Name: qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer een high-throughput real-time PCR-methode voor PCRTag-genotypering in gist zonder gelelektroforese. Deze techniek verbetert de doorvoer van het synthetische gistgenoomproject aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door de National Science Foundation Grant MCB-0718846 en de Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (tot JDB). LAM werd gefinancierd door een postdoctorale beurs van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada. De publicatie van dit artikel wordt gesponsord door Roche.

1. Bereid Gist Genomic DNA (gDNA) <ol><li> Bereid een voorraad van gist Lysis Buffer 9 die 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS bevat (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Als uitgangsmateriaal gebruik ~ 2 x 10 6 cellen, die gewoonlijk overeenkomt met ~ 100 pi verzadigde kweek van melkzuurbacteriën van de BY4741 10 achtergrond. Gekweekte cellen worden verzameld door centrifugeren bij 1000 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Zuig de supernatant. </li><li> Voeg 200 ul van Gist Lysis Buffer en resuspendeer de celpellet door pipetteren. </li><li> Voeg ~ 300 ul van zuur gewassen glasparels zodanig dat het niveau van korrels ongeveer 1 mm onder het niveau van de celsuspensie. </li><li> In een zuurkast voeg 200 ul fenol / chloroform / isoamylalcohol (25: 24: 1). Cap de microfugebuis en ervoor zorgen dat er geen kralen vastzitten tussen de kap en de buis als dit zal resulteren in lekken tijdens het schudden(Stap 1.6). Omkeren 3 keer te mengen en controleren of de dop verzegeld. </li><li> Schud de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met een benchtop menger, zoals een Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht 75 pl van de waterige fase naar een nieuwe microcentrifuge buis met 1 ml 100% ethanol. Omkeren 10 keer om te mengen. </li><li> Pellet de DNA door centrifugatie bij 20.800 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatans niet losraakt het DNA pellet. Was de pellet met 500 pl 70% ethanol. </li><li> Centrifugeer bij 20.800 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant zonder loskomen van het DNA pellet en air-droog de pellet met de microfugebuizen kap open tot overmaat ethanol verdampt is, dat is meestal rond de 10 min. </li><li> Resuspendeer de DNA pellet in 75 gl 10 mM Tris pH 7,4 en vortex mengen. Bewaar het monster bij -20 ° C oneindig. Meet de concentratie van DNA in het monster met behulp van eenBenchtop fluorimeter zoals qubit, die DNA onderscheidt van RNA. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van gDNA is ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Bereid een 1:10 verdunning van genoom DNA met water en vortex te mengen. </li><li> Aliquot 30 pi van verdunde gDNA in de juiste putje van een bronplaat die compatibel is met nanoschaal akoestische vloeistofuitreiker (stap 3) is. Bij gebruik van een Labcyte Echo 550, gebruik dan een 384 en polypropyleen plaat (384PP plaat). OPMERKING: Bij geschikte afgedichte deze plaat kan worden bewaard gedurende ten minste één maand bij -20 ° C. </li></ol> 2. Bereid en Dispense qPCR Master Mix in een 1536 Multiwell Plate <ol><li> Bereid 850 ul qPCR master mix zoals LightCycler 1536 DNA Green Master in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vortex te mengen. Centrifugeer de qPCR master mix voor 2 min bij 20.800 xg bij kamertemperatuur om eventuele luchtbellen te verwijderen. De componenten van de qPCR master mix vereist voor een multiwell plaat 1536 zijn als volgts: <ol><li> Combineer 170 ul enzym master mix (Green Master Tube 1, 5x geconcentreerde), 42,5 ul van SYBR (Green Master Tube 4, 20x geconcentreerd) en 637,5 pl water. </li></ol></li><li> Doseer 500 nl / ver in 1536 een multiwell plaat met behulp van een vloeibare bulk dispenser zoals de Art Robbins Cobra. (Merk op dat de stappen 2.2.1-2.2.4 verwijst specifiek naar de Cobra.) <ol><li> Maak een afgifte-programma met de volgende instellingen: vloeibaar klasse, water; aspireren volume, 800 pl; afzien volume, 500 nl; wassen tijd, 20 sec. In het afzien instellingen, controleert de dispense snelheid wordt ingesteld op 49,6 mm / sec, het afzien offset 0,25 mm, en overtollige aangezogen vloeistof terug in de bron worden afgegeven ook. </li><li> Plaats de microfugebuis met de qPCR master mix in goed A1 van de microfugebuis houder, die is gelegen in deck positie 1. Snijd de dop van de microfugebuis of gewoon open laten. Stel de &#39;Zuig goed&#39; tot A1 door het bewerken van de Aspirate instellingen. </li><li> Voer een wasstap voorafgaand aan doseren qPCR master mix van eerste-de keuze van de aspireren en afzien van stappen van de set-up in stap 2.2.2 programma en vervolgens raken &#39;run&#39;. Eenmaal voltooid, re-selecteer het aspireren en afzien stappen voorafgaand aan het uitvoeren van het volledige programma af te zien qPCR master mix. Indien de Cobra gezeten inactief minder dan 10 minuten de eerste wasstap, dat dient om het systeem te ontluchten, overbodig. </li><li> Hit &#39;run&#39; af te zien van qPCR master mix aan elk putje. </li></ol></li><li> Verzamel de qPCR master mix op de bodem van elk putje door korte centrifugeren van de 1536 multiwell plaat (30 sec met een lage snelheid PCR plaat spinner). </li></ol> 3. Doseer Template DNA en primers in de 1536 Multiwell Plate <ol><li> Breng 5 nl van verdunde gDNA (stap 1,3) in de gewenste putjes van de multi- putjesplaat 1536 middels een akoestisch vloeistof transfersysteem, zoals Echo 550. <ol><li> Voor de Echo 550, gebruik maken van de plaat Reformat software of als alternatief te bieden een aangepaste Excel spreadsheet om de overdracht te programmeren. Zorg ervoor dat de