Microkraal Implantatie in de zebravis embryo
30 juli 2015
De zebravis is een uitstekend modelsysteem voor genetische en ontwikkelingsstudies. Het implanteren van kralen is een waardevolle techniek voor weefselmanipulatie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsmechanismen te onderzoeken door veranderingen in lokale cellulaire omgevingen te introduceren. Dit protocol beschrijft hoe microkralenimplantatie in de zebravis-embryo moet worden uitgevoerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is om microbead-implantatie te gebruiken om wijzigingen aan te brengen in de lokale weefselomgeving op specifieke ruimtelijke en temporele punten tijdens de embryogenese van de zebravis. Dit wordt bereikt door eerst een tray voor bead-implantatie voor te bereiden om de nauwkeurige hantering en implantatie van de microbeads te vergemakkelijken. Als tweede stap worden de zebravis-eieren geïncubeerd tot het gewenste ontwikkelingsstadium.
De microbeads worden vervolgens klaargemaakt in de juiste experimentele oplossingen en zorgvuldig overgebracht naar de gewenste locatie in het embryo. Uiteindelijk kan de implantatie van microbeads worden uitgevoerd zonder de normale ontwikkeling van de zebravis te verstoren, waardoor de effecten van de betreffende moleculen op de embryogenese van de zebravis kunnen worden beoordeeld. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals de vraag hoe verschillende moleculen het proces van organogenese beïnvloeden.
Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode enige moeite hebben, aangezien het oefening vereist om vaardig te worden in het hanteren van de microbeads. Om de tray voor de implantatie van microbeads voor te bereiden, wordt vers bereide 2% aro-oplossing eerst gedurende 90 seconden verhit. Gebruik hiervoor een erlenmeyer van 250 milliliter en zwenk de kolf elke 30 seconden om te voorkomen dat de gel overkookt.
Plaats vervolgens het deksel van een Petri-schaal van 60 bij 15 millimeter in een schaal van 150 bij 15 millimeter, waarbij de binnenkant van het deksel naar boven is gericht. Veranker vervolgens het deksel van de kleinere Petri-schaal met een wijsvinger. Giet de warme agar-gel in de grotere schaal.
Laat een dunne laag agros vormen onder het kleinere deksel om condensvorming te voorkomen en om de kralen beter zichtbaar te maken onder de microscoop terwijl de agros afkoelt. Voordat deze stolt, moet er voorzichtig onder een hoek een well-mal in de bovenkant van de gel worden geplaatst om het eenvoudiger plaatsen van de embryo's mogelijk te maken. Wanneer de gel is gestold, gebruikt u een microspatel om de well-mal voorzichtig te verwijderen.
Voeg vervolgens E drie-oplossing toe aan de schaal en bewaar deze bij vier graden Celsius. Om de zebravisembryo's te oogsten, vult u een paringskamer met systeemwater. Plaats vervolgens een scheidingswand in het midden van de kamer en voeg volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravissen toe aan de overeenkomstige zijden van de kamer.
Gebruik de volgende ochtend een fijne zeef met metaalgaas om de bevruchte eitjes op te vangen. Keer de zeef om in een schone Petri-schaal van 10 centimeter en spoel het gaas schoon met een fijne straal E three totdat er geen eitjes meer in de zeef achterblijven en er ongeveer 25 milliliters E three-oplossing in de schaal zit. Verdeel de eitjes vervolgens over verschillende schalen met 50 tot 60 eitjes per schaal om overbevolking te voorkomen en incubeer de eitjes in E three-oplossing bij 28,5 °C. Incubeer ze vervolgens, vóór het implanteren van de microbeads, gedurende de juiste periode in het passende volume van het testmiddel, het betreffende molecuul of het controlemiddel.
Wanneer de embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt, worden de koppen met een fijne pincet verwijderd en worden de zebravissen gedurende 10 minuten geïncubeerd in gefilterde Ringer-oplossing, aangevuld met antibiotica, terwijl de embryo's acclimatiseren. Breng de microbeads over naar de eerder voorbereide microbead-plaat, geplaatst in de implantatiebak, en spoel de beads en de Ringer-oplossing gedurende 10 minuten.
