Name: Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Leer neutrofielen isoleren met anti-tumor eigenschappen via dichtheidsgradiënt en co-cultuur met luciferase-gelabelde tumorcellen. Deze methode minimaliseert niet-specifieke activatie en meet cytotoxiciteit zonder radioactieve labels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ZG wordt ondersteund door subsidies van de I-CORE programma van de Israel Science Foundation (Grant No. 41/11), de Abisch-Frenkel Stichting, het Rosetrees Trust, het Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award) en de ZORG stichting. ZGF wordt ondersteund door subsidies van de Israël Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award), Chief Scientist van het Israëlische Ministerie van Volksgezondheid en de Israël Lung Association.

<ol><li>Tangye, S. G., Brink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helping+hand+from+neutrophils+in+T+cell-independent+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses.</a> Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Pruijt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).</li>
<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formylpeptide+receptors+mediate+rapid+neutrophil+mobilization+to+accelerate+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing.</a> PloS one. 9, e90613(2014).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).</li>
<li>Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifaceted+Roles+Neutrophils+Play+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. , (2014).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).</li>
<li>Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+cell+surface+receptors+and+their+intracellular+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways.</a> Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).</li>
<li>Scapini, P., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+networking+of+human+neutrophils+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Social networking of human neutrophils within the immune system.</a> Blood. 124, 710-719 (2014).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+comparing+tumor-associated+neutrophils+with+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+and+normal+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils.</a> PloS one. 7, e31524(2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2%5BTitle%5D)+AND+%22TAN.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2.</a> TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).</li>
<li>Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">History of myeloid-derived suppressor cells.</a> Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15%2B%2FCD16low+human+granulocytes+from+terminal+cancer+patients%3A+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+that+have+suppressive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function.</a> Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).</li>
<li>Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppression+by+neutrophils+and+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).</li>
<li>Lopez-Lago, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemokines+secreted+by+tumor+cells+mount+a+lung+antimetastatic+response+during+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression.</a> Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).</li>
<li>Sagiv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Diversity+and+Plasticity+in+Circulating+Neutrophil+Subpopulations+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer.</a> Cell Reports. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Neutrofielen zijn de meest voorkomende van witte bloedcellen en de eerste responders bij infecties en ontstekingen. Als zodanig zijn ze zeer gevoelig voor externe stimuli en zijn allemaal toegewezen. Bovendien neutrofielen een zeer korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid. Samen vormen deze elementen voeren een aantal problemen bij het werken met neutrofielen, zodat unieke experimentele strategieën nodig. Zo zijn er verschillende neutrofielen zuiveringsstrategieën, elk met zijn eigen voor- en nadelen. <p clas...