geselecteerde bron goed voor de gDNA in het programma past bij de bron goed waarin u fysiek afgezien van de gDNA (stap 1.3). Kies de bronplaat type &#39;384PP_AQ_BP2 &quot;, die aangeeft de vloeistof in de 384PP plaat een buffer zonder surfactanten. </li></ol></li><li> Breng 10 nl van primers, voorgemengd vooruit en achteruit tot een eindconcentratie van 50 uM elk, in de gewenste putjes van de multi- putjesplaat 1536 middels een akoestisch vloeistof transfersysteem, zoals Echo 550. <ol><li> Voor de vloeibare transfersysteem, gebruik maken van de plaat Reformat software of als alternatief te bieden een aangepaste Excel spreadsheet om de overdracht te programmeren. OPMERKING: Hier is het mogelijk om primers te doseren zodat de lay-out op de 1536 multi- putjesplaat past het chromosomale volgorde van de primers zodat het gemakkelijk is om de real time PCR resultaten visueellater (stap 6). </li><li> Premix de primers in een plaat die compatibel is met de akoestische vloeistof dispenser is. Voor de Echo 550, gebruik dan een Labcyte 384LDV (laag dood volume) plaat en kies de bron plaat type &#39;384LDV_AQ_B&#39; bij het programmeren van de Echo aan te geven van de vloeistof is een eenvoudige buffer zonder eiwitten. </li></ol></li></ol> 4. Seal en Centrifuge de 1536 Multiwell Plate <ol><li> Met behulp van een microplaat sealer systeem zoals de Plateloc Thermal Microplate Sealer, onmiddellijk sluit de 1536 multiwell plaat met behulp van optisch heldere afdichting die compatibel zijn met de hitte sealer instrument is. Raak het oppervlak niet aanraken van de afdichting om smudge vlekken te voorkomen. <ol><li> Als het gebruik van de Plateloc Thermal Microplate Sealer, gebruikt u de volgende instellingen: verzegelen tijd 2,0 sec, seal temperatuur 162 ° C, de luchtdruk 82 psi. Dit instrument is nu ~ 5 min verhitten en bijgevolg ten worden ingeschakeld voren. </li><li> Als het gebruik van de Plateloc Thermal Microplate Sealer, een adapter worden gebruikt om de hoogte van de 1536 multi- putjesplaat van de fase van het instrument te verhogen om een ​​goede afdichting te waarborgen. OPMERKING: Hoewel het de voorkeur om een ​​Stage Plate kopen voor de Plateloc Thermal Microplate Sealer, een alternatieve oplossing is tot vier ~ 2 mm dik standaard wasmachines beschikbaar te voegen op elke bouwmarkt in de hoeken om de hoogte van de 1536 multiwell plaat te verhogen. </li></ol></li><li> Centrifugeer Onmiddellijk de afgedichte 1536 multiwell plaat bij 2000 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur om alle reagentia te verzamelen op de bodem van elk putje. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programmeer 1536 qPCR instrument, zoals de LightCycler 1536, met een tweestaps amplificatie protocol gevolgd door een smelt curve analyse. Met behulp van de software LightCycler 1536 het opzetten van een programma als volgt: <ol><li> Pre-incubatie: 95 ° C, 1 min hold, toenamesnelheid 4,8 ° C / sec, geen verwerving. </li><li> Two Step Amplificatie: 30 cycli van [95 ° C, geen vat,ramp rate 4.8 ° C / sec, geen verwerving; 64 ° C, 30 sec hold, oprit snelheid 2,5 ° C / sec, enkele overname]. </li><li> Smelt curve: 95 ° C, 10 sec, ramp rate 4.8 ° C / sec, geen verwerving; 60 ° C, 1 min, helling snelheid 2,5 ° C / sec, geen verwerving; 97 ° C, oprit snelheid van 0,1 ° C / sec, 5 acquisities / ° C (continu). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, oprit snelheid 2,5 ° C / sec, geen verwerving. </li></ol></li><li> Stel de Detection Format om &#39;Green intercalerende Dye&#39; in het tabblad Run Definition. </li><li> Stel het pipetteren controle om &#39;Master Control&#39; op het tabblad Run Definition. Deze functie dient als een interne controle en de aanwezigheid van qPCR Master Mix van elke well van de multi-putjesplaat 1536, hetgeen nuttig vermeende valse negatieven identificeren detecteert. </li><li> Plaats de 1536 multiwell plaat bereid in stappen 2-4 in de 1536 qPCR instrument en start het programma. </li></ol> 6. Data Analysis <ol><li> PerfORM visuele inspectie van de gegevens binnen de qPCR software. Opmerking: De 1536 software maakt visualisatie van zowel de amplificatie en smelt curven, en een warmte kaart van de oproep (positieve, negatieve, ongeldige, N / A, figuur 2), de doorlaatpost waarde (glijdende kleurenschaal positieve of grijs voor negatieve Figuur 3), of een eindpunt fluorescentie (EPF) waarde (glijdende schaal kleur). </li><li> Gegevens van de 1536 Software in de vorm van een txt-bestand (resultaten tabel) of een XML-bestand met ofwel de ruwe data of berekende gegevens voor het verwerken van offline uit het instrument Export. OPMERKING: De gepatenteerde geautomatiseerde kruispunt (Cp) roepen algoritme is ingebouwd in de 1536 software houdt rekening met de vorm en de helling van de amplificatiecurve het bepalen van positieve / negatieve en Cp waarde oproepen met grote zekerheid bij lage sub microliter reactievolume met relatief lage fluorescentiewaarden. </li><li> Als de LightCycler DNA Green Master was gebruikd voor qPCR, controleren of alle putten geslaagd voor de &#39;master control&#39;. Een onvoldoende geeft het ook niet ontvangen qPCR master mix en de ontbrekende gegevens punt moet worden beschouwd als een mogelijk vals negatief. Controleer of alle putjes geslaagd voor de &#39;master control&#39;. Een onvoldoende geeft het goed deed DNA mastermix niet ontvangen en overwegen de ontbrekende gegevens punt een potentiële vals negatief. </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM, NAP, JAM en JDB hebben niets te onthullen. RC en AL zijn in dienst van Roche Life Science, de VS en werkte aan de ontwikkeling van de applicatie met LAM als onderdeel van een proof of principle experiment.