Arrandeer binnen 50 minuten na het wassen van de kraaltjes één embryo per keer in de put van de implantatieschaal, zodat het gebied voor de implantatie van de microbeads toegankelijk is. Maak met een wolfraamnaald een kleine incisie in het embryo, druk vervolgens op de bulb van een microcapillaire transferpipet om voorzichtig een microbead in de capillaire kolom te trekken, en laat de druk los om de microbead in de implantatieschaal af te leveren, zodat de microbead gemakkelijker te hanteren is. Duw de kraal voorzichtig aan om deze in de Ringer-oplossing in de mal te laten zinken.
Verplaats vervolgens met de micronaal het microbead naar het embryo en in de incisie. Gebruik tot slot het whisker-instrument om het microbead weg te bewegen van de incisieplaats, zodat het bead niet wordt uitgestoten tijdens de genezing. Het succes van de implantatie van het microbead kan vervolgens onmiddellijk via de stereomicroscoop worden beoordeeld, aangezien het bead stabiel gepositioneerd in het weefsel zal blijven.
In dit experiment werden individuele microbeads van twee verschillende formaten, uitsluitend gespoeld met ringer-oplossing, geïmplanteerd in zebravissenembryo's in het staartknopstadium, of op latere tijdstippen tijdens de myogenese om er zeker van te zijn dat de locatie van de bead gedurende het experiment niet is verschoven door endogene weefselmorfogenese. De embryo-monsters kunnen worden gevisualiseerd via time-lapsefotografie of op periodieke intervallen worden gecontroleerd, zoals de afbeeldingen van de microbead-implantatie aantonen. In afwezigheid van enige conjugatie kunnen kleine moleculen worden toegepast zonder grove morfologische effecten tijdens de normale ontwikkeling van het zebravissenembryo.
Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals Whole Mount In Situ Hybridization, worden uitgevoerd om te bestuderen hoe de microbead de genexpressie beïnvloedt. Over het algemeen is het begrijpen van de positie van de bead in de loop van de tijd cruciaal voor de interpretatie van de resultaten, zoals bij het evalueren van de effecten van een klein molecuul op een doelweefsel of een ontwikkelingsproces.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de implantatie van microbeads in zebravisembryo's, een techniek die nuttig is voor het bestuderen van de ontwikkelingsbiologie. De methode stelt onderzoekers in staat om de lokale weefselomgeving te manipuleren zonder de normale ontwikkeling te verstoren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
- Embryologie
Achtergrond
- Zebravisjes zijn een waardevol modelorganisme voor genetische studies.
- Implantatie van microbeads kan lokale cellulaire omgevingen veranderen.
- Deze techniek helpt bij het begrijpen van ontwikkelingsmechanismen.
- Het maakt de beoordeling van moleculaire effecten op de organogenese mogelijk.
Doel van de studie
- Om wijzigingen in de weefselomgeving tijdens de embryogenese van zebrafish te introduceren.
- Om de impact van specifieke moleculen op ontwikkelingsprocessen te evalueren.
- Om de techniek voor de implantatie van microbeads te verfijnen voor betere experimentele resultaten.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een tray voor de implantatie van microbeads.
- Incubatie van zebravissenembryo's tot de gewenste ontwikkelingsfase.
- Zorgvuldige implantatie van microbeads in embryo's met behulp van een wolfraamnaald.
- Observatie van de stabiliteit van de microbeads en de effecten op de ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle implantatie van microbeads zonder de normale ontwikkeling te verstoren.
- Microbeads bleven stabiel gepositioneerd binnen het weefsel.
- Visuele beoordeling van de embryo's toonde geen grove morfologische effecten aan.
- Potentieel voor verdere studies naar genexpressie en ontwikkelingsprocessen.
Conclusies
- Implantatie van microbeads is een levensvatbare methode voor het bestuderen van de ontwikkelingsbiologie.
- Inzicht in de positionering van de beads is essentieel voor de interpretatie van de experimentele resultaten.