Neutrofielen werden aanvankelijk gekarakteriseerd als het aangeboren immuunsysteem cellen die als eerste lijn verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Vandaag de dag is het bekend dat neutrofielen hebben verdergaande functies, betrokken zijn bij de montage van adaptieve immuunreacties tegen vreemde antigenen 1,2, het reguleren van hematopoiese 3, angiogenese 4 en wondgenezing 5. Daarbij mag neutrofielen tumorgroei en metastatische progressie beïnvloeden door hun pro- en anti-tumor activiteiten 6,7. Neutrofielen worden gekenmerkt door een polymorfe gesegmenteerde kern (vandaar aangeduid polymorfonucleaire (PMN) leukocyten) en ten minste drie verschillende subklassen van granules en secretorische blaasjes 8 (Figuur 1 A-C). Neutrofielen hebben grote fagocytische capaciteit en hoge NADPH-oxidase activiteit essentieel is voor microbiële verwijdering en scheiden een groot aantal chemokinen belangrijk bijtraction extra neutrofielen en andere immuuncellen naar de plaats van ontsteking 8,9. Neutrofielen worden gekenmerkt door de expressie van een groot aantal oppervlaktereceptoren zoals Toll-achtige receptoren (TLRs), C-type lectine receptoren (CLRS), complement receptor 3 (CD11b / CD18) en andere adhesiemoleculen (bijvoorbeeld, L-selectine, LFA-1, VLA-4 en carcinoembryonaal antigen gerelateerde celadhesie molecuul 3 (CEACAM3 / CD66b)), chemokine receptoren (bijvoorbeeld, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), chemoattractant receptoren (bv PAFR, LTB 4 R en C5AR) , cytokine receptoren (bijvoorbeeld, G-CSFR, IL-1 R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formyl-peptide receptoren (bv FPR1-3) en Fc-receptoren (bijvoorbeeld CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII) en CD64 (FcyRI) 10. Bij muizen worden gewoonlijk geïdentificeerd als neutrofielen CD11b + Ly6G +, terwijl menselijke neutrofielen worden geïdentificeerd met de CD 11, CD15, CD16 en CD66b leukocyten markers. Ook wordt algemeen aanvaard kleur wordt de granule-eiwitten myeloperoxidase (MPO) en neutrofiel elastase (NE) voor detectie van neutrofielen in weefsels. Het blijft onduidelijk of de diverse functies van neutrofielen worden gemedieerd door dezelfde cel of door afzonderlijke cel subpopulaties. Accumuleren gegevens wijzen op de aanwezigheid van een heterogene populatie neutrofielen die een hoge mate van plasticiteit die door pro-inflammatoire stimuli en hun micro 11,12 vertoont. Fridlender et al. 13 hebben schromelijk verdeelde de neutrofielen bij kanker in twee belangrijke subpopulaties genoemd N1 met anti-tumor eigenschappen en N2 met pro-tumor eigenschappen. Bij kanker, alsmede in chronische ontsteking, is er een extra subpopulatie uit granulocytic myeloide suppressor cellen (G-MDSCs) dat T-celresponsen 14 onderdrukken. G-MDSCs worden als onrijpe myeloïde cellen gekenmerkt door een CD11b + Ly6C zijnlage Ly6G hi fenotype in muizen 15, terwijl het hebben van een CD15 + / CD16 laag fenotype in de menselijke 16. G-MDSCs uiten hogere niveaus van arginase en myeloperoxidase, terwijl lagere niveaus van cytokines en chemokines dan normaal circulerende neutrofielen. Ze zijn minder fagocytische en trekvogels, maar produceren hogere niveaus van ROS 15,17,18. In dit document zullen we een aantal fundamentele methoden voor isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor eigenschappen te beschrijven. Terwijl neutrofielen vormen de grootste bevolking van alle witte bloedcellen in het menselijk omloop (45-70%; 1800 - 6000 / ul), bij muizen, onder normale omstandigheden, ze zijn nogal mager (10 - 15%; 300-500 / ul ). De neutrofielen stijgt gestaag op ontstekingen en soms met kanker, die een toestand van chronische ontsteking 7 vertegenwoordigt. Neutrofielen ontwikkelen van multipotent gemeenschappelijke myeloïde voorloper (CMP) cells in het beenmerg, door een differentiatieproces passeren van de fasen van myeloblasten (MB), promyelocyten (PM), myelocyten (MC), metamyelocyten (MM) en band cellen (BC) 8. De volwassen, post-mitotische neutrofielen kan binnen het beenmerg blijven voor 4 - 7 dagen voordat ze worden vrijgegeven aan de circulatie 8. Neutrofielen omzet in het bloed is gewoonlijk snel met een gemiddelde halfwaardetijd van 6-12 uur, eventueel verlengd onder ontstekingsaandoeningen. Gestimuleerde neutrofielen hebben anti-tumorigene activiteit, een functie die kan worden verworven door het blootstellen van de naïeve neutrofielen naar de chemokinen IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 en CXCL5 6,19 of kunstmatig beperkt door ze bloot te stellen aan de forbolester forbol 12 -myristate 13-acetaat (PMA) 6. De korte halfwaardetijd van bloed neutrofielen samen met het lage aantal neutrofielen (~ 3-5 x 10 5) bereikt van 1 ml bloed van een naïeve 6-8 weken oude muis, hebben het gemaaktmoeilijk om de functie van circulerende neutrofielen muis in vitro onderzoeken. Om deze moeilijkheid te overwinnen, zijn andere bronnen gebruikt. Zo kunnen grote aantallen neutrofielen worden verkregen uit het beenmerg 20 of het peritoneum volgend op de inductie van steriele ontsteking (bijvoorbeeld na intraperitoneale injectie van thioglycolaat cultuurvloeistof of Zymosan A). Opgemerkt wordt dat neutrofielen verkregen uit de peritoneale holte geen anti-tumorontwikkeling (ongepubliceerde waarneming) uitoefenen. . Granot et al opgemerkt dat 6 BALB / c muizen geïnoculeerd met orthotopically de muis 4T1 borstcarcinoom cellijn ontwikkelen neutrofilie die verergert tot tumorprogressie 6 (figuur 2A), zodat 20-40000000 bloedneutrofielen gemakkelijk worden geïsoleerd uit 1 ml bloed 3-4 weken na de tumor-inoculatie. Deze neutrofielen hebben anti-tumor activiteiten verworven, en hebben daarom COI geweestned-tumor meegevoerde neutrofielen (TEN), teneinde deze te onderscheiden van naïeve neutrofielen 6 (Figuur 2B). Terwijl high-density neutrofielen (HDN figuur 1A) sterk anti-tumorigene, low-density neutrofielen (LDN figuur 1B) gegenereerd in de context van kanker niet 21. Ook, high-density neutrofielen uit het beenmerg en de milt van tumordragende muizen anti-tumor activiteit (ongepubliceerde gegevens). Opgemerkt wordt dat bij tumorprogressie de milt geleidelijk vergroot (splenomegalie), met toenemende hoeveelheden van neutrofielen. Opgemerkt wordt dat de TEN ook geproduceerd in andere modellen van kanker waaronder zowel spontane (MMTV-PyMT en MMTV-Wnt1 mammaire tumoren en k-Ras driven longtumoren) en geïnjecteerd (AT-3 (MMTV-PyMT) en E0771 borstcarcinoom cellen, LLC Lewis longcarcinoom cellen en B16-F10 melanoomcellen). De mate van neutrofiel mobilisatie in deze tumof modellen veel minder dan van 4T1-geïnoculeerde muizen, tot 5-10 x 10 6 neutrofielen in 1 ml bloed na 3 weken.