Integratie van real-time PCR-detectie in de PCRTag genotypering test is een belangrijke ontwikkeling voor de Sc2.0 project als het in staat stelt aanzienlijk hogere doorvoer. De vorige workflow aangegeven 2,5 ul reacties in 384 goed PCR-platen, 1,5 uur thermische fietsen run time, agarosegelelektroforese en handmatige annotatie van de gel. De hier gepresenteerde workflow, genaamd qPCRTag analyse, overwint een aantal belangrijke knelpunten. Eerst een qPCRTag run condenseert 4 x 384 putjes in één experiment dat kan worden verwerkt, start tot finish (plaat opzetten plus looptijd), in ongeveer een uur. Het is belangrijk om op te merken dat de kosten reagens per goed voor qPCRTag analyse is op een lijn met de lagere doorvoersnelheid agarose-gel gebaseerde aanpak. Echter, door het omzeilen van gelelektroforese en handmatige annotatie, de qPCRTag workflow biedt aanzienlijke besparingen in tijd en arbeid, die de belangrijkste voordelen zijn. Belangrijk is dat de qPCRTag workflow is entirely compatibel met automatisering. Een groot probleem bij het gebruik van real time detectie als de output van de PCRTag test is het aantal valse positieven en valse negatieven. Aangezien PCRTag primers werden oorspronkelijk ontworpen voor gebruik in real time PCR, wordt verwacht dat niet alle primerparen geschikt voor dit uitgevoerd wordt. Daarom is het belangrijk om de functie en specificiteit van PCRTag primerparen valideert om deelverzameling die niet werken in de real-time-based assay voorin sluiten. Zo chromosoom 3 PCRTag valse positieven en negatieven bijproducten en grote reproduceerbaar in de real time PCR-gegevens (figuren 2 en 3) en deze kunnen van verdere analyse worden uitgesloten. Verder primerparen bekend mislukt (beoordeeld door gelelectroforese en getoond in Figuren S6 en S7 van Annaluru et al. 1) kan ook worden uitgesloten. Dit is eenvoudig te eenvoudig volbracht excluDing de defecte primerparen bij het opzetten van de akoestische transfer protocol. Net als de meeste high throughput testen, zijn we van plan om real time PCRTag detectie gebruiken als primaire scherm om transformanten die verder stroomafwaarts validatie verdienen identificeren. Vervolgens zal de gouden standaard voor de secundaire screening PCRTag analyse met gelelektroforese als de uitlezing blijven. Afgezien van de toepassing van PCRTag analyse voor Sc2.0, state-of-the-art nanoschaal liquid handling systemen te combineren met een high throughput real-time PCR-technologie maakt een snelle en geautomatiseerde analyse en heeft potentie om vele gebieden beïnvloeden. Bijvoorbeeld kan deze workflow worden toegepast high throughput screening bibliotheek, infectieziekten diagnose, microbiome analyse en cutting-edge genoom editing benaderingen probeert meerdere loci gelijktijdig wijzigen.

