersenen.

Levering van antilichamen in de Muriene hersenen via convectie-verbeterde levering

Demyelinisatie vindt plaats bij meerdere ziekten van het centrale zenuwstelsel. Een betrouwbare in vivo medicijnafgiftetechniek is noodzakelijk voor het remyeliniseren van drugstests. Dit protocol beschrijft een op osmotische pomp gebaseerde methode die langdurige medicijnafgifte rechtstreeks in het hersenparenchym mogelijk maakt en de biologische beschikbaarheid van het geneesmiddel verbetert, met brede toepassing in remyelinisatieonderzoek.

Osmotische pomp-gebaseerde medicijnafgifte voor in vivo remyelinisatieonderzoek op het centrale zenuwstelsel

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om de glucoseconcentratie in het hersenvocht (CSF) van muizen te verhogen. Deze aanpak kan nuttig zijn voor het bestuderen van de effecten van hoge CSF-glucose op neurodegeneratie, cognitie en perifeer glucosemetabolisme bij muizen.

Osmotische minipompimplantatie voor het verhogen van de glucoseconcentratie in hersenvocht van muizen

Leer mini-osmotische pompen implanteren en tract tracers toedienen om hersenconnectiviteit te bestuderen. Deze methode ondersteunt neurorestoratief onderzoek naar therapeutische effecten op het centrale zenuwstelsel.

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie (Video) | JoVE Journal

Implantatie van mini-osmotische pompen en Levering van Tract Tracers naar Brain Reorganisatie in pathofysiologische omstandigheden Studie

Meer video's verkennen