<table><tbody><tr><td>CELL LINES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse 4T1 breast carcinoma cells</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Tissue Culture Plate&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>100 mm Tissue Culture Plate&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>25 cm2 Tissue Culture Flask</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>90 mm Bacterial Grade Culture Dish&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835015-40-111</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5&mu;m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>White 96-Flat-Bottom Well Plate&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>20G x 1.5" Needle</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>23G x 1" Needle&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>25G x 5/8" Needle&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>9 mm Clips&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>EasySep Magnet&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Separation Column&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>MidiMACS Separator Magnet</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Glass Slide&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml;ser Superfrost&nbsp; Plus Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker&nbsp;</td><td>Sky line, ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Highly toxic, handle with care</td></tr><tr><td>Thioglycollate powder&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MEDIA AND SUPPLEMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I reduced serum medium&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin x 1000 solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-5A</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>HPLC grade water&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>SOLUTIONS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &ndash; Ammonium-Chloride-Potassium</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM in DMSO</td><td></td><td></td><td>Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.</td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' balanced salt solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>Steriele</td></tr><tr><td>Heparin, 20 mg/ml in PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Sterile filter through a 0.2 mm filter.</td></tr><tr><td>Luciferase cell culture lysis buffer x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilute 1:5 in sterile water just before use.</td></tr><tr><td>Luciferase assay solution</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)</td></tr><tr><td>