Sc2.0 of de Synthetic Gist Genome Project ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), is het doel van het ontwerpen en bouwen van een geheel synthetische eukaryotisch genoom ingesteld. Met behulp van de zeer samengesteld genoomsequentie van Saccharomyces cerevisiae 3 als uitgangspunt, elk van de zestien lineaire chromosomen is opnieuw ontworpen om een reeks van design principes die aangeven behoud cel fitness, het verbeteren van stabiliteit van het genoom, en het vergroten van de genetische flexibiliteit te voldoen. Zo worden destabiliserende elementen als herhalingen van Sc2.0 chromosomen verwijderd. Alle gevallen van TAG stopcodons worden opnieuw gecodeerd naar TAA &#39;vrij&#39; een codon in de laatste soort voor het invoeren van een niet-genetisch gecodeerde aminozuren. Daarnaast is een induceerbaar evolutie systeem, Scramble, mogelijk gemaakt door het Cre-lox systeem, maakt een ongekende capaciteit om afgeleide genomen met nieuwe structuren 4 te genereren. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; ander belangrijk element in de Sc2.0 genoom is de invoering van PCRTags, die als DNA watermerken te volgen van synthetische en wildtype DNA mogelijk. PCRTags zijn kort, re-gecodeerde segmenten in ORF op synthetische chromosomen; terwijl de PCRTag sequenties verschillen op DNA niveau tussen synthetisch en wildtype chromosomen, de gecodeerde eiwitten identiek is in aminozuursequentie en dus vermoedelijk functie. PCRTag sequenties zijn speciaal ontworpen als primer bindingsplaatsen selectieve amplificatie (Figuur 1A) te vergemakkelijken. PCRTag ontwerp wordt uitgevoerd met de meest verschillende &quot;algoritme GeneDesign 5,6, hetgeen opnieuw gecodeerde synthetische sequenties die typisch ~ 60% verschillen van de natieve sequenties (minimaal 33%) bij een smelttemperatuur tussen 58 ° C en 60 ° C en amplicon lengte tussen 200-500 basenparen 2. Hercodering niet binnen de eerste 100 bp van elk ORF toegelaten, aangezien deze gebieden is bekendhebben speciale voorkeuren in termen van codongebruik 7. Samen vormen deze ontwerpregels voorstander hoge prestaties van bijna alle PCRTags onder één set van PCR omstandigheden waarbij synthetische en wild type PCRTag primerparen uitsluitend binden en versterken synthetische en inheemse DNA, respectievelijk (Figuur 1B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figuur 1:. PCRTag schema (A) PCRTags worden gehercodeerd sequenties binnen open reading frames (ORF) van genen Sc2.0 chromosomen. (B) Synthetische (SYN) en wild type (WT) PCRTag primers uitsluitend binden en versterken synthetische en wild type genoom DNA (gDNA), respectievelijk. Deze afbeelding toont een analyse van ~ 30 kb segment van de linker arm van chromosoom zes testen dertien PCRTag primerparen behulp WT of semi-synVIL2 gDNA als matrijs. In veel gevallen codeert voor een ORF meerdere PCRTag. De aanwezigheid / afwezigheid van amplicons PCRTag wordt beoordeeld via agarose gel elektroforese. PCRTag amplicons variëren in grootte van 200 bp tot 500 bp. De sneller migrerende species onderaan de panelen primer dimeren. PCRTag analyse heeft zich bewezen als een belangrijk instrument in de assemblage van Sc2.0 chromosomen zijn. In een typisch experiment 30-50 kb synthetisch DNA, coderend 20-30 PCRTags, wordt getransformeerd in gistcellen tot het overeenkomstige wildtype DNA 1,2,8 vervangen. PCRTag analyse wordt vervolgens gebruikt om transformanten die synthetische maar niet wildtype PCRTags verspreid dat segment van DNA coderen te identificeren, of zogenaamde &quot;winnaars. Het is meestal niet nodig om meerdere transformanten testen om &#39;winnaars&#39; te identificeren, zodat doorvoer en de kosten van PCRTag analyse zijn belangrijke overwegingen. Momenteel zijn er twee Sc2.0 chromosomen zijn afgerond (synIII 1 en synIXR 2), die minder dan 10% van de Sc2.0 genoom, although meer dan de helft van de resterende chromosomen worden momenteel synthese en assemblage. De omvang van PCRTag analyse nodig is voor dit project wordt snel sneller dan de mogelijkheid om gels draaien en handmatig de score van de aanwezigheid van synthetisch DNA en de afwezigheid van wild type DNA. Voor een betere doorvoer van het PCRTag assay hebben wij een workflow met real time PCR met gebruik van agarose gelelektroforese omzeilen ontwikkeld. De workflow maakt gebruik van een bulk vloeistof dispenser om qPCR mastermix verdelen in elk putje van een 1536 multiwell plaat, een nanoschaal akoestische vloeistof dispenser om template-DNA en primers te dragen, en een 1536 qPCR thermocycler, waardoor we reacties miniaturiseren tot 500 nl en maximaliseren van de doorvoer. Bovendien analyse kan worden geautomatiseerd. Dit type van high throughput genotypering protocol moet generalizable elk project waarvoor de analyse van de vele klonen op meerdere loci zijn.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Gist gDNA prep</td></tr><tr><td>gist gDNA</td><td>custom</td><td>custom</td><td>sjabloon voor real time PCR</td></tr><tr><td>Zuurgewassen glazen kralen (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>gistcel lysis</td></tr><tr><td>Ultrapuur Fenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>gistcel lysis</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>gistcel lysis</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>gistcel lysis</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA kwantificering</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA kwantificering</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plaat</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA bronplaat</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep en dosering</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR mastermix</td></tr><tr><td>1,5 ml Microfuge Tube Holder</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>microfuge tube houder voor deck van Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra liquid handling systeem</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>doseer qPCR mastermix in 1536 plaat</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>centrifugatie van 1536 plaat</td></tr><tr><td colspan="4">Template en primer dosering</td></tr><tr><td>PCRTag primers</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>voorgemengde voorwaartse en omgekeerde, 50 μM elk</td></tr><tr><td>TempPlate doorboorbare afdichtingsfolie, sterieel</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>tijdelijke afdichting voor PCRTag primer platen</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 putjes plaat</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>voorgemengde primer bronplaat</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>overdracht van 2,5 nl druppels primer en sjabloon DNA in 1536 plaat</td></tr><tr><td>Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>hittesluiting voor 1536 plaat voorafgaand aan LC1536 run</td></tr><tr><td>Clear Permanent Seal</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optisch heldere hittesluiting voor LC1536 multiwell plaat</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>kan ~2 mm dikke ringen vervangen</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifugeer hittesluiting 1536 plaat</td></tr><tr><td>Industriele Luchtcompressor</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>voor het runnen van de Echo en Hittesluiting</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>vereist 220 V stopcontact</td></tr></tbody></table>