- Deze techniek kan onderzoek naar de effecten van diverse moleculen op de ontwikkeling faciliteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Implantatie van microbeads in zebravisembryo's maakt nauwkeurige spatiotemporele manipulatie van signaleringsmoleculen mogelijk om ontwikkelingspaden te onderzoeken. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door functionele beoordeling van moleculaire effecten op organogenese mogelijk te maken zonder grove morfologische verstoring. De methode biedt een ziekterelevante systematiek voor mechanistische de-risking in vroege discovery-fasen, in het bijzonder voor paden die geconserveerd zijn tussen zebravis en mensen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door lokale weefselomgevingen te wijzigen met uitgescheiden peptiden of signaalmoleculen van belang.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van de stabiliteit van de beads en fenotypische effecten met behulp van stereomicroscopie.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de beoordeling van de moleculaire impact op ontwikkelingsprocessen, wat bijdraagt aan het vertrouwen in targets en de triage van de portfolio.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-analyse, zoals whole mount in situ hybridisatie om veranderingen in genexpressie te bestuderen.
- Kwantitatieve output: Maakt visualisatie van de positie van de kraaltjes in de loop van de tijd mogelijk, waardoor moleculaire blootstelling kan worden gecorreleerd met ontwikkelingsresultaten.
- Schaalbaarheid: Embryo's kunnen worden geïncubeerd in multi-well formaten en worden blootgesteld aan testmoleculen voorafgaand aan implantatie, wat screening met een medium doorvoersnelheid ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Maakt gebruik van de hoge genomische conservering tussen zebravis en mensen om vertebrale ontwikkelingsprocessen te modelleren.
- Translationele continuïteit: Verbindt pathway-modulatie in de ontdekkingsfase met fenotypische uitkomsten die relevant zijn voor congenitale aandoeningen of regeneratieve geneeskunde.
- Mechanische risicoreductie: Maakt evaluatie mogelijk of geobserveerde effecten te wijten zijn aan specifieke moleculaire activiteit in plaats van aan ontwikkelingstoxiciteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via fenotypische screening tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor pathways die morfogenese en organogenese reguleren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen door lokale afgifte van moleculen in specifieke embryonale regio's mogelijk te maken op gedefinieerde stadia.
- Screening: Beschrijft de preparatie van embryo's in oplossingen met testmoleculen voorafgaand aan de implantatie, wat beoordeling van de blootstelling aan verbindingen mogelijk maakt.
- Analytiek: Maakt gebruik van stereomicroscopie en time-lapse imaging om de positie van de kraaltjes en de ontwikkelingsprogressie als belangrijkste read-outs te volgen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire perturbatie in embryo's met downstream genexpressie-analyse, ter ondersteuning van pathway-validatie op basis van biomarkers.
- Bedrijfsmatige hergebruik: De implantatieschaal en microsurgische instrumenten kunnen worden gestandaardiseerd over projecten die verschillende morfogenen of genetische achtergronden bestuderen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt mechanisch inzicht in padmodulatie door nauwkeurige ruimtelijke en temporele controle over de moleculaire presentatie mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde protocollen voor de voorbereiding van trays en de hantering van beads verbeteren de reproduceerbaarheid tussen gebruikers en laboratoria.
- Strategische waarde: Vermindert ambiguïteit bij doelwitvalidatie door moleculaire effecten te ontkoppelen van systemische toxiciteit of ontwikkelingsvertraging.
- Impact op portfolio: Maakt vroege go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de vraag of een molecuul een relevant pad perturbeert in een vertebratencontext.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie en zebravisembryologie om embryo's te hanteren en kralen te implanteren zonder dodelijke schade te veroorzaken.
- Afhankelijk van instrumentarium, waaronder wolfraamnaalden, microcapillaire pipetten en stereomicroscopen voor nauwkeurige manipulatie van de kralen.
- Vereist standaardisatie van de embryonale stadia, kraalgrootte en oplossingscondities om vergelijkbaarheid tussen experimenten te garanderen.
- Aanpassing naar andere modelsystemen kan beperkt worden door de optische toegankelijkheid en de externe ontwikkeling die uniek zijn voor zebravisembryo's.
- Praktische beperkingen omvatten de leercurve voor het hanteren van de kralen en de noodzaak om te valideren dat geïmplanteerde moleculen bioactief en gelokaliseerd blijven.