isolatie en karakterisering van neutrofielen met anti-tumor properties

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrofielen, de meest voorkomende van witte bloedcellen in de menselijke circulatie, spelen een belangrijke rol bij de afweer tegen binnendringende micro-organismen. Bovendien neutrofielen spelen een centrale rol in de immuunbewaking van tumorcellen. Ze hebben het vermogen om tumorcellen te herkennen en te induceren tumorceldood hetzij door een cel contact-afhankelijke mechanisme met waterstofperoxide of door middel van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC). Neutrofielen met anti-tumor activiteit kunnen worden geïsoleerd uit perifeer bloed van kankerpatiënten en tumordragende muizen. De neutrofielen worden genoemd tumor meegevoerde neutrofielen (TEN) het onderscheiden van neutrofielen van gezonde proefpersonen of naïeve muizen die geen significante tumor cytotoxische activiteit vertonen. Vergeleken met andere witte bloedcellen, neutrofielen tonen verschillende drijfvermogen waardoor het mogelijk is om een&gt; 98% zuivere populatie neutrofielen te verkrijgen wanneer onderworpen aan een dichtheidsgradiënt. Maar naastde normale hoge dichtheid neutrofielen populatie (HDN) bij kankerpatiënten, in tumordragende muizen, evenals onder chronische ontstekingsaandoeningen, verschillende low-density neutrofielen populaties (LDN) zijn opgenomen in de circulatie. LDN co-zuivert met de mononucleaire fractie en kan worden gescheiden van mononucléaire cellen met behulp van positieve of negatieve selectie strategieën. Wanneer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen wordt bepaald door flow-cytometrie, kunnen ze worden toegepast voor in vitro en in vivo functionele assays. We beschrijven technieken voor het bewaken van de antitumoractiviteit van neutrofielen, hun vermogen om te migreren en reactieve zuurstofsoorten te produceren, alsmede toezicht op hun fagocytische capaciteit ex vivo. We technieken beschrijven verder de neutrofielen in vivo traceeretiket en hun anti-metastatisch vermogen in vivo te bepalen. Al deze technieken zijn essentieel voor het begrip van het verkrijgen en karakteriseren neutrofielen met anti-tumorfunctie.

In een recente studie van een anti-metastatische werking van neutrofielen 6 identificeerden we. Neutrofielen van tumordragende muizen verwerven van een cytotoxische fenotype en het vermogen om tumorcellen te doden 6. Dit in tegenstelling tot neutrofielen uit naïeve muizen die geen significante anti-tumor effect 6 hebben. Enkele van de in de sectie protocol beschreven technieken gebruikt voor het bestuderen van anti-tumor neutrofielfunctie in vitro en in vivo 6.</su...