qpcrtag analyse - een high throughput, real time pcr test voor sc2.0 genotypering

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

De Synthetic Gist Genome Project (Sc2.0) streeft naar 16 designer gist chromosomen bouwen en te combineren in een enkele gistcel. Om een synthetische chromosoom, synIII 1 en een synthetisch chromosoom arm synIXR 2 heden, werden geconstrueerd en de in vivo effecten aangetoond in de afwezigheid van de overeenkomstige wildtype chromosomen. Een belangrijk kenmerk van het ontwerp Sc2.0 chromosomen is de introductie van PCRTags, die korte, re-gecodeerde sequenties in open reading frames (ORF) dat differentiatie van synthetische chromosomen mogelijk uit hun wild-type tegenhangers. PCRTag primers hybridiseren selectief ofwel synthetische of wildtype chromosomen en de aanwezigheid / afwezigheid van elk type DNA kan worden getest met een eenvoudige PCR-test. De standaard uitlezing van de PCRTag assay aanwezigheid / afwezigheid van amplicons evalueren met agarosegelelektroforese. Echter, met een gemiddelde PCRTag amplicon dichtheid van één per 1,5 kb en agenome grootte van ~ 12 Mb, zal het ingevulde Sc2.0 genoom coderen ruwweg 8.000 PCRTags. Om throughput verbeteren, hebben we een real time PCR-gebaseerde detectie assay voor PCRTag genotyperen dat we qPCRTag analyse noemen ontwikkeld. De workflow bepaalt 500 nl reacties in een 1536 multiwell plaat, waardoor wij testen maximaal 768 PCRTags met zowel synthetische en wild-type primer paren in één experiment.

We testten synthetische en wild type chromosoom 3 PCRTag primerparen 1 met gist genomische DNA (gDNA) gewonnen uit vier verschillende stammen. Chromosoom 3 heeft 186 PCRTag primerparen dat de lengte van het chromosoom overspannen (synIII is ~ 270 kb en wildtype chromosoom 3 is ~ 315 kb). Aan elk van de vier stammen met beide primers testen, verdeelden we de multi-putjesplaat in vier kwadranten, een voor elk van gDNA, toewijzen PCRTag synthetische primers om de bovenste helft van elk kwadrant en wildtype naar de onderste helft. Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de giststammen, waarvan twee coderen voor wildtype chromosoom 3 (wild type, synIXR 2), terwijl de overige twee encode synthetische chromosoom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Master Mix werd verdeeld in elk putje van een 1536 multiwell plaat met behulp van een vloeibare bulk dispenser, gevolgd door gDNA en PCRTag primers met behulp van de Echo 550. De primers waren identiek gekleed inelk kwadrant van de multiwell plaat voor gemakkelijke visuele vergelijking. De multiwell plaat werd daarna warmte afgedicht met optisch heldere afdichting en onderworpen aan real time PCR-analyse. In dit experiment waargenomen qPCRTag we, grotendeels, amplificatie zoals verwacht, waarbij synthetische primers uitsluitend geamplificeerd synthetisch DNA en vice versa (figuren 2 en 3). Echter, zagen we ook verschillende afwijkingen van het verwachte suggereert valse negatieve en valse positieven in de dataset. In dit experiment werd de master control gedetecteerd in 100% van putjes, waarin de bulk vloeistofuitreiker met succes afgegeven mastermix in elke put op de plaat (data niet getoond). Dit sluit een potentiële bron van valse negatieven. Bovendien zijn sommige chromosoom 3 PCRTags bekend te falen (getoond in figuren S6 en S7 van Annaluru et al. 1), met ten minste 2 SYN en 1 WTprimer paren; waardoor deze putten kunnen worden genegeerd in elk kwadrant. True valse negatieven kunnen voortvloeien uit een gebrek aan overdracht van template gDNA of primers, maar in onze ervaring, gezien de juiste ijking van de Echo 550 alsmede de voorbereiding van gDNA en primers zoals beschreven, is dit een belangrijke bron van fouten niet geweest. Overall in dit experiment valse negatieve prijs was zeer laag voor primers met WT WT matrijs (~ 2%), hoewel iets hoger SYN primers met SYN DNA (~ 8%). Valse positieven, de detectie van signaal in putjes waarin SYN primers worden gemengd met WT gDNA (en vice versa), gevolg kunnen zijn van amplificatie of primer dimeren. Inderdaad, primer dimeren zijn vaak zichtbaar door gelelektroforese (Figuur 1B) en naar redelijkheid bron van fouten. Voor de toepassing van qPCR kan het onderzoek van smelt curven nuttig zijn om te bepalen of verschillende soorten, zoals primer dimeren, kunnen bijdragen aan het signaal. Verder, performing een controle-experiment waarbij primers worden afgeleverd in afwezigheid van matrijs-DNA zou kunnen primers identificeren met een neiging tot dimeriseren. Cross amplificatie kunnen worden gevolgd door gelelektroforese, met name indien teveel PCR-cycli worden uitgevoerd of wanneer de annealing temperatuur te laag. We hebben geprobeerd om het aantal valse positieven te minimaliseren door cross amplificatie door het optimaliseren van beide parameters voor qPCRTag protocol. Tenslotte onderzoekt het kruispunt (Cp) waarden voor elk putje kan helpen bij het ​​identificeren primers die niet geschikt zijn voor real time-gebaseerde detectie (figuur 3, bijvoorbeeld, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). Overall in dit experiment valse positieven laag was voor SYN primers met WT template (~ 5%) en hoger voor WT primers met SYN template (~ 10%). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figuur 2: Plaat warmte kaart weergeven van de aanwezigheid / absence oproep voor een qPCRTag experiment. Vier verschillende types van genoom DNA (kwadranten gescheiden door stevige witte lijnen) werden onderworpen aan PCRTag analyse met behulp van synthetische (SYN) en wild type (WT) chromosoom 3 PCRTag primers (onderbroken witte lijnen om SYN scheiden (top ) en WT (onder) in elk kwadrant). WT en synIXR gDNA coderen wild type chromosoom 3, waardoor amplificatie met WT PCRTag primers. SynIII en synIII synIXR gDNA coderen synthetische chromosoom 3, waardoor amplificatie met SYN PCRTag primers. Primers worden opgesteld op basis van hun links naar rechts chromosomale positionering en gepositioneerd identiek in de vier kwadranten voor de vergelijking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figuur 3: Plaat warmteKaart tonen kruispunt (Cp) waarde voor een qPCRTag experiment. Dit is dezelfde dataset als in figuur 2 en de plaat indeling is daarmee identiek. N / A verwijst naar &#39;nee versterking&#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Ontworpen chromosomen van het Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, kunnen worden onderscheiden van hun natuurlijke tegenhangers met behulp van een PCR-gebaseerde genotyperingstest genaamd PCRTagging, die een aanwezigheid/afwezigheid-endpoint heeft. Hier beschrijven we een high-throughput real-time PCR detectiemethode voor PCRTag genotypering.