Neutrofielen spelen niet alleen een belangrijke rol bij de verdediging van het gastheerlichaam tegen binnendringende micro-organismen, maar zijn ook betrokken bij de immuunbewaking van tumorcellen. Hier beschrijven we technieken met betrekking tot de isolatie van neutrofielen met anti-tumoreigenschappen en methoden voor het monitoren van anti-tumor neutrofielen functie in vitro en in vivo.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van neutrofielen bij kanker te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst perifeer bloed af te nemen. In de tweede stap worden de neutrofielen gezuiverd via een dichtheidsgradiënt, gevolgd door een co-cultuur gedurende één nacht.Met luciferase-gelabelde tumorcellen wordt vervolgens de luciferase-activiteit van de cellen gekwantificeerd. Uiteindelijk kan de hoeveelheid luciferase in elke co-cultuur invers worden gecorreleerd aan de cytotoxiciteit van de neutrofielen binnen elke co-cultuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals antilichaam-gebaseerde scheiding van neutrofielen en andere methoden voor het evalueren van de celviabiliteit, is dat deze procedure de aspecifieke activatie van neutrofielen minimaliseert en de meting van de celviabiliteit mogelijk maakt zonder het gebruik van radioactieve labels.Deze procedure wordt gedemonstreerd door een promovendus uit mijn laboratorium en Dr. Simoni, een postdoctoral fellow in mijn laboratorium. Om neutrofielen te isoleren uit een tumor dragende muis, begint u met het verdunnen van één milliliter bloed, verkregen via een hartpunctie, in PBS met 0,5% BSA tot een eindvolume van zes milliliter. Voeg vervolgens drie milliliter steriel gefilterde sucrose van 1,119 g/mL toe aan de bodem van een conische polypropyleen centrifugebuis van 15 milliliter. Kantel daarna de buis langzaam en voorzichtig.Breng drie milliliter steriel gefilterde sucrose van 1,077 gram per milliliter aan bovenop de sucrose van 1,119 gram per milliliter, gevolgd door de zes milliliter verdund bloed. Scheid de cellen in de sucrosegradiënt door 30 minuten te centrifugeren bij 700 Gs op kamertemperatuur. Na het stoppen van de centrifugatie aan het einde van de scheiding zullen de meeste erytrocyten zich onderaan de buis bevinden.De neutrofielen met een hoge dichtheid bevinden zich rond de markering van drie milliliter in de wit-rode ring op de interface tussen de sucroselagen. Terwijl de leukocyten met een lage dichtheid zich in de witte ring op de interface tussen de laag van 1,077 gram per milliliter en de BSA-bevattende PBS bevinden rond de markering van zes milliliter, wordt de P-B-S-B-S-A-laag afgezogen tot vijf millimeter boven de cellaag met een lage dichtheid. Verwijder vervolgens de cellen met een lage dichtheid met een pipetteertip van één milliliter door langzame zuiging terwijl de cellen langzaam worden bewogen.Breng de cellen over in 30 milliliters PBS met 0,5% BSA. Draag vervolgens de neutrofielen met een hoge dichtheid over naar een aparte buis met 30 milliliters PBS plus BSA. Centrifugeer op dezelfde wijze beide sets cellen en resuspendeer de pellets vervolgens in 36 milliliters steriel HPLC-grade water.Herstel na 30 seconden de isotonie van de cellen met negen milliliters 5x PBS aangevuld met 2,5% BSA en centrifugeer de cellen. Resuspendeer de cellen vervolgens opnieuw in 10 milliliters PBS-BSA en bepaal het aantal levensvatbare cellen middels trypaanblauw-uitsluiting. Resuspendeer de neutrofielen na een volgende centrifugatie in incubatiemedium bij de juiste uiteindelijke celdichtheid.Om circulerende neutrofielen te isoleren van een kankerpatiënt. Begin met het mengen van 10 milliliters gehepariniseerd menselijk bloed met een gelijk volume 3% DExT strand T 500 in zoutoplossing voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur om de erytrocyten te laten bezinken. Wanneer de rode bloedcellen zijn bezonken, wordt het leukocytenrijke supernatant langzaam over 10 milliliters 1,077 grams per milliliter sucrose gegoten, waarna de cellen door centrifugatie worden gescheiden. Zoals zojuist gedemonstreerd zullen de menselijke high-density neutrofielen aanwezig zijn in het pellet, terwijl de low-density neutrofielen samen met de monocyten en lymfocyten zuiveren op de interface tussen de 1,077 grams per milliliter sucroselaag en het plasma.Nadat de neutrofielen zijn verzameld zoals zojuist gedemonstreerd, worden de cellen gedurende 30 seconden