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Het algemene doel van de QPCR TAG-analyse is om de doorvoersnelheid van de PCR TAG-genotyperingsassay van het synthetische gistgenoomproject te verhogen door de implementatie van een real-time PCR-gebaseerd detectiesysteem en geminiaturiseerde reacties. Dit wordt bereikt door eerst een bulkvloeistofdispenser te gebruiken om de QPCR-mastermix in elke well van een 1536-wells plaat te verdelen. Vervolgens brengt een robot voor akoestische druppeluitstoting op nanoschaal template-DNA en primers over naar de wells van de multi-well plaat.Vervolgens wordt de plaat afgesloten en worden de reacties uitgevoerd in een A-Q-P-C-R thermocycler. Tot slot worden de realtime PCR-gegevens geanalyseerd om de aanwezigheid of afwezigheid van synthetische of wild-type PCR-tags bij elke locus te bepalen. Uiteindelijk verbetert de QPCR-tag-workflow de doorvoersnelheid.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de huidige PCR TAG-assay is dat het ons in staat stelt om het gebruik van gelelektroforese en de handmatige annotatie van die gels te omzeilen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we beseften hoe tijdrovend en arbeidsintensief PCR-tagging op langere chromosomen zou worden. Voeg na het kweken en oogsten van ongeveer 2 miljoen gistcellen 200 µL gistlysebuffer toe en pipetteer om te resuspenderen.Voeg aan de pellet 300 µL zuurgewassen glazen kraaltjes toe tot ongeveer één millimeter onder het niveau van de cel, wazig. Voeg vervolgens in een zuurkast 200 µL fenol-chloroform-isoamylalcohol toe, keer de buis drie keer om om te mengen en controleer of de dop goed gesloten is. Schud de buis vervolgens met een benchtop-mixer 10 minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie wordt 75 µL van de waterige fase overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis met 1 mL 100% ethanol.Keer de buis 10 keer om om te mengen na het opnieuw centrifugeren, aspireer het supernatant zonder de pellet te verplaatsen en gebruik 500 µL 70% ethanol om de pellet te wassen. Na het verwijderen van het supernatant gebruikt u 75 µL 10 mM Tris pH 7.4 om de pellet opnieuw te suspenderen en mengt u dit met een vortex. Na het verdunnen van het DNA 1:10 brengt u aliquots van 30 µL verdund gDNA over in de juiste put van een bronplaat voor nanoscale akoestische vloeistofdosering.Bereid vooraf 850 µL qPCR-mastermix voor in een microcentrifugeebuisje van 1,5 mL en vortex deze om te mengen. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende twee minuten bij 20.800 ×g en kamertemperatuur om eventuele luchtbellen te verwijderen. Doseer vervolgens met een bulkdispenser 500 nL per put in een 1536-wellplaat. Verzamel de QPCR-mastermix onderin elke put door de plaat kortstondig te centrifugeren. Doseer vervolgens, met behulp van het akoestische vloeistofoverdrachtssysteem en volgens de details in het tekstprotocol, 5 nanoliter verdund gDNA en 10 nanoliter 50 micromolair voorgemengde forward- en reverse-primers in de gewenste putten van de multi-wellplaat. Akoestische druppeltechnologie maakt gebruik van geluid om kleine volumes vloeistof verticaal over te dragen van een bronplaat naar een omgekeerde doelplaat.Hierbij worden de template, het DNA en de primers overgebracht in druppels van veelvouden van 2,5 nanoliter in de putjes van een 1536-multiwellplaat, om de QPCR-tagreacties op te zetten. Gebruik vervolgens een optisch heldere seal en een microplaat-sealsysteem om de 1536-multiwellplaat onmiddellijk af te sluiten.Centrifugeer de verzegelde plaat onmiddellijk bij 2000 G bij kamertemperatuur gedurende drie minuten om alle reagentia op de bodem van de put te verzamelen om het realtime PCR-programma uit te voeren. Gebruik het QPCR-instrument volgens de richtlijnen in het tekstprotocol en druk op 'start' zodra dit voltooid is. Verifieer of alle putten de mastercontrole hebben doorstaan, wat aangeeft dat de QPCR-mastermix in de put is gedetecteerd. Elke put die hiervan niet voldoet, vertegenwoordigt een potentieel fout-negatief datapunt.Om de gegevens te analyseren, inspecteert u deze visueel binnen de QPCR-software en/of exporteert u de gegevens voor offline verwerking buiten het instrument. In dit experiment werden PCR-tag-primerparen voor het wildtype en het synthetische chromosoom drie getest met gist-gDNA dat was geëxtraheerd uit vier verschillende stammen: twee met het wildtype chromosoom drie en twee die een synthetisch chromosoom coderen.Drie verwachte synthetische primers amplificeerden over het algemeen synthetisch DNA en geen wildtype-DNA. Op dezelfde manier produceerden wildtype-primers amplicons uitsluitend uit wildtype-DNA. Het voorkomen van een klein aantal fout-positieven en fout-negatieven is te verwachten, en mogelijke bronnen van deze fouten worden beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze van begin tot eind in ongeveer een uur worden voltooid. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