verdund in 10 milliliter 0,2% natriumchloride om de contaminerende erytrocyten te lyseren. Voeg vervolgens 10 milliliter 1,6% natriumchloride toe om de isotoniciteit van de cellen te herstellen en keer de buis één keer om om te mengen. Centrifugeer de cellen en was het pellet drie keer in 20 milliliter HBSS.Tel vervolgens de cellen en resuspendeer deze in RPMI 1640, aangevuld met 2% FBS bij de juiste celdichtheid. Om door glyco of Xan geëliciteerde neutrofielen te isoleren, gebruikt u een tuberculinespuit met een naald van 23 gauge en één inch voor intraperitoneale injectie.Injecteer één milliliter van de juiste oplossing in de buikholte van de muis. Vier tot 24 uur later injecteert u vijf milliliter steriele PBS in het peritoneum van het geëuthanaseerde dier met een spuit van vijf milliliter die is voorzien van een 25 gauge naald van vijf achtste inch. Masseer het peritoneum voorzichtig en zuig vervolgens de vloeistof terug in de spuit om de cellen uit het peritoneale exsudaat te verzamelen.Was de cellen in RPMI 1640, medium aangevuld met 10% FBS. Om vervolgens de macrofagen te verwijderen, worden 10⁶ cellen per milliliter gedurende twee uur bij 37 °C geïncubeerd in een kweekschaal van weefselkweekkwaliteit met medium aangevuld met FBS. Om de geïsoleerde neutrofielen te kleuren, worden 1 x 10⁵ cellen resuspendeerd in aliquots van 50 µL PBS en worden de celsuspensies gecentrifugeerd in een adapter voor dunne-laag celpreparaten bij 150 ×g. Scheid na vijf minuten de geprepareerde glazen objectglazen van de adapter en fixeer en kleur de cellen.Was de objectglaasjes vervolgens 15 keer met kraanwater. Laat de objectglaasjes opnieuw aan de lucht drogen en inspecteer de cellen vervolgens onder een lichtmicroscoop om de antitumoractiviteit van de neutrofielen te beoordelen. Verdun vijf keer 10⁴ luciferase-gelabelde tumorcellen per milliliter in geoptimaliseerd medium met verlaagd serum, aangevuld met 0,5% FBS.Zaai vervolgens 5 × 10³ van de tumorcellen in 100 µL geoptimaliseerd medium met verlaagd serum dat 0,5% FBS bevat in elke put van een witte 96-wells vlakbodem weefselkweekplaat. Voeg vier uur later 1 × 10⁵ neutrofielen in 50 µL geoptimaliseerd medium met verlaagd serum dat 0,5% FBS bevat toe aan elke put voor een incubatie gedurende de nacht. Aspireer de volgende ochtend voorzichtig het supernatant en was elke put met 200 µL PBS.Aspireer vervolgens de PBS en voeg 50 µL passieve lysisbuffer toe aan elke put. Incubeer de plaat daarna, afgedekt met folie, op een orbitale schudder bij 150 RPM bij kamertemperatuur. Plaats de plaat na 20 minuten in een luminescentie-plaatlezer.Injecteer 50 µL luciferase-assayoplossing in elke put en meet de chemiluminescentie gedurende 10 seconden per put. Gebruik tot slot de formule om het percentage tumorlyse te berekenen om de mate van neutrofielcytotoxiciteit te testen in dit representatieve experiment 1 × 10⁵. Neutrofielen werden gecocultiveerd met luciferase-expresserende 4T1-doelcellen, zoals zojuist gedemonstreerd in cocultures met neutrofielen gezuiverd uit tumorvrije muizen.Er werd zeer weinig doding van de tumorcellen waargenomen. Neutrofielen die waren gezuiverd uit tumordragende muizen vertoonden echter een significant niveau van cytotoxiciteit om de immunosuppressieve eigenschappen van de neutrofielen met lage en hoge dichtheid te testen. Het aantal CD8-positieve milt-T-cellen na stimulatie met anti-CD3 of anti-CD3 plus neutrofielen met lage of hoge dichtheid werd beoordeeld na activatie met anti-CD3.Er werd een dramatische toename van de CD8-positieve cellen waargenomen. Co-cultuur met neutrofielen met een lage dichtheid leidde echter tot een merkbare afname van de CD8-positieve cellen, een effect dat niet werd waargenomen in de aanwezigheid van neutrofielen met een hoge dichtheid. De mate van CFSE-retentie werd daarnaast geëvalueerd als indicator voor proliferatie.Let op de verschuiving naar links in de met anti-CD3 behandelde cellen en de met anti-CD3 behandelde cellen die gekweekt zijn in de aanwezigheid van neutrofielen met een hoge dichtheid, wat in beide gevallen een toename in de proliferatie van CD8-positieve cellen aantoont. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het meten van oxidatieve bursts, fagocytose of migratie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe wordt de functie van neutrofielen beïnvloed onder verschillende pathologische scenario's?

isolation-characterization-neutrophils-with-anti-tumor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit rapport beschrijven we een protocol voor het isoleren van zeer zuivere populaties van leucocyten dat tumoren te infiltreren. Dit protocol is een bewerking van de Miltenyi Biotech-protocol om opbrengst en zuiverheid voor het isoleren van cellen van complexe tumorweefsel te verbeteren.

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

In this video, we demonstrate the isolation of cytotoxic high-density neutrophils and low-density neutrophils from the blood of a tumor-bearing mouse by discontinuous sucrose gradient centrifugation.

Isolation of Cytotoxic Neutrophils from Tumor-Bearing Mouse Blood

This video demonstrates an assay to generate anti-angiogenic tumor-associated neutrophils (TANs). Upon taking a murine melanoma tumor containing pro-angiogenic TANs, the single cells are isolated using fluorescence-activated cell sorting (FACS) and treated with an inhibitor of nicotinamide phosphoribosyl transferase (NAMPT) to reduce the capacity to stimulate angiogenesis.

Generating Anti-Angiogenic Tumor-Associated Neutrophils

Neutrofielen zijn het meest voorkomende type witte bloedcellen. Hier worden de isolatie van neutrofielen uit menselijk bloed door middel van dichtheidsgradiëntscheiding en de differentiatie van menselijke promyelocytische (HL60) cellen langs de granulocytische route beschreven; om hun rol in de gevoeligheid van lymfoomcellen voor anti-lymfoom middelen te testen.

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Nieuwe protocollen worden hier beschreven om te isoleren en karakteriseren van deeltjes afgeleid van mens en muis neutrofiele granulocyten. Deze protocollen gebruiken ultracentrifugatie en stroom cytometry immunoblotting technieken voor het analyseren van microparticle inhoud, en ze kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de rol van deeltjes afgeleid van verschillende celtypes in cellulaire functie.

Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies

Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.

Neutrofiele extracellulaire Traps gegenereerd door lage dichtheid neutrofielen verkregen peritoneale Lavage vloeistof bemiddelen Tumor celgroei en bijlage

Hier presenteren we een protocol voor het detecteren van de aanwezigheid van neutrofielen in secties van de histologie vaste/permeabel en beoordelen van de activeringsstatus van levende gezuiverde neutrofielen. In het bijzonder de MUB40 peptide gebonden Lactoferrine in submodules neutrofiele-specifieke en tertiaire aanwezig. Blootstelling van de submodule inhoud via permeabilization of neutrofiele activering zorgt voor de markering van de neutrofielen.

De MUB40 Peptide voor gebruik bij de opsporing van ontsteking neutrofiele-gemedieerde gebeurtenissen

Hier tonen we therapeutisch potentieel van Anti-angiogene tumor-geassocieerde neutrofielen na hun overdracht in tumor-dragende muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de neutrofiele activiteit ex vivo te manipuleren en vervolgens hun functionaliteit in vivo te evalueren bij het ontwikkelen van tumoren. Het is een geschikt model voor het bestuderen van potentiële op neutrofielen gebaseerde immunotherapieën.

Overdracht van gemanipuleerde tumor-geassocieerde neutrofielen in tumor-dragende muizen om hun angiogene potentiaal in vivo te bestuderen

Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van neutrofielen uit volbloed, buffy coats of leukaferesemembranen, het bereiken van een goede opbrengst, hoge zuiverheid en minimale celactivering. We maken gebruik van gradiëntzuivering, rode bloedcel (RBC) sedimentatie en RBC-lysis om een hoogwaardig / zuiver neutrofielenpreparaat te verkrijgen.

Isolatie van menselijke neutrofielen van volbloed en buffy jassen

Dit gedefinieerde protocol beschrijft een real-time high-throughput microscopiebenadering om de afgifte van humane neutrofielen extracellulaire val (NET) in vitro te visualiseren en te kwantificeren. De reproduceerbare methode maakt onderzoek mogelijk naar de kenmerken en kinetiek van NETosis-afgifte na stimulatie met verschillende NETosis-inductoren en maakt beoordeling van de farmacologie van NETosis-antagonisten mogelijk.

Realtime, high-throughput microscopische kwantificering van de afgifte van extracellulaire vallen van menselijke neutrofielen en beoordeling van de farmacologie van antagonisten

Hier bieden we een betrouwbare benadering voor het isoleren van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed met behulp van magnetische isolatie (negatieve selectie) en een discontinu dichtheidsgradiëntmedium. Het zorgt voor ongerepte isolatie van cellen met een hoge zuiverheid (≥93%), waardoor een nauwkeurige stroomafwaartse analyse van neutrofielensubpopulaties mogelijk is, cruciaal voor het begrijpen van hun rol in gezondheid en ziekte.

De isolatie en karakterisering van neutrofielen met een lage en normale dichtheid uit volbloed

Leer neutrofielen isoleren met anti-tumor eigenschappen via dichtheidsgradiënt en co-cultuur met luciferase-gelabelde tumorcellen. Deze methode minimaliseert niet-specifieke activatie en meet cytotoxiciteit zonder radioactieve labels.

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Meer video's verkennen