qpcrtag-analysis-high-throughput-real-time-pcr-assay-for-sc20

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

In this video, we describe a high-resolution melting PCR technique to determine the length polymorphism of DNA fragments of varying sequence lengths, based on melting temperature analysis.

High-Resolution Melting PCR to Determine Sequence Variations in Mutant DNA Sequences

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

Hier beschrijven we een methode voor de gelijktijdige kwantificering van T-cel receptor excisie cirkels (TRECs) en K-deletrerende recombinatie excisie cirkels (KRECs). De TREC/KREC test kan worden gebruikt als marker voor de output van de thymus en het beenmerg.

Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

Digitale polymerase-kettingreactie (PCR) is een nuttig hulpmiddel voor het opsporen van hoog-gevoeligheid van één nucleotide varianten en DNA kopie nummer varianten. Hier tonen we belangrijke overwegingen voor het meten van zeldzame varianten in het menselijk genoom digitale PCR met de chip-in-a-tube-indeling.

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

Dit artikeldetails het gebruik van een verankerde multiplex polymerase keten reactie gebaseerde bibliotheek Voorbereidingspakket gevolgd door de volgende generatie sequencing om te beoordelen voor oncogene gen fusies in klinische solide tumormonsters. Zowel de natte bank als de gegevensanalyse stappen worden beschreven.

Oncogene Genfusie detectie met behulp van verankerde multiplex polymerase kettingreactie gevolgd door sequenties van de volgende generatie

Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Dit protocol biedt een methode voor het meten van crossover-frequenties en -verdeling tijdens meiose in Caenorhabditis elegans. Genotypering van single-nucleotide polymorfisme met real-time PCR werd gebruikt om de oorsprong van de chromosomen te bepalen. De 4-punts mapping maakte het mogelijk om de crossover-verdelingen van de linkerarm-, midden- en rechterarmregio's van elk chromosoom te bepalen. ...

Frequentie en distributie van cross-overs in Caenorhabditis elegans Meiose door SNP-genotypering met behulp van real-time PCR

Leer een high-throughput real-time PCR-methode voor PCRTag-genotypering in gist zonder gelelektroforese. Deze techniek verbetert de doorvoer van het synthetische gistgenoomproject aanzienlijk.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Meer video's verkennen